Keratinosit Kök Hücre Plastisitesini Modellemek için Yüksek Verimli Epidermal Sferoid Kültür Sistemi Kurulması

Özet

Burada 3D süspansiyon kültüründe epidermal sferoidlerin sistematik olarak yetiştirilmesi için bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol, çeşitli epitel doku tiplerinde kullanılmak ve çeşitli insan hastalıklarının ve koşullarının modellenimi için geniş kapsamlı uygulamalara sahiptir.

Özet

Epitel düzensizliği, kronik yaralama, iltihaplanma ve tüm insan kanserlerinin% 80'inden fazlası dahil olmak üzere çeşitli insan koşulları ve rahatsızlıkları için bir düğümdür. Bir astar dokusu olarak, cilt epitel genellikle yaralanmaya maruz kalır ve hasarlı dokuyu onarmak için gerekli hücresel plastisiteyi elde ederek evrimsel olarak adapte olur. Yıllar boyunca, in vitro ve ex vivo hücre bazlı modeller kullanarak epitel plastisitesini incelemek için çeşitli çabalar sarf edilmiştir. Bununla birlikte, bu çabalar epitel hücre plastisitesinin çeşitli aşamalarını yeniden yakalama kapasitelerinde sınırlı olmuştur. Burada primer yenidoğan insan keratinositlerinden 3D epidermal sferoidler ve epidermal sferoid türevli hücreler üretmek için bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol, epidermal sferoid kültürlerinin keratinosit üretici plastisitenin farklı aşamalarını işlevsel olarak modelleme kapasitesini özetlemektedir ve epidermal küresel re-kaplamanın integrinα6^hi/EGFR^lo keratinosit subpopulasyonları için heterojen normal insan keratinosit (NHKc) kültürlerini gelişmiş kök benzeri özelliklerle zenginleştirebileceğini göstermektedir. Raporumuzda cilt keratinosit plastisitesi ve epidermal rejenerasyon çalışması için yüksek verimli bir sistemin geliştirilmesi ve sürdürülmesi açıklanmaktadır.

Giriş

Memeli tabakalı epitel, tüm canlı sistemlerde en karmaşık epitel mimarisidir ve en sık hasar ve yaralanmaya maruz kalır. Koruyucu bir doku olarak, tabakalı epitel karmaşık ve etkili bir doku hasarı tepkisi oluşturmak için evrimleşmiştir. Yaralanma üzerine, bu hücreler, yaralı bölgeye göç etmelerini ve onarım¹,^2,3'ü gerçekleştirmelerini sağlayan soy plastisite programlarını etkinleştirmelidir. Bu çok yönlü yanıt, yedenmiş olarak anlaşılan birkaç sıralı adımda gerçekleşir.

Epitel rejenerasyonunun karmaşık sürecinin incelenmesinde büyük bir engel, hücre yenilenmesinin tanımlanmış aşamalarında dinamik hücresel aktiviteleri yakalayabilen yüksek verimli model sistemlerinin değerinde yatmaktadır. In vivo fare modelleri yara iyileşmesi hakkında ilgili içgörüler sunarken ve insan rejeneratif sürecini en yakından özetlese de, gelişimleri zahmetli çabalar ve önemli maliyet gerektirir ve üretim kapasitelerini sınırlar. Bu nedenle, insan epitel dokusu yenilenmesinin yüksek verim ölçeğinde fonksiyonel olarak araştırılmasını sağlayan sistemlerin kurulması için kritik bir ihtiyaç vardır.

Son yıllarda ölçeklenebilirlik zorluğunun karşılanması için çeşitli girişimlerde bulunulmuştur. Bu, in vivo rejeneratif bağlamı yakından taklit eden yenilikçi in vitro ve ex vivo hücre tabanlı modellerin büyük genişlemesi ile görülür. Bu, çip üzerindeki^{organ-on-chip 4}, küresel⁵, organoid⁶ve organotipik kültürlerdeki gelişmeleri içerir⁷. Bu 3D hücre tabanlı sistemlerin her biri benzersiz avantajlar sunar ve farklı deneysel sınırlamalar sunar. Bugüne kadar, küresel kültür en uygun maliyetli ve yaygın olarak kullanılan 3D hücre kültürü modeli olmaya devam etmektedir. Ve birkaç rapor sferoid kültürlerinin cilt kök hücre özelliklerini incelemek için kullanılabileceğini belirtmiş olsa da, bu çalışmalar büyük ölçüde hayvan dokusu^8,9veya dermal fibroblastlar¹⁰, insan epidermal küresel kültürlerinin rejeneratif özelliklerini iyice karakterize eden neredeyse hiçbir rapor olmadan yapılmıştır. Bu protokolde epidermal sferoid kültürlerin normal insan keratinositlerinden (NHKc) fonksiyonel gelişimini, kültürünü ve bakımını detaylandırıyoruz. Epidermal rejenerasyon ve keratinosit kök hücre plastisitesinin sıralı evrelerini in vitro olarak modellemek için bu sistemin yararlarını eşit olarak açıklıyoruz.

Protokol

Deri örneklerinin toplanması ve işlenmesi ve insan keratinositlerinin izolasyonu için protokol Güney Carolina Üniversitesi (UofSC) IRB tarafından gözden geçirilmiş ve sünnet derisi örneklerinin rutin cerrahi prosedürler sırasında (yenidoğan erkek çocukların sünneti) üretilen cerrahi atmalar olduğu ve tanımlayıcı bilgilerden tamamen yoksun olduğu için "insan deneklerini içermeyen araştırma" olarak sınıflandırılmıştır. Protokol ayrıca UofSC Biyogüvenlik Komitesi tarafından düzenli olarak gözden geçirilerek onaylandı ve tüm laboratuvar personeline laboratuvar biyogüvenlik eğitimi verildi. Tüm prosedürler UofSC'nin güvenlik ve etik standartlarına uygun olarak yürütüldü.

1. Yenidoğan sünnet derisi dokusundan insan keratinositlerinin izolasyonu ve kültürü

1. 500 mL KSFM ortamına 0,1 M HEPES tampon ekleyerek yıkama ortamını hazırlayın ve 7,2 pH'a ayarlayın. Ortamı 500 mL vakum filtresinde (0,22 μm gözenek boyutu) sterilize edin. MCDB 153-LB bazal ortam, KSFM yerine alternatif bir yıkama çözümü olarak da kullanılabilir.
2. Laminer akış davlumbazında, yenidoğan sünnet derisi 50 mL konik bir tüpte 5 mL yıkama ortamı ile yıkayın. İki kez tekrarlayın.
3. Yıkanmış foreskin'i steril bir Petri kabına aktarın. Neşter ve toparlap kullanarak, yağ ve gevşek bağ dokularını dermal tabakadan kazıyın. 50 mL konik tüpte 5 mL yıkama ortamı ile foreskin yeniden yıkayın.
4. Foreskin epidermis tarafını yıkama ortamlarında seyreltilmiş 2 mL dispaz enzimi içeren 6 kuyulu bir tabağa yerleştirin (50 U/mL).
5. Plakayı 4 saat boyunca bir inkübatöre aktarın (37 °C, %5 CO_2,%95 nem).
6. Foreskin'i inkübatörden çıkarın ve steril koşullar altında bir Petri kabına aktarın. İnce uçlu epepler kullanarak epidermisi dermis tabakasından ayırın.
7. Epidermisi% 0.25 Trypsin-EDTA'nın 2 mL'sini içeren 15 mL konik bir tüpe yerleştirin. 5 mL serolojik pipet kullanarak, yüzen epidermisi mekanik olarak ezin. Her 5 dakikada bir 5 sn periyodik girdap ile 37 °C'de 15 dakika kuluçkaya yaslanın.
8. İnkübasyondan sonra, 2 mL soya fasulyesi tripsin inhibitörü ekleyin ve tripsini nötralize etmek için pipetle karıştırın.
9. Santrifüj hücre süspansiyonu 450 x g'da2 dakika ve sonra 250 x g'da8 dakika .
10. Hücre peletini yerinden çıkarmamaya dikkat ederek, yüzen kalıntıları kümeslerle çıkarın. Hücre peletinden süpernatantı dikkatlice aspire edin.
11. Peletin 12 mL'lik komple KSFM-scm orta ve plakayı 10 cm'lik bir tabakta yeniden sunun. Bir gecede kuluçka kabı (37 °C, %5 CO_2,%95 nem).
12. Ertesi gün, aspirasyon pipet kullanarak ortamı çıkarın ve 12 mL komple KSFM-scm ile değiştirin.
13. Normal insan keratinosit (NHKc) kültürlerinin optimal büyümesini sağlamak için, hücrelerin% 80'den fazla izdiah elde etmesini önlemek için 10.

2. Cilt epidermosfer kültürlerinin in vitro olarak üretilmesi

1. 50 mL'lik bir cam şişeye 50 mL fosfat tamponlu saline (PBS) 2,5 g agarose ekleyerek% 5 agarose karışımı hazırlayın. Sıvı döngüsü altında otoklav şişesi. Oda sıcaklığına kadar soğumaya bırakın.
2. Tabak hazırlamak için, agarose çözeltisi içeren soğutulmuş cam şişeyi 200 mL deiyonize su (dH₂O) ile doldurulmuş 1 L plastik bir kabın içine yerleştirin. Agarose karışımını araştırma sınıfı bir mikrodalga fırında 2 dakikaya kadar eritin, şişeyi hafifçe yana yatırarak her 60 s'de bir agarı karıştırın.
   DİkKAT: Mikrodalga fırında agar eritmek, şişe kabının aşırı derecede ısınmasına ve basınç birikmesine neden olur. Her 30 s'de bir basınç birikmesi bırakın. Yaralanmayı önlemek için uygun koruyucu ekipman giyin.
3. %1 agarose (wt/vol) son konsantrasyon için 42 °C'ye önceden ısıtılmış 12 mL KSFM-scm'ye 3 mL eritilmiş %5 agarose ekleyin.
   İsteğe bağlı: yumuşak agarın erken polimerizasyonunu önlemek için serolojik pipetleri ve pipet uçlarını önceden ısıtın.
4. Hızlı bir şekilde pipet 200 μL% 1 agar karışımı çok kanallı pipetör kullanarak 96 kuyulu yuvarlak tabanlı plakanın bireysel kuyularına karışır (Şekil 1A). Agarose'un tamamen polimerize olmasını sağlamak için plakayı 25 °C'de 4 saat steril ortamda bırakın.
   NOT: Denemeler burada durdurulabilir ve ertesi gün devam edilebilir. Polimerize agaroz plakaları, parafilm sargısı ile kapatıldığında 37 °C'de 24 saate kadar veya 4 °C'de 48 saate kadar muhafaza edilebilir. Kullanmadan önce en az 1 saat boyunca nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'ye kadar ılık plaka.
5. Pasaj sferoid oluşturan NHKc, 2 mL PBS'de ortam ve yıkama hücreleri soluyarak. PBS'yi aspire edin ve yıkanmış hücrelere% 0.25 Trypsin-EDTA'nın 2 mL'sini ekleyin. 37 °C'de 5 dakika kuluçkaya ya da tüm hücreler tamamen çözülene kadar kuluçkaya yatır. Tabağa 2 mL Soya Trypsin Inhibitörü ekleyin ve plakadaki hücreleri 15 mL'lik bir tüpe yıkayın. 5 dakika boyunca 250 x g'da santrifüj.
6. Peleti 1 mL PBS'de yeniden dirsintir. Trypan mavisi boyama ve hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücre canlılığını ölçün.
7. Aliquot 2 x 10⁴ NHKc 100 μL KSFM-scm ve tohum daha önce hazırlanmış 96 kuyulu yuvarlak-alt plaka bireysel kuyulara. Bir gecede kuluçka plakası (37 °C, %5 CO_2,%95 nem).
8. Ters faz kontrast mikroskobu kullanarak, epidermosfer oluşumu için tohumlanmış iyi analiz edin.
   NOT: Normal insan keratinositlerinden elde edilen insan epidermosferleri, hücre canlılığında önemli bir azalma olmasına rağmen, 3D süspansiyon kültüründe 96 saate kadar yaşayabilir (Şekil 2).

3. Epidermal sferoid yeniden kaplama tahlil

1. 3D epidermosfer oluşumundan sonra 24-48 saat, 6 cm'lik bir yemeğe 4 mL önceden ısıtilmiş KSFM-scm ekleyin. Tek bir sferoidi plakaya aktarmak için geniş bir delikli 1 mL pipet ucu kullanın, parçalanmamasını sağlayın. Alternatif olarak, ucu kesmek için steril bir jilet kullanarak 1 mL pipet ucunu genişletin.
2. Plakayı gece boyunca kuluçkaya bırakın (37 °C, %5 CO_2,%95 nem).
3. Plakanın dibine bağlanmak için tohumlu küreseli analiz edin ve ters faz kontrast mikroskobu kullanarak hücreleri yaymak için gözlemleyin (Şekil 3). Plakanın içindeki 2 mL ortamı nazikçe çıkararak ve yavaşça plakaya 2 mL taze KSFM-scm ortam ekleyerek her 96 saat hücre besleyin.
4. Pasaj sferoid türevli (SD) NHKc% 70-80 izdiah süresine ulaştıklarında ve seçim testine devam ettikleri zaman. Hücrelerin kültürde tam izdiaha ulaşmasını önlemek için SD-NHKc'yi sık sık izleyin, çünkü bu erken farklılaşma ve hücre büyümesi durması ile sonuçlanır (Şekil 3E-F).
5. Epidermal sferoid replating test modelleri keratinosit aracılı yara onarımı epidermal rejeneratif plastisitenin önemli sıralı aşamalarının her birini yakalayarak: a) homeostatik bakım, b) diferansiyel durdurma/tersine çevirme c) stres soyu hareketliliği ve d) doku restorasyonu (Şekil 1B; Tablo 2). Bu tahlil, organotipik sal kültürleri için hücre popülasyonları üretmek veya önceki çalışmamızda gösterildiği gibi HPV aracılı neoplazi modellemek için de kullanılabilir ^11,12.

4.3D floresan hücre takibi

1. 6 cm'lik bir tabakta, gelişmiş yeşil floresan protein (eGFP) geni taşıyan 1 μg pMSCV-IRES-EGFP plazmid vektörü ile transfect sferoid oluşturan 2D monolayer NHKc kültürleri. Bir gecede inkübte plaka (37 °C, %5 CO_2,%95 nem) mikroskop (Şekil 4A).
   NOT: Serumsuz antibiyotiksiz koşullarda transfeksiyonun tamamlanması önemlidir.
2. Transfeksiyon karışımını çıkarmadan, hücrelere 2 mL önceden uyarılmış KSFM-scm ekleyin. Bir gecede kuluçka plakası (37 °C, %5 CO_2,%95 nem).
3. Plaka ve besleme hücrelerindeki tüm transfeksiyon ortamlarını 3 mL önceden ısıtılmış KSFM-scm ile aspire edin.
4. Pasaj ve tohum 2 x^{10 4} EGFP transfected hücreler daha önce hazırlanmış 96 kuyulu yuvarlak tabanlı bir plakanın bireysel kuyularına. Bir gecede kuluçka plakası (37 °C, %5 CO_2,%95 nem). Egfp^pos sferoid hücre hareketini floresan mikroskobun FITC kanalı altında görselleştirin ve izleyin (Şekil 4B-C).
5. Kaplamadan 24 saat sonra, 6 cm'lik bir tabağa 3 mL önceden ısıtilmiş KSFM-scm ekleyin. Tek bir sferoidi plakaya aktarmak için geniş bir delikli 1 mL pipet ucu kullanın, parçalanmamasını sağlayın. Bir gecede kuluçka plakası (37 °C, %5 CO_2,%95 nem).
6. Floresan mikroskobu kullanarak yayılan SD-NHKc^EGFP'yi gözlemleyin ve analiz edin. Plakanın içindeki 2 mL'lik ortamı nazikçe çıkararak ve yavaşça plakaya 2 mL taze KSFM-scm ortam ekleyerek her 96 saat hücre besleyin.
7. FACS izolasyonu veya tercih edilen tahliller için hasat SD-NHKC^EGFP.

5. Küresel türevli (SD) alt popülasyonların FACS tarafından karakterizasyonu

1. Pasaj SD-NHKc ve eski medyayı aspire ederek ve hücreleri 2 mL PBS'de yıkayarak ilgili otolog 2D monolayer kültürleri. PBS'yi çıkarın ve yıkanmış hücrelere % 0,25 Trypsin-EDTA'nın 2 mL'sini ekleyin. 37 °C'de 5 dakika veya tüm hücreler tamamen çözülene kadar kuluçkaya yatır.
2. Plakaya 2 mL Soya Trypsin Inhibitörü ekleyin ve hücreleri 15 mL'lik bir tüpe aktarın. 5 dakika boyunca 250 x g'da santrifüj.
3. Peletleri 1 mL PBS'de yeniden sunun. Trypan mavisi ve otomatik bir hemositometre hücre sayacı kullanarak hücre canlılığını ölçün.
4. 0,1-4 x 10⁶ NHKc hücre içeren Aliquot 100 μL'den 1,5 mL mikrosantrifüj tüplere. Laminar kaputun içindeki parlak ışıkları kapatarak oluşturulan karanlık bir ortamda tüpü buzun üzerine yerleştirin.
5. 1:50 seyreltme elde etmek için tüplere 2 μL FITC konjuge anti-integrinα6 ve 2 μL PE-konjuge anti-EGFR ekleyin. Tespit edilmemiş kontrol görevi görmek için antikor eklenmemiş bir tüp hazırlayın. Tüpleri karanlıkta veya 4 °C'de 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın. Boncukların veya bir cilt SCC hattının kullanımı, cilt SCC hücrelerinin yüksek integrinα6 ve EGFR seviyelerini ifade ettiği için pozitif kontrol görevi görebilirsiniz.
6. Uygun lazerler içeren tercih edilen akış sitometresini kullanarak akış sitometrisi analizi yapın.
7. Kapıları kurmak için negatif ve pozitif kontrolleri kullanın. Integrinα6^hi/EGFR^lo hücrelerinin alt nüfusunu sıralayın; bunlar epidermal kök hücre fraksiyonudur. Integrinα6^hi/EGFR^hi hücreleri proliferatif progenitör hücre fraksiyonudur. Integrinα6^lo/EGFR^hi hücreleri taahhüt edilen progenitör hücre fraksiyonudur (Şekil 4D). SıRALAMA FACS tüpleri en az 1 mL buz-soğuk KSFM-scm içermelidir.
8. Her bir sıralama tüpünün içeriğini PBS'deki sıralanmış hücrelerin hacminin 10 katını içeren 15 mL konik bir tüpe aktararak sıralanmış hücre alt nüfuslarının proliferatif kapasitesini test edin. NOT: Keratinositler sık sık oraya yapışabileceğinden, sıralama FACS tüplerinin duvarını birkaç kez pipetleyarak janta bağlı tüm hücrelerin çıkarılması önemlidir.
9. 5 dakika boyunca 250 x g'da 15 mL tüpleri santrifüj edin. 12 mL KSFM-scm'de süpernatant ve resuspend peletini çıkarın. Yeniden sulanan hücreleri 6 cm'lik bir plakaya aktarın ve gece boyunca kuluçkaya bırakın (37 °C, %5 CO₂, %95 nem).
10. Ertesi gün, plakalardaki medyayı çıkarın ve 8 mL önceden ısıtılmış KSFM-scm ekleyin. Hücreleri% 70-80 birleştiği zamana kadar her 3 günde bir 12 mL ortamla yeniden besleyin (Şekil 4E).

6. Bazal kök hücre belirteçleri için epidermosferlerin immünofluoresansı ve boyanma

1. Epidermosferleri poli lizin ile kaplanmış kapaklara aktarın. SD-NHKc'nin %75 bir araya gelene kadar yayılmasına izin verin.
2. Hücreleri PBS'de (4 °C) iki kez 5'er dakika yıkayın.
3. %4 paraformaldehit (PFA) içeren hücreleri oda sıcaklığında 20 dakika sabitlayın.
4. %1 glisinin %0,5 Triton X-100 ile hücreleri permeabilize eder. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca % 0.5 BSA ve% 5 keçi serumu kullanarak engelleyin.
5. Örnekleri P63 (1:200) ve sitokeratin 14'e (1:200) karşı antikorlarla bir gecede 4 °C'de bloke çözeltisinde kuluçkaya yatırın.
6. Tween 20 (PBST) içeren PBS (4 °C) ile üç kez yıkayın, ardından FITC ve Alexa 568 konjuge ikincil antikorlarla (1:1000 seyreltme) inkübasyon.
7. Hücreleri monte etmeden önce 4', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) (1:5000 seyreltme) ile nuclei leke.
8. FITC ve PE lazer hatları ile floresan özellikli bir mikroskop kullanarak hücreleri gözlemleyin (Şekil 4F).

7. Epidermosfer kültürlerinin transkripsiyon analizi

1. RNA'yı izole etmek için düşük geçişli NHKc kültürlerinin üç taraflı plakalarını kurmak, aynı otolog hücre hattından monolayer, küresel ve küresel türetilmiş kültürlerden olabilir.
2. Havuz 3-5 karşılık gelen epidermosferler 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne. Otolog SD-NHKc ve 2D monolayer kültürlerini ayrı ayrı hasat edin.
3. Toplam RNA'yı üç gruptan da ayır.
4. Toplam RNA'nın 1 μg'si ile ters transkripsiyon gerçekleştirin.
5. cDNA kullanarak, GAPDH'yi dahili kontrol olarak kullanarak gerçek zamanlı PCR gerçekleştirin (Tablo 1).
6. Amplicon ürün boyutunu agarose jel elektroforez (%2 v/v) ile doğrulayın.
   NOT: Epidermosfer kültürlerinin tam genom mikroarray analizi kullanılarak transkriptomik olarak profillenerek, toplam RNA'yı tek bir NHKc donörün kütle kültürlerinden ve aynı donörden karşılık gelen SD-NHKc'den izole edin, her biri altı kopya halinde.
7. En az 9,0 ile 9,1 arasında değişen RNA Bütünlük Numaraları (RIN) elde etmek için bir biyoanalyzer kullanarak RNA kalitesini değerlendirin.
8. Toplam RNA örneklerini yükselterek ve biyotinilasyon yaparak mikroarray deneyleri yapın.
9. T7 RNA polimeraz promotör serisi içeren NNN rastgele astarları kullanarak örnek başına toplam RNA'nın 100 ng'lik kısmını ds-cDNA'ya ters yazıya dökün.
10. RNA'yı yükseltmek için cDNA örneklerine T7 RNA polimeraz ekleyin, ardından RNA'yı ss-cDNA'ya kopyalayın. RNase H kullanarak fazla RNA'yı düşürün.
11. SscDNA moleküllerini parçala ve biotin ile etiketle.
12. Etiketli numuneleri 45 °C'de 16 saat boyunca yükseltin.
13. Bir hibridizasyon fırını ve yıkama ve leke kiti kullanarak numuneleri melezleştirin.
14. Melez dizileri yıkayın ve lekelendirin.
15. Sistem ve bilgisayar iş istasyonu kullanarak dizileri tarayın.
16. Dizi taramalarının tamamlanmasının ardından, chp dosyaları oluşturmak için kütüphane dosyası ve Sağlam Çok Keskin Analiz (RMA) algoritmasını kullanarak prob hücresi yoğunluğu (CEL) dosyalarını ifade konsolu yazılımına ve gen düzeyinde işleme alın.
17. Expression Console'daki veri kalitesini onayladıktan sonra, her bir prob için log2 ifade sinyallerini içeren CHP dosyalarını, varyansların tek yönlü konu analizi kullanarak hücre türüne özgü transkripsiyonel yanıtları analiz etmek için bir transkriptom analiz yazılımına aktarın.

8. SD-NHKc koloni oluşturma verimliliğinin değerlendirilmesi

1. Hücreler% 70-80 izdiah süresine ulaştığında plakalardan ortam aspirat. Hücreleri PBS 'de (4 °C) her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
2. Hücreleri 15 dakika boyunca 3 mL% 100 metanol (4 °C) ile sabitleyin. PBS'de her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
3. 30 dakika boyunca 3 mL%10 Giemsa'da leke hücreleri. PBS'de her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın. Hücrelerin gece boyunca kurumasına izin verin.
4. Ertesi gün koloni oluşumunu analiz edin ve elde edilen koloni sayısını ölçün

9. SD-NHKc popülasyonu iki katına çıkması

1. Pasaj SD-NHKc ve eski medyayı arzulayarak ve 2mL PBS'de hücreleri yıkayarak ilgili otolog 2D monolayer kültürleri. PBS'yi çıkarın ve yıkanmış hücrelere 2 mL% 0.25 Trypsin-EDTA ekleyin. 5 dakika boyunca veya tüm hücreler tamamen kopana kadar kuluçkaya yatır (37 °C, %5 CO_2,%95 nem).
2. Plakaya 2 mL Soya Trypsin Inhibitörü ekleyin ve hücreleri 15 mL'lik bir tüpe aktarın.
3. 5 dakika boyunca 250 x g'da santrifüj.
4. 12 mL KSFM-scm'de süpernatant ve resuspend peletini çıkarın.
5. Düşük yoğunluklu tohum hücreleri 1-2 x 10⁴ NHKc'yi tek tek 10 cm'lik yemeklere ayırır ve gece boyunca kuluçkaya yaslar (37 °C,_{%5 CO 2,}%95 nem).
6. Ertesi gün 8 mL KSMF-scm besleme plakaları. En az% 25 birleştiği zamana kadar her 4 günde bir besleyin, ardından her 2 günde bir besleyin.
7. Hücre proliferatif kapasitesi tükenene kadar 60 cm'lik yemeklerde 1:5 hücre geçişi. Trypan mavi boyama ile hücre canlılığını ölçün. Her pasajda popülasyon ikiye katlamalarını şu formülü kullanarak belirleyin: log (_{N/N 0}) / log2, burada N her pasajda elde edilen toplam hücre sayısını ve_{N 0} deneyin başlangıcında kaplanmış hücre sayısını temsil eder.

Sonuçlar

Cilt epidermosfer tahlilleri sırasında, NHKc kültürleri 96 kuyu plakasının agarose kaplı kuyularında tohumlanır (Şekil 1A). Küresel oluşturan hücreler 48 saat içinde kendi kendine toplanmalı. Otonom küresel oluşum, standart bir ters faz kontrastı mikroskobu kullanılarak 24 saat kadar erken bir sürede değerlendirilebilir. cilt epidermosfer oluşumu ve yeniden kaplama tahlil modeli epidermal doku yenilenmesinin çeşitli evreleri (Şekil 1B). ...

Tartışmalar

3D küresel kültür sistemlerinin kullanımı hücre saplığını değerlendirmede geniş bir faydaya sahiptir. Bu sistemlerin doku kök hücrelerinin zenginleştirilmesini artırdığı gösterilmiştir¹³, ancak insan epidermal kök hücrelerinin incelenmesi için yararları sınırlı olarak araştırılmıştır. Burada, 3D kültür tekniklerini kullanarak insan keratinosit kök hücrelerini zenginleştirmek için bir strateji açıklıyoruz. Bu sistemde, NHKc, KSFM-scm içeren agarose yatakl...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Affymetrix platform	Affymetrix		For microarray experiments
Affymetrix’s HuGene-2_0-st library file	Affymetrix		Process
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent		For microarray experiments
All Prep DNA/RNA Mini Kit	Qiagen	80204	Used for RNA isolation
Analysis Console Software version 3.0.0.466			analyze cell type specific transcriptional responses using one-way between-subject analysis of variance
BD FACSAria II flow cytometer	Beckman		For flow cytometry
Console Software version 3.0.0.466/Expression console Software	Affymetrix/Thermo Fisher Scientific		For confirming data quality
Cytokeratin 14	Santa Cruz Biotechnology	sc-53253	1:200 dilution
Dispase	Sigma-Aldrich	D4818	For cell media
FITC-conjugated anti-integrinα6	Abcam	ab30496	For FACS analysis
GeneChip Command Console 4.0 software	Affymetrix/Thermo Fisher Scientific		For confirming data quality
GeneChip Fluidics Stations 450 (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific)	Affymetrix/Thermo Fisher Scientific		For washing and staining of hybridized arrays
GeneChip HuGene 2.0 ST Arrays	Affymetrix/Thermo Fisher Scientific		For hybridization and amplifycation of total RNA
GeneChip Hybridization Oven 640	Thermo Fisher Scientific		For hybridization and amplifycation of total RNA | Amplify labeled samples
GeneChip Hybridization Wash, and Stain Kit (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific).	Affymetrix/Thermo Fisher Scientific		For washing and staining of hybridized arrays
GeneChip Scanner 3000 7G system	Affymetrix/Thermo Fisher Scientific		Scanning hybridized arrays
GeneChip WT PLUS Reagent Kit	Affymetrix/Thermo Fisher Scientific		For amplifycation of biotinylating total RNA
Human Basic Fibroblast Growth Factor (hFGF basic/FGF2)	Cell Signaling Technology	8910	For cell media
Human Epidermal Growth Factor (hEGF)	Cell Signaling Technology	8916	For cell media
Human Insulin	Millipore Sigma	9011-M	For cell media
iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad)	Bio-Rad	1708880	Used for RT-qPCR
iScript cDNA Synthesis Kit	Bio-Rad	1708890	Used for RT-qPCR
KSFM	ThermoFisher Scientific	17005041	Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin
KSFM-scm	ThermoFisher Scientific	17005042	Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin
MCDB 153-LB basal medium	Sigma-Aldrich	M7403	MCDB 153-LB basal media w/ HEPES buffer
NEST Scientific 1-Well Cell Culture Chamber Slide, BLACK Walls on Glass Slide, 6/PK, 12/CS	Stellar Scientific	NST230111	For immunostaining
P63	Thermo Scientific	703809	1:200 dilution
PE-conjugated anti-EGFR ( San Jose, CA; catalog number )	BD Pharmingen	555997	For FACS analysis
pMSCV-IRES-EGFP plasmid vector	Addgene	20672	For transfection
Promega TransFast kit	Promega	E2431	For transfection
Qiagen RNeasy Plus Micro Kit	Qiagen		For microarray experiments
Thermo Scientific™ Sterile Single Use Vacuum Filter Units	Thermo Scientific	09-740-63D	For cell media
Zeiss Axionvert 135 fluorescence microscope	Zeiss		Use with Axiovision Rel. 4.5 software