JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, bağırsak bariyer fonksiyonunu, geçirgenliğini ve taşınmasını incelemek için insan organoid türevi bağırsak epitel monokatmanlarının hazırlanmasını açıklıyoruz. Organoidler dış uyaranlara karşı orijinal epitel dokusu yanıtını temsil ettiğinden, bu modeller hücre hatlarının genişletilebilirliğinin avantajlarını ve birincil dokunun alaka düzeyini ve karmaşıklığını birleştirir.

Özet

Geçmişte, intestinal epitel model sistemleri transforme hücre hatları ve primer doku ile sınırlıydı. Bu model sistemler, birincisi orijinal doku fizyolojisini sadık bir şekilde temsil etmediğinden ve ikincisinin mevcudiyeti sınırlı olduğundan, doğal sınırlamalara sahiptir. Bu nedenle, uygulamaları temel ve ilaç geliştirme araştırmalarını engellemektedir. Yetişkin kök hücre bazlı organoidler (bundan böyle organoidler olarak anılacaktır), türetildikleri normal veya hastalıklı epitel dokusunun minyatürleridir. Farklı gastrointestinal (GI) sistem bölgelerinden çok verimli bir şekilde kurulabilirler, uzun süreli genişletilebilirliğe sahiptirler ve in vitro tedavilere doku ve hastaya özgü yanıtları simüle ederler. Burada, intestinal organoid kaynaklı epitel monokatmanlarının oluşumu, epitel bariyer bütünlüğünü, geçirgenliği ve transportunu, antimikrobiyal protein sekresyonunu ve histolojiyi ölçme yöntemleri ile birlikte gösterilmiştir. Ayrıca, bağırsak organoidinden türetilmiş tek katmanlar, çoğalan kök ve transit yükseltici hücrelerin yanı sıra anahtar farklılaşmış epitel hücreleri ile zenginleştirilebilir. Bu nedenle, bileşiklerin hedef hücreler üzerindeki etkilerini ve etki biçimlerini incelemek için uyarlanabilecek bir model sistemi temsil ederler. Organoid kültürler teknik olarak hücre hatlarından daha zorlu olsalar da, bir kez kurulduktan sonra, in vivo epitel karmaşıklığını ve hastalar arası heterojenliği gerçekten temsil ettikleri için ilaç geliştirmenin sonraki aşamalarındaki başarısızlıkları azaltabilirler.

Giriş

Bağırsak epiteli, bağırsakların luminal içeriği ile altta yatan doku arasında fiziksel bir bariyer görevi görür. Bu bariyer, bitişik hücreler arasında güçlü hücreler arası bağlantılar kuran sıkı kavşaklarla bağlanan esas olarak emici enterositlerin tek bir epitel tabakasını içerir. Bu hücreler, bağırsağın apikal (lümen) ve bazolateral taraflarını ayıran polarize bir epitel astarı oluştururken, aynı zamanda sindirilmiş besinlerin ve metabolitlerin parasellüler taşınmasını düzenler. Enterositlere ek olarak, kadeh, paneth ve enteroendokrin hücreler gibi diğer önemli epitel hücreleri de sırasıyla mukus, antimikrobiyal peptitler ve hormonlar üreterek bağırsak homeostazına katkıda bulunur. Bağırsak epiteli, lösin bakımından zengin tekrar içeren G-proteini eşleşmiş reseptör 5-pozitif (LGR5 +) kök hücrelerinin, yukarı doğru göç eden ve diğer hücre tiplerine farklılaşan geçiş-yükseltici (TA) hücreler üreten bağırsak kriptlerinin dibinde bölünmesiyle sürekli olarak yenilenir1. İntestinal epitel homeostazının gıda alerjenlerine, tıbbi bileşiklere ve mikrobiyal patojenlere maruz kalma gibi genetik ve çevresel faktörlerle bozulması, bağırsak bariyer fonksiyonunun bozulmasına yol açar. Bu koşullar, inflamatuar bağırsak hastalığı (IBD), çölyak hastalığı ve ilaca bağlı GI toksisitesi 2 dahil olmak üzere çeşitli bağırsak hastalıklarına nedenolur.

Bağırsak epiteli ile ilgili çalışmalar, membran ekleri, çip üzerindeki organlar, Ussing odaları ve bağırsak halkaları gibi çeşitli in vitro platform sistemleri kullanılarak gerçekleştirilir. Bu platformlar, membranın hem apikal hem de bazolateral taraflarına erişimi olan, dönüştürülmüş hücre hatlarını veya birincil dokuyu model olarak kullanan polarize epitel monokatmanları oluşturmak için uygundur. Kolorektal (adeno) karsinom hücre hatları Caco-2, T84 ve HT-29 gibi dönüştürülmüş hücre hatları, polarize bağırsak enterositlerine veya mukus üreten hücrelere bir dereceye kadar farklılaşabilse de, birkaç hücre tipi eksik olduğundan ve çeşitli reseptörler ve taşıyıcılar anormal bir şekilde ifade edildiğinden in vivo epiteli temsil etmezler3 . Ek olarak, hücre hatları tek bir donörden türetildiğinden, hastalar arası heterojenliği temsil etmezler ve karmaşıklığın ve fizyolojik ilginin azalmasından muzdariptirler. Ussing odalarında ve bağırsak halkaları olarak kullanılan birincil dokular in vivo durumu daha iyi temsil etse de, sınırlı kullanılabilirlikleri, kısa süreli canlılıkları ve genişletilebilirlik eksikliği, onları yüksek verimli (HT) çalışmalar için bir ortam olarak uygun hale getirmemektedir.

Organoidler bağırsak, böbrek, karaciğer, pankreas ve akciğer gibi farklı organlardan kurulan in vitro epitel kültürleridir. Uzun vadeli, stabil genişleyen ve genetik ve fenotipik stabiliteye sahip oldukları kanıtlanmıştır ve bu nedenle orijinal organın epitelinin temsili biyolojik minyatürleridir ve dış uyaranlara sadık tepkiler verirler 4,5,6,7,8,9. Organoidler, heterojen hastaya özgü yanıtları temsil eden normal, hastalıklı, iltihaplı veya kanserli dokudan rezeke edilmiş veya biyopsi yapılmış 10,11,12,13,14,15,16 etkili bir şekilde kurulur. Bu yazıda organoid kültürlerden türetilen intestinal epitel monokatmanlarının nasıl oluşturulacağı gösterilmektedir. Tek katmanlı maddeler ince bağırsakların yanı sıra kolonik ve rektal organoid kültürlerden de başarıyla kurulmuştur. Bu model, epitel hücrelerinin ilaçlara taşınmasını ve geçirgenliğini ve epitel üzerindeki toksikolojik etkilerini incelemek için bir fırsat yaratır. Dahası, model, bağışıklık hücreleri ve bakterilerle birlikte kültürün bağırsak epiteli ile etkileşimlerini incelemesine izin verir17,18,19. Ayrıca, bu model tedavilere verilen yanıtları hastaya özgü bir şekilde incelemek ve epitel bariyer odaklı terapötiklerin bir sonraki dalgasını aramak için tarama çabalarını başlatmak için kullanılabilir. Böyle bir yaklaşım kliniğe genişletilebilir ve kişiselleştirilmiş tedavilere giden yolu açabilir.

Bu protokoldeki epitel monokatmanları insan normal bağırsak organoidlerinden hazırlanmış olsa da, protokol diğer organoid modeller için uygulanabilir ve optimize edilebilir. Epitelyal organoid monokatmanlar, kök hücre proliferasyonunu desteklemek ve bağırsak kript hücresel kompozisyonunu temsil etmek için Wnt içeren intestinal organoid genişleme ortamında kültürlenir. Bağırsak organoidleri, Wnt, Notch ve epidermal büyüme faktörü (EGF) yollarını modüle ederek enterositler, Paneth, kadeh ve enteroendokrin hücreler gibi farklı bağırsak epitel kaderlerine sahip olacak şekilde zenginleştirilebilir. Burada, genleşme ortamında tek katmanların kurulmasından sonra, daha önce tarif edildiği gibi daha farklılaşmış bağırsak epitel hücrelerine doğru yönlendirilirler20,21,22,23,24,25. Tarama amacıyla, ilgilenilen bileşiğin etki şekline, hedef hücrelerine ve deneysel koşullara bağlı olarak, tek katmanlar, bileşiğin etkilerini ilgili fonksiyonel okumalarla ölçmek için tercih edilen hücresel bileşime doğru yönlendirilebilir.

Protokol

1. Kültür için reaktiflerin hazırlanması

NOT: Bir biyogüvenlik kabini içindeki tüm adımları uygulayın ve hücre kültürleriyle çalışmak için standart yönergeleri izleyin. Ultraviyole ışık, biyogüvenlik kabinini çalıştırmadan önce 10 dakika boyunca kullanılır. Kullanım öncesi ve sonrasında, biyogüvenlik kabininin yüzeyi% 70 etanol içine batırılmış bir kağıt mendil ile temizlenir. Üç boyutlu hücre dışı matris (ECM) damlalarının oluşumunu kolaylaştırmak için, inkübatörde 37 ° C'de önceden ısıtılmış 96, 24 ve 6 delikli plakaların hazır bir stoğunu saklayın.

  1. Bazal ortam hazırlığı
    1. 5 mL 200 mM glutamin, 5 mL 1 M 4-(2-hidrokyethil)-1piperazineethanesülfonik asit (HEPES) ve 5 mL penisilin/streptomisin (kalem/strep) çözeltisi (10.000 U/mL veya 10.000 μg/mL) ekleyerek Ham'ın Besin Karışımı F-12 (Ad-DF) orta şişeli 500 mL Advanced Dulbecco'nun Modifiye Kartal Medium'unda bazal ortam (BM) hazırlayın. Bu, buzdolabında 4 ° C'de en az 4 hafta saklanabilir.
  2. Wnt kaynakları
    1. Wnt3a şartlandırılmış ortamı (Wnt3aCM) daha önce açıklanan yöntem26'ya göre hazırlayın.
      NOT: Son zamanlarda, insan bağırsak organoidlerinin genişlemesini de destekleyen yeni nesil bir vekil Wnt (NGS-Wnt) üretildi27.
  3. Bağırsak organoid baz orta preparatı
    NOT: Tüm büyüme faktörlerini ve reaktifleri üreticinin tavsiyelerine göre kullanın. Küçük alikotlar kullanın ve donma-çözülme döngülerinden kaçının; fonksiyonel büyüme faktörleri başarılı organoid kültür için gereklidir.
    1. BM'yi 1 μM A83-01, 2.5 mM N-asetilsistein, 2x B27 takviyesi, 100 ng / mL insan epidermal büyüme faktörü (hEGF), 10 nM gastrin, 200 ng / mL hNoggin ve 100 μg / mL birincil hücreler için bir antimikrobiyal formülasyon ile destekleyerek konsantre 2x bağırsak organoid baz ortamı (2x IBM) hazırlayın (bkz.
    2. 2x IBM'i havalandırın ve -20 °C'de 4 aya kadar dondurun. Gerektiğinde, bir aliquot'u gece boyunca 4 ° C'de veya oda sıcaklığında (RT) birkaç saat boyunca eritin.
    3. Bağırsak organoid genleşme ortamı (IEM) hazırlamak için, 2x IBM'i %50 Wnt3aCM veya %50 BM ve 0,5 nM NGS-Wnt, 250 ng/mL insan Rspondin-3 (hRspo3), 10 mM nikotinamid ve 10 μM SB202190 ile tamamlayın.
  4. Bağırsak organoid farklılaşma ortamı hazırlığı
    1. 2x IBM'i %50 BM, 250 ng/mL hRspo3 ve 1.5 μM Wnt yol inhibitörü (IWP-2) ile destekleyerek enterosit farklılaşma ortamı (eDM) hazırlayın. eDM'yi 4 °C'de 10 güne kadar saklayın.
    2. 2x IBM'i %40 BM ve %10 Wnt3aCM veya %50 BM ve 0,1 nM NGS-Wnt, 250 ng/mL hRspo3, 10 μM DAPT ve 100 nM PD0325901 ile destekleyerek kombinasyon farklılaştırma ortamı (cDM) hazırlayın. cDM'yi 4 °C'de 10 güne kadar saklayın.
  5. Hücre dışı matriksin (ECM) manipülasyonu
    NOT: Hücre dışı matrisi (ECM) üreticinin tavsiyesine göre hazırlayın ( Malzeme Tablosuna bakın).
    1. ECM'yi bir gecede buz üzerinde çözün; ECM'yi, her ikisi de -20 °C'de önceden soğutulmuş 5 mL'lik bir pipet kullanarak şişeden 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın. Alikotları -20 ° C'de sadece bir kez yeniden dondurun. Çözüldükten sonra, ECM'yi buzdolabında 4 ° C'de 7 güne kadar saklayın. Kullanmadan önce buz üzerinde en az 30 dakika inkübe edin.
      NOT: ECM'yi düzgün bir şekilde karıştırın ve kriptleri veya organoidleri gömmeden önce soğuk olduğundan emin olun.

2. Organoid kültürler

  1. Dondurulmuş organoidlerden kültürlerin oluşturulması
    NOT: BM'nin RT'ye ulaşmasına izin verin ve dondurulmuş organoidler içeren bir kriyovyalin çözülme prosedürüne başlamadan önce 37 ° C'ye ısıtılmış 12 mL'lik bir aliquot'u hazır tutun.
    1. Organoid kriyovial, sadece bir parça buz kalana kadar 37 ° C'lik bir su banyosunda çalkalayarak hızla çözün. Hemen kriyovale damla damla 500 μL ılık BM ekleyin ve dondurucu ortamı seyreltmek ve içeriği dikkatlice karıştırmak için birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin.
    2. Bir P1000 pipet kullanarak, organoidleri 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın ve tüpün tabanını hafifçe karıştırırken damla yönünde 1 mL daha sıcak BM ekleyin. Dondurucu ortamı seyreltmek ve içeriği dikkatlice karıştırmak için birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin.
    3. Organoidleri içeren 15 mL'lik konik tüpe damla damla 12 mL'ye kadar sıcak BM ekleyin ve organoidleri nazikçe askıya almak için 10 mL'lik steril pipetle yukarı ve aşağı pipetleyin.
    4. Organoid süspansiyonu 85 × g ve 8 °C'de 5 dakika santrifüj yapın. Peleti rahatsız etmeden süpernatantı dikkatlice atın ve organoidleri, 10 μM Y27632 veya diğer rho ile ilişkili sarmal bobin oluşturan protein serin / treonin kinaz inhibitörü (ROCK inhibitörü) ile desteklenmiş IEM'nin% 30 v / v'sinde yeniden askıya alın. Tüpü buzun üzerine yerleştirin.
    5. Organoidleri içeren 15 mL konik tüpe %70 v/v ECM ekleyin. 15 mL konik tüpü buz üzerinde tutan organoid süspansiyonu karıştırın ve yoğunluğu kontrol etmek için süspansiyonun 5 μL'sini tohumlayın (Şekil 1A). Yoğunluk uygunsa kaplamaya devam edin; yoğunluk çok yüksekse, sırasıyla% 30-70 v / v oranında daha fazla IEM / ECM çözeltisi ekleyin.
    6. Önceden ısıtılmış 24 delikli bir plakanın her bir kuyucuğunda, 10 μL'lik 5 ayrı damla pipetleme yaparak organoid süspansiyonun 50 μL'sini tohumlayın (Şekil 1B). Plakayı baş aşağı çevirin ve 5 dakika boyunca biyogüvenlik kabininde bırakın. Plakayı hala baş aşağı 37 ° C inkübatöre aktarın ve 30 dakika daha bekletin.
    7. Her bir kuyucuğa 10 μM ROCK inhibitörü ile 500 μL IEM ekleyin ve plakayı inkübatöre aktarın. Büyümeyi izlemek için düzenli olarak bir damla görüntü oluşturun ve eski ortamı aspire ederek ve 500 μL taze IEM ekleyerek IEM'yi her 2-3 günde bir yenileyin.
    8. Organoidleri, çözülmeden düzgün bir şekilde iyileştikten ve işlenecek doğru boyuta ulaştıktan sonra (Şekil 1C), bölüm 2.2'de açıklandığı gibi geçirin.
  2. Bağırsak organoidlerinin pasajı
    NOT: ECM'yi buz üzerinde en az 30 dakika soğutun ve kullanmadan önce IEM'yi RT'de en az 1 saat tutun.
    1. 1250 μL düşük tutma filtre ucu kullanarak organoid kubbeleri parçalamak için ortamı bir kültür kuyusundan kullanın ve kuyu içeriğini etiketli 15 mL konik bir tüpe aktarın. Kuyuyu 1 mL BM ile yıkayın ve aynı 15 mL konik tüpe aktarın.
    2. 2.2.1 ve 2.2.2 adımlarını diğer tüm kuyucuklarla tekrarlayın (maksimum yarım plaka veya 600 μL ECM damlası yıkanabilir ve bir 15 mL konik tüpe eklenebilir).
    3. Tüpü 12 mL'ye kadar doldurmak için BM ekleyin ve 10 mL'lik pipet kullanarak 10 kat yukarı ve aşağı pipet çekin. 85 °C'de 5 dakika boyunca 85 × g'da santrifüj.
    4. BM'yi çıkarmadan önce, tüm organoidlerin 15 mL konik tüpün dibinde pelet edilip edilmediğini görmek için mikroskop altında kontrol edin (Şekil 1D). Organoid peletin üzerine binen ECM yoksa veya ECM tabakası temizse veya peletlenmiş organoidlere kıyasla sadece enkaz, tek hücre veya çok az organoid içeriyorsa, süpernatantı aspire edin ve bir P200 pipeti kullanarak organoid peletin üzerine çok dikkatli bir şekilde yerleştiren ECM'yi pipetleyin.
      NOT: Organoidler ECM'de sıkışabilir ve düşük santrifüj kuvveti nedeniyle kompakt bir pelet olarak tortu yapmazlar. ECM organoidler içeriyorsa, tüpü 8 ° C'de 5 dakika boyunca 450 × g'da tekrar santrifüj edin ve süpernatantı 2.2.4'te açıklandığı gibi dikkatlice çıkarın. Birden fazla 15 mL konik tüp varsa, adım 2.2.4'ten sonra havuza alınabilirler.
    5. Her pelete 1 mL BM ekleyin (organoid kültür ve yoğunluğa bağlı olarak 50-200 μL hacimde) ve dikkatlice geri koyun. Organoidleri kesmek için en az 5 kat yukarı ve aşağı pipetleyin, köpük oluşumunu önleyin. Organoidlerin bozulup bozulmadığını görmek için mikroskop altında kontrol edin (Şekil 2A). Organoidler bozulursa, adım 2.2.7'ye geçin; organoidler bozulmamışsa, 5x daha pipetleyin. Bu kez, organoidleri bozmak için daha fazla mekanik kuvvet uygulamak için plastik tüpün duvarına pipet ucuyla dokunun.
      NOT: Kistik (Şekil 1C) ve tomurcuklanan (Şekil 1E) organoidlerin mekanik olarak kesilmesi, organoidlerin bozulması için gereken hacme bağlı olarak, düşük retansiyonlu 1250 μL filtre ucu (Şekil 1F) üzerine takılı 200 μL veya 10 μL plastik pipet ucu ile mümkündür. Daralmış bir cam pipetin kullanılması (Şekil 1F), organoidleri içeren 200 μL'den fazla ECM işlendiğinde önerilir (6 delikli bir plakanın bir kuyucuğu veya 24 delikli bir plakanın 4 deliği).
    6. Organoidlerin bozulup bozulmadığını görmek için mikroskop altında tekrar kontrol edin. Kesintiye uğrarsanız, bir sonraki adıma geçin; değilse, organoidleri 20x'e kadar pipetleyin, organoidleri mikroskop altında düzenli olarak kontrol edin. Organoidler hala bozulmamışsa, süspansiyona% 25 v / v hücre ayrışma reaktifi 1 ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin, 2 dakika boyunca 37 ° C'de su banyosunda inkübe edin ve organoidleri 20x'e kadar pipetleyin, organoidleri mikroskop altında düzenli olarak kontrol ederek tek hücrelere sindirilmediklerinden emin olun.
    7. 15 mL'lik konik tüpe 12 mL'ye kadar BM ekleyin ve organoid peleti yukarı ve aşağı pipetleyerek yıkayın. 85 °C'de 5 dakika boyunca 85 × g'da santrifüj. Süper natantı atın ve organoid peletine IEM ve ECM ekleyerek son konsantrasyonu% 70 v / v ECM'ye ayarlayın.
    8. Organoid peleti, geçiş için toplanan IEM / ECM hacminin iki katı ile yeniden askıya almaya başlayın ve yoğunluğu kontrol etmek için süspansiyonun 5 μL'sini tohumlayın. Yoğunluk uygunsa kaplamaya devam edin (Şekil 2B); yoğunluk çok yüksekse daha fazla IEM/ECM çözümü ekleyin. Önceden ısıtılmış 6 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna süspansiyonun 200 μL'sini ekleyin ve 10 μL hacimli ayrı damlalar yapın.
    9. Plakayı baş aşağı çevirin ve 5 dakika boyunca biyogüvenlik kabininde bırakın. Plakayı hala baş aşağı 37 ° C inkübatöre aktarın ve 30 dakika daha bırakın. Her bir kuyucuğa 10 μM ROCK inhibitörü ile 2 mL IEM ekleyin ve plakayı inkübatöre aktarın.
    10. Büyümeyi izlemek için düzenli olarak bir damla görüntü oluşturun ve eski ortamı aspire ederek ve 2 mL taze IEM ekleyerek IEM'yi her 2-3 günde bir yenileyin.
  3. Epitelyal tek katmanlı preparat için bağırsak organoidlerinin pasajı
    1. Tek katmanlı hazırlık için hasattan 3 gün önce pasaj organoidleri, bir istisna dışında bölüm 2.2'de açıklanan aynı pasaj protokolünü izleyerek. Adım 2.2.7'de, organoidleri, tek katmanlı hazırlık için hasat edildiklerinde daha yüksek bir yoğunluğa ve genleşme potansiyeline sahip olmak için IEM / ECM'nin başlangıç hacminin 1-1.5 katında yeniden askıya alın (Şekil 3A).

3. Epitelyal tek katmanlı preparat

  1. Çeşitli mevcut plaka tiplerine sahip hem 24 delikli hem de 96 delikli membran uçlarında kültür epitel monokatmanları (Tablo 1). Her iki boyut için de yüksek verimli sistem (HTS) membran kesici uçları kullanın, çünkü bunlar membran uçları ve bir alıcı plakası içeren entegre bir tepsi içerir. 24 delikli format için, ayrı çıkarılabilir membran uçlarına sahip plakaların kullanılması da mümkündür.
    NOT: Farklı membran tipleri (polietilen tereftalat (PET) veya polikarbonat) ve gözenek boyutları (0.4-8.0 μm) mevcuttur ve deneysel ihtiyaçlara bağlı olarak kullanılabilir. Tek katmanlar yalnızca PET membranlı kesici uçlar kullanıldığında parlak alanla görüntülenebilir. Işık geçirmez membranlar, apikalden bazolateral bölmeye floresan ışık sızıntısını bloke eder ve floresan olarak etiketlenmiş substratların dinamik taşınması veya geçirgenliği incelendiğinde düşünülebilir. Mevcut protokol 24 delikli membran uçları kullanır; 96 delikli membran kesici uçlar için uyarlamalar bölüm 5'te açıklanmıştır. Organoidlerin yoğunluğuna, morfolojisine ve boyutuna bağlı olarak (Şekil 3A), 6 delikli bir plakanın 6 kuyucuğu (bölüm 2.3'te tohumlandığı gibi), tam 24 delikli membran ekleri plakasının tohumlanması için yeterlidir.
  2. Membran kesici uçların ECM ile kaplanması
    NOT: Yeterli hücreye sahip olma konusunda şüpheleriniz varsa, hücreleri saydıktan sonra ekleri kaplayın. Bu, gereksiz kaplamayı ve pahalı membran kesici uçların kaybını önlemek içindir.
    1. Membran eklerini biyogüvenlik kabinindeki destek plakasına yerleştirin. ECM 40x'i buz gibi soğuk Dulbecco'nun fosfat tamponlu salininde (DPBS) Ca 2+ ve Mg2+ ile seyreltin ve seyreltilmiş ECM'nin 150 μL'sini her bir kesici ucun apikal bölmesine pipetleyin. Plakayı en az 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  3. Tohumlama için hücrelerin hazırlanması
    1. Su banyosunda hücre ayrışma reaktifi 2'nin ön sıcak alikotları (37 ° C). 6 delikli bir plakanın her bir kuyucuğu için 2 mL reaktif hazırlayın.
    2. Organoidleri içeren kültür plakasını (bölüm 2.3'te hazırlanan) inkübatörden biyogüvenlik kabinine aktarın. Organoidleri 2.2.1.-2.2.4 adımlarında açıklandığı gibi işleyin. Birden fazla tüpü tek bir tüpte toplamayın.
    3. DPBS ile 12 mL'ye kadar (Ca 2+ve Mg 2+ olmadan) 6 delikli bir plakanın maksimum 3 deliğinden organoidler içeren tüpü doldurun ve 10 mL'lik bir pipet kullanarak 10 kat yukarı ve aşağı pipet çekin. 8 °C'de 5 dakika boyunca 85 × g'da santrifüj yapın ve organoid peleti rahatsız etmeden süpernatantı aspire edin.
    4. Başlangıç malzemesi olarak kullanılan 6 delikli bir plakanın kuyucuğu başına 2 mL önceden ısıtılmış hücre ayrışma reaktifi 2 ekleyin ve yeniden askıya alın. Organoidlerin tüpün dibine batmasını önlemek için tüpleri 37 ° C'deki su banyosunda 5 dakika boyunca çapraz veya yatay olarak inkübe edin.
    5. Pipet, hücre ayrışma reaktifinin toplam hacmine bağlı olarak 5 mL steril plastik pipet veya P1000 pipet kullanarak 10 kat yukarı ve aşağı Pipet. Tek hücrelerin ve 2-4 hücreden oluşan bazı hücre kümelerinin bir karışımının oluşup oluşmadığını görmek için mikroskop altında organoid süspansiyonu kontrol edin (Şekil 3B). Gerekirse, karışım Şekil 3B'ye benzeyene kadar 3.3.4-3.3.5 adımlarını tekrarlayarak (hücre ayrışma reaktifinin hacmini arttırmayın) sindirime devam edin.
      NOT: Organoidleri tamamen tek hücrelere sindirmekten kaçının. Bazı küçük hücre gruplarına (yani 2-4 hücreli gruplara) sahip olmak gerekir.
    6. Hücre süspansiyonuna 10 μM ROCK inhibitörü de dahil olmak üzere 12 mL'ye kadar BM ekleyerek hücre ayrışmasını durdurun. 8 °C'de 5 dakika boyunca 450 × g'da santrifüj yapın ve hücre peletini rahatsız etmeden süpernatantı aspire edin. Aynı organoid kültürü birkaç 15 mL konik tüpte kullanırken, hücre peletlerini bir araya getirin ve 12 mL BM'de yeniden askıya alın.
    7. Hücre süspansiyonunu BM ile önceden ıslatılmış 40 μm'lik bir süzgeçten süzün ve akışı 50 mL'lik konik bir tüpe toplayın. Süzgeci 10 mL BM ile yıkayın ve akışı aynı 50 mL konik tüpe toplayın.
    8. Gergin hücre süspansiyonunu iki yeni 15 mL konik tüpe aktarın. 8 °C'de 5 dakika boyunca 450 × g'da santrifüj yapın ve hücre peletini rahatsız etmeden süpernatantı aspire edin. Başlangıç malzemesi olarak kullanılan tam kültür plakası başına 10 μM ROCK inhibitörü ile desteklenmiş 4 mL IEM'deki hücreleri yeniden askıya alın.
    9. Saymak için az miktarda hücre süspansiyonunu 1: 1 oranında tripan mavisi ile karıştırın. Mavi değil canlı hücreleri sayın (Şekil 3C) ve toplam canlı hücre sayısını hesaplayın. Küçük kümelerde, her bir hücreyi sayın.
    10. 10 μM ROCK inhibitörü ile desteklenmiş IEM'nin mL'si başına 3 × 106 canlı hücre içeren bir hücre süspansiyonu hazırlayın.
  4. Polyester membran uçlarındaki tohumlama hücreleri
    1. Plakayı yatay tutarken ECM kaplı kesici uçlardan DPBS'yi dikkatlice aspire edin (adım 3.2.1). Pipet 800 μL IEM, her bazolateral bölmeye ROCK inhibitörü ile desteklenir. Pipet 150 μL, apikal bölmedeki ECM kaplı membran üzerine damla doğru 3.3.10 adımında hazırlanan hücre süspansiyonunun. Plaka başına, yalnızca BM ile en az bir "boş" kuyu olduğundan emin olun.
    2. Hücreler membran üzerine çökeldikten sonra, bölüm 4.1'de açıklandığı gibi transepitelyal elektrik direncini (TEER) ölçün ve membran eklerini mikroskop kullanarak görüntüleyin. Plakayı inkübatöre 37 ° C'de ve% 5 CO2'ye yerleştirin. TEER'i her gün ölçün ve tek katmanlı oluşumu izlemek için düzenli olarak görüntüler elde edin (Şekil 4A-D).
  5. Ferahlatıcı tek katmanlı
    NOT: Hücrelerin üzerinde pozitif bir hidrostatik basınç sağlamak ve hücrelerin zardan itilmesini önlemek için aşağıdaki sıraya bağlı kalarak ortamı her 2-3 günde bir yenileyin. Ortamı yenilerken, ortamın aspirasyonu üzerine görülebilen tek katmanın pipet ucundan zarar görmediğinden emin olun.
    1. Ortamı, membran eklerini içeren plakanın bazolateral bölmelerinden çıkarın. Daha sonra, ortamı membran eklerinin apikal bölmelerinden dikkatlice aspire edin.
    2. Her apikal bölmeye damla damla 150 μL taze IEM ekleyin ve ardından her bazolateral bölmeye 800 μL taze IEM ekleyin.
  6. İstenilen bağırsak epitel hücre tipleri için tek tabakanın zenginleştirilmesi
    1. Tek katmanın, yaklaşık 100 Ω·cm²'lik bir TEER değerine karşılık gelen IEM'de akıcılaşmasına izin verin (adım 4.1.1.4'te hesaplandığı gibi). Tek katmanların tamamen oluşup oluşmadığını (Şekil 4D) ve deliklerin bulunmadığını ( Şekil 4B, C'de görüldüğü gibi) belirlemek için mikroskop altında kontrol edin.
    2. IEM'yi membran kesici uçlarının bazolateral ve apikal bölmelerinden dikkatlice çıkarın ve bölüm 1.4'te hazırlandığı gibi eDM veya cDM ile değiştirin. Organoid hücrelerin istenen spesifik hücre tipi ile zenginleştirilmesini sağlamak için monokatmanı spesifik farklılaşma ortamında 3-4 gün daha kültürleyin. Bölüm 3.4'te açıklandığı gibi ortamı her 2-3 günde bir yenileyin.
    3. TEER'i günlük olarak ölçün ve istenirse düzenli olarak görüntü elde edin (Şekil 5A-C).
      NOT: Tamamen organize edilmiş zenginleştirilmiş tek katmanlı bir tek katmanı gösteren TEER değeri, organoid kültüre göre değişir; tipik olarak TEER değerleri 600'e yükselir ve diferansiyasyon ortamında 3 gün sonra 1000 Ω ·cm2'ye (adım 4.1.1.4'te hesaplandığı gibi) kadar artabilir ve 3-5 gün boyunca stabildir.

4. Epitelyal tek katmanlı tahlil okumaları

  1. Transepitelyal elektrik direncinin (TEER) ölçülmesi
    NOT: TEER ölçümleri, epitel monokatmanları28,29 gibi fizyolojik bariyerlerin biyolojik modellerinde sıkı bağlantı dinamiklerini ve bariyer fonksiyon bütünlüğünü analiz etmek için bir yöntem olarak yaygın olarak kabul edilmektedir. Dar kavşaklarda artan hücresel etkileşim nedeniyle farklılaşmadan sonra TEER'deki artış, manuel bir TEER ölçüm cihazı veya otomatik bir TEER ölçüm robotu kullanılarak ölçülebilir.
    1. Manuel TEER ölçüm cihazı kullanılarak TEER ölçümü
      1. Elektrotu% 70 etanol ile temizleyin ve biyogüvenlik kabininin içinde hava ile kurumasını bekleyin. Elektrodu BM içeren bir tüpe yerleştirin. elektrodu manuel TEER ölçüm cihazına bağlayın. Ohm (Ω) cinsinden ölçmek için İşlev düğmesini çevirin. Güç düğmesini açın.
      2. Kısa elektrodu kesici ucun apikal bölmesine yerleştirin, uzun elektrot ise bazolateral bölmeye yerleştirilir (Şekil 6A). Tek katmana dokunmaktan kaçının.
      3. Boş kuyucuktaki direnci ölçün (Rboşluğu) ve ardından kalan numuneleri (Rnumunesi) aynı şekilde ölçün. Elektrodu farklı koşullara sahip numuneler arasında BM ile yıkayın. Elektrodu önce yarı suyla, sonra% 70 etanol ile temizleyin ve havayla kurumasını bekleyin.
      4. TEER (Ω·cm2) hesaplayın: [Rnumunesi (Ω) - Rboş (Ω)] × membran alanı (cm2) (Tablo 1 ve Şekil 6B).
    2. Otomatik bir TEER ölçüm robotu kullanılarak TEER ölçümü (Malzeme Tablosu)
      1. Membran uçları içeren 96 delikli ve 24 delikli HTS plakaları için HTS sistemlerini kullanırken otomatik TEER ölçümleri gerçekleştirin. Her iki tip için TEER ölçümü için farklı elektrotlar kullanın (24- ve 96- HTS membran uçları). TEER'i otomatik bir TEER ölçüm robotu kullanarak ölçmek için üreticinin talimatlarını izleyin.
  2. Epitel bariyer bütünlüğünün ve geçirgenliğinin ölçülmesi
    NOT: Bu protokol, tek katmanlı bütünlüğün bir göstergesi olarak apikalden bazolateral bölmeye Lucifer Sarı geçirgenliğini tanıtır. Bu bölümde, tek katmanlı geçirgenliği ve dolayısıyla bariyer bütünlüğünü değerlendirmek için 1 saatlik bir inkübasyon adımından sonra bazolateral bölmede floresan ölçümü açıklanmaktadır. Bu ölçüm bir son nokta testidir ve özellikle bileşiklerin bariyer bütünlüğü üzerindeki etkilerini test ederken kullanışlıdır.
    1. Lucifer Yellow'u buz üzerinde çözün ve BM'nin RT'ye dengelenmesine izin verin. Bir adet 24 delikli membran eki plakası için, BM'de 60 μM Lucifer Sarısı'ndan 5 mL çalışma çözeltisi hazırlayın.
      NOT: Lucifer Yellow ışığa duyarlıdır. Seyreltmeleri karanlık 1,5 mL steril tüplerde hazırlayın ve biyogüvenlik kabini ışığı kapalıyken tüm adımları gerçekleştirin.
    2. Ortamı, adım 3.5.1'de açıklandığı gibi, membran eklerinin bazolateral ve apikal bölmelerinden dikkatlice çıkarın. İstenirse, hasarlı bir bariyerden Lucifer Yellow sızıntısı için pozitif bir kontrol olarak bir pipet ucu kullanarak işlenmemiş bir tek katmanı çizin.
    3. Her apikal bölmeye 60 μM Lucifer Sarısı ile 150 μL BM ekleyin ve her bazolateral bölmeye Lucifer Sarısı olmadan 800 μL BM ekleyin. Plakayı 60 dakika boyunca 37 °C, 50 rpm'de bir çalkalayıcıya yerleştirin.
    4. Bu arada, 4.2.1 adımında hazırlanan çalışma çözeltisinden başlayarak BM'de Lucifer Sarısı'nın standart bir eğrisini hazırlayın. 3 nM'lik bir konsantrasyona ulaşılana kadar her adımda 1:3 oranında seyreltin. Negatif bir denetim ekleyin (yalnızca BM).
    5. Her standardın 100 μL'sini üçlü olarak 96 delikli şeffaf bir plakaya aktarın. 60 dakikalık inkübasyondan sonra, membran eklerini çıkarın ve her bir bazolateral kuyudan (adım 4.2.3) 100 μL'yi 96 delikli şeffaf plakaya üçlü olarak aktarın. 430 nm uyarma dalga boyunda ve 530 nm emisyon dalga boyunda bir plaka okuyucu kullanarak plakanın floresansını ölçün.
    6. Negatif kontrol değerini düzelttikten sonra (yalnızca BM), bazolateral bölmedeki Lucifer Sarı konsantrasyonunu hesaplamak için standart eğri değerlerini kullanın (son alıcı konsantrasyonu (μM)).
    7. Görünür geçirgenlik katsayısını (Puygulaması) aşağıdaki formüle göre hesaplayın (Şekil 6C):
      figure-protocol-23552
    8. Membran kesici uçlar içeren 24 delikli bir plaka için aşağıdaki formülü kullanın:
      figure-protocol-23716
  3. Tek katmanların sabitlenmesi ve astroloji için parafin bloklarının hazırlanması
    NOT: Epitel monokatmanları, hücresel bileşimlerinin, polaritelerinin ve bileşke proteinleri, proliferasyon veya farklılaşma belirteçleri gibi ilgilenilen farklı proteinlerin ekspresyonunun değerlendirilmesi için histolojik boyama için kullanılabilir. Bu bölümde histolojik boyama için parafin blok hazırlığı anlatılmaktadır.
    1. Ortamı, membran eklerinin bazolateral ve apikal bölmelerinden, adım 3.5.1'de açıklandığı gibi dikkatlice çıkarın.
    2. Tek katmanları, her apikal bölmeye 150 μL DPBS (Ca 2+ ve Mg2+ olmadan) ve her bazolateral bölmeye 800 μL ekleyerek yıkayın. DPBS'yi önce bazolateral bölmeden ve daha sonra apikal bölmeden dikkatlice aspire edin.
      NOT: Bazolateral bölme bu adımdan itibaren boş kalacaktır.
    3. Bir duman davlumbazında, her apikal bölmeye 150 μL% 4 paraformaldehit ekleyin ve RT'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
      NOT: Bu adımdan itibaren, paraformaldehit toksik olduğundan, bu bölümdeki tüm eylemleri bir duman başlığı içinde gerçekleştirin.
    4. Fiksatifi membran eklerinin apikal bölmelerinden dikkatlice aspire edin ve sıvı halojen atık olarak atın.
      NOT: Bu adımdan itibaren tüm sıvı atıkları sıvı halojen atık olarak bertaraf ediniz.
    5. Her apikal bölmeye 200 μL DPBS (Ca2+ ve Mg2+ olmadan) ekleyerek monokatmanları yıkayın ve DPBS'yi tekrar dikkatlice aspire edin. Bu adımı bir kez daha tekrarlayın.
    6. Her apikal bölmeye 200 μL% 25 etil alkol (EtOH) ekleyin ve RT'de 15 dakika boyunca inkübe edin. 15 dakika sonra, membran eklerinin apikal bölmelerinden %25 EtOH'yi dikkatlice aspire edin. % 50 EtOH çözeltisi ve daha sonra% 70 EtOH çözeltisi ile tekrarlayın.
    7. Her apikal bölmeye 200 μL% 70 EtOH ekleyin ve plakayı parafilm ile sarın. Daha fazla kullanana kadar 4 ° C'de saklayın.
    8. %70 EtOH'yi dikkatlice aspire edin ve tek katmanlı membranları kesici uçlardan dikkatlice kesmek için bir neşter kullanın. Bazolateral taraftan, kesici ucun kenarı etrafında kesin.
    9. Standart prosedürü izleyerek parafin blokları hazırlayın.
      1. Parafin hala sıcak olduğunda, tek katmanı parafinden cımbızla alın ve önceden soğutulmuş bir yüzeye yerleştirin.
      2. Tek katmana zarar vermemeye dikkat edin. Tek kenarlı bir bıçak kullanarak tek katmanı ikiye bölün.
      3. Kasetin altındaki parafin katılaşmaya başladığında, iki tek katmanlı parçayı parafinin içine, düz tarafı aşağı ve dikey yönde olacak şekilde yan yana yerleştirmek için ısıtmalı cımbız kullanın.
    10. Parafin bloklar hazır olduğunda, blokları bir mikrotom kullanarak kesin ve standart prosedürü izleyerek 4 μm kalınlığında kesitlerden slaytlar yapın. Tek katmanların coupe'de dikey olarak sona erdiğinden emin olun.
    11. Histolojik lekeleri daha önce tarif edildiği gibi gerçekleştirin 7,9. Genel morfolojiyi, proliferatif hücreleri, mukus üretimini ve kadeh hücrelerini göstermek için sırasıyla hematoksilin ve eozin (H & E), Ki67, müsin-2 (MUC2) ve Alcian Blue kullanın (Şekil 6E).
      NOT: Paneth hücreleri için lizozim gibi ek farklılaşma belirteçleri de kullanılabilir. Bu belirteç Şekil 6E'de sunulmamıştır, çünkü Paneth hücreleri kolon epiteli yerine ince bağırsak epitelinde bulunur.
  4. Orta süpernatantta salgılanan protein ölçümü
    1. İleal monokatmanların apikal süpernatantındaki lizozim seviyelerini Malzeme Tablosunda listelenen kiti kullanarak ölçün (bkz. Şekil 6D). İstenirse, farklı sitokinlerin ve diğer ilgili proteinlerin seviyelerini ölçün.
  5. Gen ekspresyon analizi
    1. Kantitatif ters transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) kullanarak farklılaşma ortamının epitel hücre belirteci genlerinin ekspresyonu üzerindeki etkilerini ölçmek.
      1. Tek katmanları 350 μL RNA lizis tamponunda lize edin ve ardından üreticinin talimatlarına göre RNA izolasyonu yapın. Daha önce 7,9'da açıklandığı gibi, Malzeme Tablosunda listelenen cDNA sentez kitlerini, ana karışımı ve oligonükleotidleri kullanarak cDNA sentezi ve qPCR'leri gerçekleştirin.

5. Membran ekleri içeren 96 delikli plakalara yükseltme

NOT: Membran ekleri içeren HTS 96 delikli plakaları kullanarak daha yüksek verimli ilaç taramaları veya çoklu ortam koşulları için epitel monokatmanları hazırlayın.

  1. 96 delikli formatta monokatmanlar hazırlarken uyarlamalar
    1. Membran ekleri içeren 24 delikli plakalar için bu protokolde açıklanan tüm adımları izleyin, hacimleri ve hücre numaralarını Tablo 1'de açıklananlarla değiştirin. Membran uçlu 96 delikli plakalar üzerinde tek katmanlı malzemeler hazırlamak için, aşağıdaki farklılıklarla bölüm 3'te açıklandığı gibi devam edin.
      1. Membran uçları ile tam bir 96 delikli plakayı tohumlamak için Şekil 3A'da temsil edilen organoid yoğunluğa sahip 6 kuyucuklu bir kültür plakasının yaklaşık 9 kuyucuğuna ihtiyaç vardır. Adım 3.2.1'de, membranları DPBS'de 67 μL 40x seyreltilmiş ECM ile ön kat edin (Ca 2+ ve Mg2+ ile).
      2. Bölüm 3.5'te, hem apikal hem de bazolateral bölmelerin orta derecede ferahlamasına izin vermek için önce membran eklerinin entegre plakasını başka bir 96 delikli plakaya aktarın.

Sonuçlar

Şekil 1A, bağırsak organoidlerinin bir kriyovyalden çözüldükten sonra temsili bir parlak alan görüntüsünü göstermektedir. Optimal iyileşmeyi sağlamak için organoidleri yüksek yoğunlukta çözmek önemlidir. Organoidler, yaklaşık 10 μL'lik ECM kubbelerinde 24 veya 6 delikli plakalar halinde kaplanır (Şekil 1B). Çoğu normal bağırsak organoidinin kistik morfolojisi vardır. Çözülme işleminden kurtulduktan sonra, organoidler daha büy?...

Tartışmalar

Bu protokol, bağırsak organoidlerinin genel manipülasyonunu ve bakımını ve ayrıca bu organoidlerden türetilen epitel monokatmanlarının hazırlanmasını ve olası uygulamalarını açıklar. Bugüne kadar, monokatmanlar, normal, daha önce ve aktif olarak iltihaplı bağırsak dokusundan türetilen duodenum, ileum ve kolon organoidlerinin farklı bölgelerinden başarıyla hazırlanmıştır (yayınlanmamış veriler). Hasta kaynaklı organoid monokatmanların uygulanması, bariyer fonksiyonunun hastalığa ve ...

Açıklamalar

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu çalışma, Hollanda LSH sektörünün Topsector Life Sciences & Health - Topconsortium voor Kennis en Innovatie Health ~ Holland (LSH-TKI) kamu-özel sektör ortaklıkları (PPP) ödeneği tarafından desteklenmektedir LSHM16021 Proje numarası ile Hubrecht Organoid Teknolojisine (HUB) toksikoloji modellemesi için yeni bir araç olarak Organoidler ve Hastalık Modelleme ve Toksikoloji departmanına HUB iç finansmanı. Sabine Middendorp (Pediatrik Gastroenteroloji Bölümü, Wilhelmina Çocuk Hastanesi, UMC, Utrecht) ve Hugo R. de Jonge ve Marcel J.C. Bijvelds (Gastroenteroloji ve Hepatoloji Bölümü, Erasmus MC, Rotterdam) laboratuvarlarına, membran eklerinde tek katmanlı tabakalar kurmak için ilk teknik desteği sağladıkları için teşekkür ederiz.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
100% ethanolFisher Emergo10644795
1250, 300, and 20 µL low-retention filter-tipsGreiner bio-one732-1432 / 732-1434 / 732-2383
15 mL conical tubesGreiner bio-one188271
24-well cell culture platesGreiner bio-one662160
24-well HTS Fluoroblok Transwell plate (light-tight)Corning351156
24-well HTS Transwell plates (Table 1)Corning3378
24-well plate with Transwell insertsCorning3470
40 µm cell strainerPluriSelect43-50040-01
50 mL conical tubesGreiner bio-one227261
6-well cell culture platesGreiner bio-one657160
96-well black plate transparent bottomGreiner bio-one655090
96-well fast thermal cycling platesLife Technologies Europe BV4346907
96-well HTS Fluoroblok Transwell plateCorning351162
96-well HTS Transwell plates (Table 1)Corning7369
96-well transparent culture plateGreiner bio-one655180
A83-01Bio-Techne Ltd2939
Accutase Cell Dissociation ReagentLife Technologies Europe BVA11105-01Cell dissociation reagent 2
Advanced DMEM/F-12Life Technologies Europe BV12634028
B27 supplementLife Technologies Europe BV17504001
Cell culture microscope (light / optical microscope)Leica
CellTiter-GloPromegaG9683
CentrifugeEppendorf
CO2 incubatorPHCBI
DAPTSigma-AldrichD5942
DEPC treated H2OLife Technologies Europe BV750024
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) with Ca2+ and Mg2+Life Technologies Europe BV14040091
DPBS, powder, no calcium, no magnesiumLife Technologies Europe BV21600069
EnzChek Lysozyme Assay KitLife Technologies Europe BVE22013
EVOM2 meter with STX electrodeWTI
GastrinBio-Techne Ltd3006
Glass pipettesVolac
GlutaMAXLife Technologies Europe BV35050038
hEGFPeprotechAF-100-15
HEPESLife Technologies Europe BV15630056
Human NogginPeprotech120-10C
Human Rspo3Bio-Techne Ltd3500-RS/CF
IWP-2Miltenyi Biotec130-105-335
Ki67 primary antibodySanbioBSH-7302-100
Ki67 secondary antibodyAgilentK400111-2
Kova International Glasstic Slide with Counting gridsFisher Emergo10298483
Laminar flow hoodThermo scientific
Lucifer Yellow CH dilithium saltSigma-AldrichL0259
Matrigel, Growth Factor Reduced (GFR)Corning356231extracellular matrix (ECM)
MicroAmp Fast 8-Tube Strip, 0.1 mLLife Technologies Europe BV4358293
MicroAmp Optical 8-Cap StripsLife Technologies Europe BV4323032
Microcentrifuge tubesEppendorf0030 120 086
Micropipettes (1000, 200, and 20 µL)Gilson
MicrotomeLeica
MUC2 primary antibodySanta Cruz Biotechnologysc-15334
MUC2 secondary antibodyVWRVWRKS/DPVR-HRP
Multichannel pipette (200 µL)Gilson
N-acetylcysteineSigma-AldrichA9165
NGS WntU-Protein ExpressN001-0.5mg
NicotinamideSigma-AldrichN0636
Oligonucleotide ALPI1/ForwardCustom-madeGGAGTTATCCTGCTCCCCAC
Oligonucleotide ALPI1/ReverseCustom-madeCTAGGAGGTGAAGGTCCAACG
Oligonucleotide LGR5/ForwardCustom-madeACACGTACCCACAGAAGCTC
Oligonucleotide LGR5/ReverseCustom-madeGGAATGCAGGCCACTGAAAC
Oligonucleotide MUC2/ForwardCustom-madeAGGATCTGAAGAAGTGTGTCACTG
Oligonucleotide MUC2/ReverseCustom-madeTAATGGAACAGATGTTGAAGTGCT
Oligonucleotide TBP/ForwardCustom-madeACGCCGAATATAATCCCAAGCG
Oligonucleotide TBP/ReverseCustom-madeAAATCAGTGCCGTGGTTCGTG
Optical adhesive coversLife Technologies Europe BV4311971
PD0325901Stemcell Technologies72184
Penicillin/streptomycinLife Technologies Europe BV15140122
Plate shakerPanasonic
PowerUp SYBR Green Master MixFisher EmergoA25776
PrimocinInvivoGenANT-PM-2antimicrobial formulation for primary cells
Qubit RNA HS Assay KitLife Technologies Europe BVQ32852
Reagent reservoir for multichannel pipetSigma-AldrichCLS4870
REMS AutoSampler with 24-probe or 96C-probeWTI
Richard-Allan Scientific Alcian Blue/PAS Special Stain KitThermo scientific87023
RNase-Free DNase SetQiagen79254
RNeasy Mini KitQiagen74106
SB202190Sigma-AldrichS7076
Serological pipettesGreiner bio-one606180 / 607180 / 760180
Serological pipettor (Pipet-Aid)Drummond
Single edge razor bladeGEM Scientific
Superscript 1st strand system for RT-PCRLife Technologies Europe BV11904018
Tecan Spark 10M plate readerTecan
Trypan Blue Solution, 0.4%Life Technologies Europe BV15250-061
TrypLE Express Enzyme (1x)Life Technologies Europe BV12605-010Cell dissociation reagent 1
Water bathGrant
Y27632 (ROCK inhibitor)AbMoleM1817

Referanslar

  1. Haegebarth, A., Clevers, H. Wnt signaling, lgr5, and stem cells in the intestine and skin. The American Journal of Pathology. 174 (3), 715-721 (2009).
  2. Schoultz, I., Keita, &. #. 1. 9. 7. ;. V. The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9 (8), 1909 (2020).
  3. Martínez-Maqueda, D., Miralles, B., Recio, I., Verhoeckx, K. HT29 Cell Line. The Impact of Food Bio-Actives on Gut Health: In Vitro and Ex Vivo Models. , 113-124 (2015).
  4. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  5. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  6. Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5(+) liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 11 (2), 179-194 (2013).
  7. Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 1-20 (2019).
  8. Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
  9. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  10. Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  11. Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
  12. Van De Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
  13. Driehuis, E., et al. Pancreatic cancer organoids recapitulate disease and allow personalized drug screening. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (52), 26580-26590 (2019).
  14. Tiriac, H., et al. Organoid profiling identifies common responders to chemotherapy in pancreatic cancer. Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).
  15. d'Aldebert, E., et al. Characterization of human colon organoids from inflammatory bowel disease patients. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 363 (2020).
  16. Dotti, I., et al. Alterations in the epithelial stem cell compartment could contribute to permanent changes in the mucosa of patients with ulcerative colitis. Gut. 66 (12), 2069-2079 (2017).
  17. VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. 64 (6), 911-920 (2015).
  18. Noel, G., et al. A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions. Scientific Reports. 7, 45270 (2017).
  19. Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
  20. van Es, J. H., et al. Wnt signalling induces maturation of Paneth cells in intestinal crypts. Nature Cell Biology. 7 (4), 381-386 (2005).
  21. van Es, J. H., et al. Dll1 marks early secretory progenitors in gut crypts that can revert to stem cells upon tissue damage. Nature Cell Biology. 14 (10), 1099-1104 (2012).
  22. de Lau, W. B. M., Snel, B., Clevers, H. C. The R-spondin protein family. Genome Biology. 13 (3), 1-10 (2012).
  23. Basak, O., Beumer, J., Wiebrands, K., Seno, H., van Oudenaarden, A., Clevers, H. Induced quiescence of Lgr5+ stem cells in intestinal organoids enables differentiation of hormone-producing enteroendocrine cells. Cell Stem Cell. 20 (2), 177-190 (2017).
  24. Beumer, J., et al. Enteroendocrine cells switch hormone expression along the crypt-to-villus BMP signalling gradient. Nature Cell Biology. 20 (8), 909-916 (2018).
  25. Yin, X., Farin, H. F., van Es, J. H., Clevers, H., Langer, R., Karp, J. M. Niche-independent high-purity cultures of Lgr5+ intestinal stem cells and their progeny. Nature Methods. 11 (1), 106-112 (2014).
  26. Boj, S. F., et al. Forskolin-induced swelling in intestinal organoids: An in vitro assay for assessing drug response in cystic fibrosis patients. Journal of Visualized Experiments. (120), (2017).
  27. Miao, Y., et al. Next-generation surrogate Wnts support organoid growth and deconvolute Frizzled pleiotropy in vivo. Cell Stem Cell. 27 (5), 840-851 (2020).
  28. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
  29. Blume, L. -. F., Denker, M., Gieseler, F., Kunze, T. Temperature corrected transepithelial electrical resistance (TEER) measurement to quantify rapid changes in paracellular permeability. Die Pharmazie. 65 (1), 19-24 (2010).
  30. Lea, T., Verhoeckx, K., et al. Caco-2 cell line. The Impact of Food Bio-Actives on Gut Health: In Vitro and Ex Vivo Models. , 103-111 (2015).
  31. Heo, I., et al. Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids. Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).
  32. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyolojiSay 173epitel tek katmanlinsan ba rsak organoidlerimembran ekbariyer fonksiyonuge irgenlikta ma

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır