Etablierung eines epidermalen Sphäroidkultursystems mit hohem Durchsatz zur Modellierung der Plastizität von Keratinozyten-Stammzellen

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur systematischen Kultivierung epidermaler Sphäroide in 3D-Suspensionskultur. Dieses Protokoll hat weitreichende Anwendungen für den Einsatz in einer Vielzahl von epithelialen Gewebetypen und für die Modellierung mehrerer menschlicher Krankheiten und Zustände.

Zusammenfassung

Epitheliale Dysregulation ist ein Knoten für eine Vielzahl von menschlichen Zuständen und Beschwerden, einschließlich chronischer Wunden, Entzündungen und über 80% aller menschlichen Krebsarten. Als Auskleidungsgewebe ist das Hautepithel oft Verletzungen ausgesetzt und hat sich evolutionär angepasst, indem es die zelluläre Plastizität erworben hat, die zur Reparatur von geschädigtem Gewebe erforderlich ist. Im Laufe der Jahre wurden mehrere Anstrengungen unternommen, um die epitheliale Plastizität mit in vitro und ex vivo zellbasierten Modellen zu untersuchen. Diese Bemühungen waren jedoch in ihrer Fähigkeit, die verschiedenen Phasen der Plastizität von Epithelzellen zu rekapitulieren, begrenzt. Wir beschreiben hier ein Protokoll zur Erzeugung von 3D-epidermalen Sphäroiden und epidermalen Sphäroidzellen aus primären neonatalen menschlichen Keratinozyten. Dieses Protokoll beschreibt die Fähigkeit epidermaler Sphäroidkulturen, verschiedene Stadien der generativen Plastizität von Keratinozytenfunktionalität funktionell zu modellieren, und zeigt, dass die epidermale Sphäroid-Neubeschichtung heterogene normale menschliche Keratinozytenkulturen (NHKc) für integrinα6^hi/EGFR^lo Keratinozyten-Subpopulationen mit verbesserten stammähnlichen Eigenschaften anreichern kann. Unser Bericht beschreibt die Entwicklung und Aufrechterhaltung eines Hochdurchsatzsystems zur Untersuchung der Plastizität der Hautkeratinozyten und der epidermalen Regeneration.

Einleitung

Das geschichtete Epithel von Säugetieren ist die komplexeste Epithelarchitektur in allen lebenden Systemen und ist am häufigsten Schäden und Verletzungen ausgesetzt. Als Schutzgewebe hat sich das geschichtete Epithel entwickelt, um eine komplexe und effektive Gewebeschadensreaktion zu erzeugen. Bei Verletzungen müssen diese Zellen Linienplastizitätsprogramme aktivieren, die es ihnen ermöglichen, an die verletzte Stelle zu wandern und die Reparatur^1,2,3durchzuführen . Diese facettenreiche Reaktion erfolgt in mehreren aufeinanderfolgenden Schritten, die noch wenig verstanden werden.

Ein großes Hindernis bei der Untersuchung des komplizierten Prozesses der epithelialen Regeneration liegt im Mangel an Hochdurchsatzmodellsystemen, die dynamische zelluläre Aktivitäten in definierten Stadien der Zellregeneration erfassen können. Während In-vivo-Mausmodelle relevante Einblicke in die Wundheilung bieten und den menschlichen Regenerationsprozess am ehesten rekapitulieren, erfordert ihre Entwicklung mühsame Anstrengungen und erhebliche Kosten, was ihre Durchsatzkapazität einschränkt. Es besteht daher ein kritischer Bedarf an der Etablierung von Systemen, die eine funktionelle Untersuchung der Regeneration von menschlichem Epithelgewebe im Hochdurchsatzbereich ermöglichen.

In den letzten Jahren wurden mehrere Versuche unternommen, die Herausforderung der Skalierbarkeit zu meistern. Dies zeigt sich in der großen Ausweitung innovativer zellbasierter In-vitro- und Ex-vivo-Modelle, die den regenerativen In-vivo-Kontext genau nachahmen. Dazu gehören Fortschritte bei Organ-on-Chip⁴, Sphäroid⁵, Organoid⁶und organotypischen Kulturen⁷. Diese zellbasierten 3D-Systeme bieten jeweils einzigartige Vorteile und stellen unterschiedliche experimentelle Einschränkungen dar. Bis heute ist die Sphäroidkultur das kostengünstigste und am weitesten verbreitete 3D-Zellkulturmodell. Und während mehrere Berichte darauf hingewiesen haben, dass Sphäroidkulturen verwendet werden können, um Hautstammzelleigenschaften zu untersuchen, wurden diese Studien größtenteils mit tierischem Gewebe^8,9oder mit dermalen Fibroblasten¹⁰durchgeführt, wobei praktisch keine Berichte die regenerativen Eigenschaften menschlicher epidermaler Sphäroidkulturen gründlich charakterisieren. In diesem Protokoll beschreiben wir die funktionelle Entwicklung, Kultur und Aufrechterhaltung epidermaler Sphäroidkulturen aus normalen menschlichen Keratinozyten (NHKc). Wir beschreiben auch den Nutzen dieses Systems, um die sequentiellen Phasen der epidermalen Regeneration und der Plastizität von Keratinozytenstammzellen in vitro zu modellieren.

Protokoll

Das Protokoll für die Sammlung und Handhabung von Hautproben und die Isolierung menschlicher Keratinozyten wurde von der University of South Carolina (UofSC) IRB überprüft und als "Forschung ohne menschliche Probanden" eingestuft, da die Vorhautproben chirurgische Rückwürfe waren, die bei routinemäßigen chirurgischen Eingriffen (Beschneidung von Neugeborenen) produziert wurden und völlig frei von identifizierenden Informationen waren. Das Protokoll wurde auch regelmäßig vom UofSC-Ausschuss für biologische Sicherheit überprüft und genehmigt, und das gesamte Laborpersonal wurde einer Laborschulung unterzogen. Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Sicherheits- und Ethikstandards von UofSC durchgeführt.

1. Isolierung und Kultur menschlicher Keratinozyten aus neonatalem Vorhautgewebe

1. Bereiten Sie das Waschmedium vor, indem Sie 0,1 M HEPES-Puffer auf 500 ml KSFM-Medium hinzufügen und auf einen pH-Wert von 7,2 einstellen. Medium in einem 500 mL Vakuumfilter (0,22 μm Porengröße) sterilisieren. MCDB 153-LB Basalmedium kann auch als alternative Waschlösung anstelle von KSFM verwendet werden.
2. Waschen Sie in einer Laminar-Flow-Haube die neonatale Vorhaut mit 5 ml Waschmedium in einem 50 ml konischen Rohr. Wiederholen Sie diesen Vorgang zweimal.
3. Die gewaschene Vorhaut in eine sterile Petrischale geben. Kratzen Sie mit Skalpell und Einer Zette Fett- und loses Bindegewebe von der Hautschicht ab. Vorhaut mit 5 mL Waschmedium in einem 50 mL konischen Röhrchen nachspülen.
4. Legen Sie die Vorhautepidermis mit der Seite nach oben in eine 6-Well-Platte, die 2 ml Dispase-Enzym enthält, das in Waschmedien (50 U / ml) verdünnt ist.
5. Die Platte für 4 Stunden in einen Inkubator geben (37 °C, 5% CO_2,95% Luftfeuchtigkeit).
6. Die Vorhaut aus dem Inkubator entfernen und unter sterilen Bedingungen in eine Petrischale überführen. Trennen Sie mit einer Feinspitzenzette die Epidermis von der Dermisschicht.
7. Legen Sie die Epidermis in ein 15 ml konisches Röhrchen mit 2 ml 0,25% Trypsin-EDTA. Mit einer 5 mL serologischen Pipett die schwimmende Epidermis mechanisch zerkleinern. 15 min bei 37 °C mit periodischem Wirbeln für 5 s alle 5 min inkubieren.
8. Nach der Inkubation 2 ml Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor hinzufügen und durch Pipettieren mischen, um das Trypsin zu neutralisieren.
9. Zentrifugenzellsuspension für 2 min bei 450 x gund dann für 8 min bei 250 x g.
10. Entfernen Sie schwimmende Ablagerungen mit einer Zette und achten Sie darauf, das Zellpellet nicht zu entfernen. Überstand vorsichtig aus dem Zellpellet absaugen.
11. Pellet in 12 mL komplettem KSFM-scm Medium und Teller in einer 10-cm-Schüssel resuspendieren. Inkubationsschale über Nacht (37 °C, 5% CO_2,95% Luftfeuchtigkeit).
12. Am nächsten Tag das Medium mit einer Ansaugpipette entfernen und durch 12 ml komplettes KSFM-scm ersetzen. Wiederholen Sie dies an den Tagen 4 und 7.
13. Um ein optimales Wachstum normaler menschlicher Keratinozytenkulturen (NHKc) aufrechtzuerhalten, passage Zellen 1:5 am Tag 10, um zu verhindern, dass Zellen mehr als 80% Konfluenz erreichen.

2. Erzeugung von Hautepidermosphärenkulturen in vitro

1. Bereiten Sie eine 5% ige Agarosemischung vor, indem Sie 2,5 g Agarose zu 50 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in einer 50 ml Glasflasche hinzufügen. Autoklavflasche unter Flüssigkeitskreislauf. Auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
2. Zur Zubereitung der Platten die gekühlte Glasflasche mit Agaroselösung in ein 1 L Kunststoffbecherglas geben, das mit 200 ml entionisiertem Wasser (dH₂O) gefüllt ist. Agarose-Mischung in einer Mikrowelle in Forschungsqualität bis zu 2 Minuten schmelzen und das Agar alle 60 s mischen, indem Sie die Flasche vorsichtig von Einer Seite zur anderen neigen.
   ACHTUNG: Das Schmelzen von Agar in der Mikrowelle führt dazu, dass der Kolbenbehälter extrem heiß wird, was zu einem Druckaufbau führt. Lösen Sie Druckaufbau alle 30 s. Tragen Sie geeignete Schutzausrüstung, um Verletzungen zu vermeiden.
3. 3 mL geschmolzene 5% Agarose zu 12 mL KSFM-scm vorgewärmt auf 42 °C für eine Endkonzentration von 1% Agarose (wt/vol) geben.
   Optional: Die serologischen Pipetten und Pipettenspitzen vorwärmen, um eine vorzeitige Polymerisation des weichen Agars zu verhindern.
4. Schnell 200 μL der 1%igen Agarmischung mit einem Mehrkanalpipettor in einzelne Vertiefungen einer 96-Well-Rundbodenplatte pipettieren (Abbildung 1A). Lassen Sie die Platte in steriler Umgebung bei 25 °C für 4 h, damit Agarose vollständig polymerisieren kann.
   HINWEIS: Das Experimentieren kann hier gestoppt und am nächsten Tag fortgesetzt werden. Polymerisierte Agaroseplatten können bei 37 °C bis zu 24 h oder bei 4 °C für bis zu 48 h gehalten werden, wenn sie mit Parafilmwickel versiegelt werden. Platte vor Gebrauch mindestens 1 h in einem befeuchteten Inkubator auf 37 °C erwärmen.
5. Passage sphäroidbildendes NHKc durch Ansaugen von Medien und Waschzellen in 2 ml PBS. Saugen Sie PBS an und fügen Sie 2 ml 0,25% Trypsin-EDTA zu den gewaschenen Zellen hinzu. 5 min bei 37 °C oder bis sich alle Zellen vollständig lösen, inkubieren. Fügen Sie 2 ml Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor auf die Platte hinzu und waschen Sie die Zellen von der Platte in ein 15-ml-Röhrchen ab. Zentrifuge bei 250 x g für 5 min.
6. Resuspend pellet in 1 mL of PBS. Quantifizieren Sie die Zelllebensfähigkeit mit Trypan-Blaufärbung und einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler.
7. Aliquot 2 x 10⁴ NHKc in 100 μL KSFM-scm und Insäen in einzelne Vertiefungen der zuvor präparierten 96-Well-Rundbodenplatte. Inkubationsplatte über Nacht (37 °C, 5% CO_2,95% Luftfeuchtigkeit).
8. Analysieren Sie mit einem invertierten Phasenkontrastmikroskop die Aussaat gut auf Epidermosphärenbildung.
   HINWEIS: Menschliche Epidermosphären aus normalen menschlichen Keratinozyten können in 3D-Suspensionskultur bis zu 96 h lebensfähig bleiben, wenn auch mit erheblicher Abnahme der Zelllebensfähigkeit (Abbildung 2).

3. Epidermaler Sphäroid-Re-Plating-Assay

1. 24-48 h nach der 3D-Epidermosphärenbildung 4 ml vorgewärmtes KSFM-scm in eine 6 cm große Schüssel geben. Verwenden Sie eine breite 1 mL Pipettenspitze, um ein einzelnes Sphäroid auf die Platte zu übertragen und sicherzustellen, dass es nicht auseinanderbricht. Alternativ können Sie eine 1 mL Pipettenspitze mit einer sterilen Rasierklinge verbreitern, um die Spitze zu schneiden.
2. Inkubieren Sie die Platte über Nacht (37 °C, 5% CO_2,95% Luftfeuchtigkeit).
3. Analysieren Sie gesätes Sphäroid auf Befestigung am Boden der Platte und beobachten Sie die Vermehrung von Zellen mit einem invertierten Phasenkontrastmikroskop (Abbildung 3). Die Zellen alle 96 h füttern, indem Sie vorsichtig 2 ml des Mediums in der Platte entfernen und langsam 2 ml frisches KSFM-scm-Medium auf die Platte geben.
4. Passage sphäroid-abgeleitete (SD) NHKc, sobald sie 70-80% Konfluenz erreicht haben und mit dem Assay der Wahl fortfahren. Überwachen Sie SD-NHKc häufig, um zu verhindern, dass Zellen in Kultur die volle Konfluenz erreichen, da dies zu vorzeitiger Differenzierung und Zellwachstumsstillstand führt (Abbildung 3E-F).
5. Der epidermale Sphäroid-Replating-Assay modelliert die Keratinozyten-vermittelte Wundreparatur, indem er jede der wichtigsten sequenziellen Phasen der epidermalen regenerativen Plastizität erfasst: a) homöostatische Aufrechterhaltung, b) Differenzierungsstopp/-umkehrung c) Mobilität der Stresslinie und d) Gewebewiederherstellung (Abbildung 1B; Tabelle 2). Dieser Assay kann auch verwendet werden, um Zellpopulationen für organotypische Floßkulturen herzustellen oder HPV-vermittelte Neoplasie zu^modellieren,wie in unserer vorherigen Arbeit ¹¹,¹²gezeigt.

4.3D Fluoreszenzzell-Tracking

1. In einer 6 cm großen Schüssel transfizieren Sie sphäroide bildende 2D-Monoschicht-NHKc-Kulturen mit 1 μg pMSCV-IRES-EGFP-Plasmidvektor, der das Enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP)-Gen trägt. Inkubationsplatte über Nacht (37 °C, 5% CO_2,95% Luftfeuchtigkeit) Mikroskop (Abbildung 4A).
   HINWEIS: Es ist wichtig, dass die Transfektion unter serumfreien antibiotikafreien Bedingungen abgeschlossen wird.
2. Ohne die Transfektionsmischung zu entfernen, fügen Sie 2 ml vorgewärmtes KSFM-scm zu den Zellen hinzu. Inkubationsplatte über Nacht (37 °C, 5% CO_2,95% Luftfeuchtigkeit).
3. Aspiratieren Sie alle Transfektionsmedien von Platten- und Zuführzellen mit 3 mL vorgewärmtem KSFM-scm. Beurteilen Sie das Vorhandensein von EGFP-exprimierenden Zellen unter dem FITC-Kanal eines Fluoreszenzmikroskops.
4. Passage und Aussaat von 2 x^{10 4} EGFP-transfizierten Zellen in einzelne Vertiefungen einer zuvor präparierten 96-Well-Rundbodenplatte. Inkubationsplatte über Nacht (37 °C, 5% CO_2,95% Luftfeuchtigkeit). Visualisieren und überwachen Sie die Bewegung der^{EGFP-Pos-Sphäroidzellen} unter dem FITC-Kanal eines Fluoreszenzmikroskops ( Abbildung4B-C).
5. 24 h nach dem Plattieren 3 mL vorgewärmtes KSFM-scm in eine 6 cm große Schüssel geben. Verwenden Sie eine breite 1 mL Pipettenspitze, um ein einzelnes Sphäroid auf die Platte zu übertragen und sicherzustellen, dass es nicht auseinanderbricht. Inkubationsplatte über Nacht (37 °C, 5% CO_2,95% Luftfeuchtigkeit).
6. Beobachten und analysieren Sie sich ausbreitende SD-NHKc^EGFP mit einem Fluoreszenzmikroskop. Die Zellen alle 96 h füttern, indem Sie vorsichtig 2 ml des Mediums in der Platte entfernen und langsam 2 ml frisches KSFM-scm-Medium auf die Platte geben.
7. Ernten Sie SD-NHKC^EGFP für FACS-Isolierung oder Assays Ihrer Wahl.

5. Charakterisierung von Sphäroid-abgeleiteten (SD) Subpopulationen durch FACS

1. Passage SD-NHKc und entsprechende autologe 2D-Monolayerkulturen durch Absaugen alter Medien und Waschzellen in 2 mL PBS. Entfernen Sie PBS und fügen Sie 2 ml 0,25% Trypsin-EDTA zu den gewaschenen Zellen hinzu. Bei 37 °C für 5 min oder bis sich alle Zellen vollständig lösen, inkubieren.
2. Fügen Sie 2 ml Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor zur Platte hinzu und übertragen Sie die Zellen in ein 15-ml-Röhrchen. Zentrifuge bei 250 x g für 5 min.
3. Pellets in 1 ml PBS resuspendieren. Quantifizieren Sie die Zelllebensfähigkeit mit Trypanblau und einem automatisierten Zellzähler des Hämozytometers.
4. Aliquot 100 μL mit 0,1-4 x 10⁶ NHKc-Zellen bis 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen. Platzieren Sie die Röhre auf Eis in einer dunklen Umgebung, die durch das Ausschalten heller Lichter in der laminaren Motorhaube entsteht.
5. Fügen Sie 2 μL FITC-konjugiertes Anti-Integrinα6 und 2 μL PE-konjugiertes Anti-EGFR in Röhrchen hinzu, um eine 1:50-Verdünnung zu erreichen. Bereiten Sie ein Röhrchen ohne Antikörper vor, das als ungefärbte Kontrolle dient. Schläuche auf Eis im Dunkeln oder bei 4 °C für 30 min inkubieren. Die Verwendung von Perlen oder einer Haut-SCC-Linie kann als Positivkontrolle dienen, da Haut-SCC-Zellen erhöhte Integrinα6- und EGFR-Spiegel exprimieren.
6. Führen Sie eine Durchflusszytometrie-Analyse mit einem Durchflusszytometer Ihrer Wahl durch, das geeignete Laser enthält.
7. Verwenden Sie die Negativ- und Positivkontrollen, um Tore einzurichten. Sortieren Sie die Subpopulation der integrinα6^hi/EGFR^lo Zellen; dies ist die epidermale Stammzellfraktion. Integrinα6^hi/EGFR^hi Zellen sind die proliferative Vorläuferzellfraktion. Die integrinα6^lo/EGFR^hi Zellen sind die gebundene Vorläuferzellfraktion (Abbildung 4D). Sortier-FACS-Röhrchen sollten mindestens 1 ml eiskaltes KSFM-scm enthalten.
8. Testen Sie die proliferative Kapazität sortierter Zellsubpopulationen, indem Sie den Inhalt der jeweiligen Sortierröhrchen in ein konisches 15-ml-Röhrchen übertragen, das das 10-fache des Volumens sortierter Zellen in PBS enthält. HINWEIS: Es ist wichtig, alle am Rand befestigten Zellen zu entfernen, indem Sie die Wand der sortierenden FACS-Röhrchen mehrmals pipettieren, da Keratinozyten dort oft haften können.
9. Zentrifuge 15 mL Röhrchen bei 250 x g für 5 min. Überstand entfernen und Pellet in 12 mL KSFM-scm resuspendieren. Die resuspendierten Zellen in eine 6 cm Platte geben und über Nacht inkubieren (37 °C, 5% CO_2,95% Luftfeuchtigkeit).
10. Am nächsten Tag Medien in Platten entfernen und 8 mL vorgewärmtes KSFM-scm hinzufügen. Bei 37 °C, 5% CO_2,95% Luftfeuchtigkeit inkubieren. Zellen alle 3 Tage mit 12 ml Medium erneut füttern, bis 70-80% konfluent sind(Abbildung 4E).

6. Immunfluoreszenz und Färbung von Epidermosphären für basale Stammzellmarker

1. Übertragen Sie Epidermosphären auf Decklippen, die mit Polylysin beschichtet sind. Lassen Sie SD-NHKc sich ausbreiten, bis 75% konfluent sind.
2. Waschen Sie die Zellen zweimal in PBS (4 °C) für jeweils 5 min.
3. Fixieren Sie die Zellen mit 4% Paraformaldehyd (PFA) für 20 min bei Raumtemperatur.
4. Permeabilisieren Sie Zellen mit 0,5% Triton X-100 in 1% Glycin. Mit 0,5% BSA und 5% Ziegenserum für 30 min bei Raumtemperatur blockieren.
5. Proben mit Antikörpern gegen P63 (1:200) und Cytokeratin 14 (1:200) in Blocklösung über Nacht bei 4 °C inkubieren.
6. Dreimal mit PBS (4 °C) mit Tween 20 (PBST) waschen, gefolgt von der Inkubation mit FITC- und Alexa 568-konjugierten sekundären Antikörpern (1:1000 Verdünnung).
7. Färben Sie Kerne mit 4', 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) (1:5000 Verdünnung) vor der Montage der Zellen.
8. Beobachten Sie Zellen mit einem fluoreszationsfähigen Mikroskop mit FITC- und PE-Laserlinien (Abbildung 4F).

7. Transkriptionelle Analyse von Epidermosphärenkulturen

1. Richten Sie dreifache Platten von NHKc-Kulturen mit niedriger Passage ein, um RNA zu isolieren, die aus Monolayer-, Sphäroid- und Sphäroid-abgeleiteten Kulturen aus derselben autologen Zelllinie stammen können.
2. Pool 3-5 entsprechende Epidermosphären in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Eigen- und 2D-Monolayer-Kulturen separat ernten.
3. Isolieren Sie die Gesamt-RNA aus allen drei Gruppen.
4. Führen Sie eine umgekehrte Transkription mit 1 μg Gesamt-RNA durch.
5. Führen Sie mit cDNA eine Echtzeit-PCR durch, wobei GAPDH als interne Kontrolle verwendet wird (Tabelle 1).
6. Validierung der Amplicon-Produktgröße durch Agarosegelelektrophorese (2% v/v).
   HINWEIS: Für die transkriptomische Profilierung von Epidermosphärenkulturen mittels Ganzgenom-Microarray-Analyse isolieren Sie die Gesamt-RNA aus Massenkulturen eines einzelnen NHKc-Spenders und der entsprechenden SD-NHKc desselben Spenders in jeweils sechs Replikaten.
7. Bewerten Sie die RNA-Qualität mit einem Bioanalysator, um RNA-Integritätszahlen (RIN) von mindestens 9,0 bis 9,1 zu erreichen.
8. Führen Sie Microarray-Experimente durch, indem Sie Gesamt-RNA-Proben amplifizieren und biotinylieren.
9. Transkribieren Sie 100 ng der Gesamt-RNA pro Probe in ds-cDNA mit NNN-Zufallsprimern, die eine T7-RNA-Polymerase-Promotorsequenz enthalten.
10. Fügen Sie T7-RNA-Polymerase zu cDNA-Proben hinzu, um RNA zu amplifizieren, und kopieren Sie dann RNA in ss-cDNA. Abbau überschüssiger RNA durch Verwendung von RNase H.
11. Fragmentieren Sie sscDNA-Moleküle und kennzeichnen Sie sie mit Biotin.
12. Markierte Proben 16 h bei 45 °C verstärken.
13. Hybridisieren Sie Proben mit einem Hybridisierungsofen und einem Wasch- und Fleckenkit.
14. Waschen und färben Sie hybridisierte Arrays.
15. Scannen Sie Arrays mit einem System und einer Computer-Workstation.
16. Importieren Sie nach Abschluss der Array-Scans CEL-Dateien (Probe Cell Intensity) in die Expressionskonsolensoftware und verarbeiten Sie sie auf Genebene mithilfe von Bibliotheksdateien und RMA-Algorithmen (Robust Multichip Analysis), um KWK-Dateien zu generieren.
17. Nachdem Sie die Datenqualität in der Expression Console bestätigt haben, importieren Sie KWK-Dateien mit log2-Expressionssignalen für jede Sonde in eine Transkriptomanalysesoftware, um zelltypspezifische transkriptionelle Antworten mithilfe einer einseitigen Varianzanalyse zwischen den Probanden zu analysieren.

8. Bewertung der SD-NHKc-Koloniebildungseffizienz

1. Saugen Sie Medien aus Platten ab, wenn die Zellen eine Konfluenz von 70-80% erreichen. Waschen Sie die Zellen dreimal in PBS (4 °C) für jeweils 5 min.
2. Fixieren Sie Zellen mit 3 mL 100% Methanol (4 °C) für 15 min. Dreimal in PBS für jeweils 5 min waschen.
3. Färbe Zellen in 3 ml 10% Giemsa für 30 min. Dreimal in PBS für jeweils 5 min waschen. Lassen Sie die Zellen über Nacht an der Luft trocknen.
4. Analysieren Sie die Koloniebildung am nächsten Tag und quantifizieren Sie die Anzahl der erhaltenen Kolonien

9. Bestimmen Sie die Verdopplung der SD-NHKc-Population

1. Passage SD-NHKc und entsprechende autologe 2D-Monolayer-Kulturen durch Absaugen alter Medien und Waschzellen in 2mL PBS. PbS entfernen und 2 ml 0,25% Trypsin-EDTA zu den gewaschenen Zellen hinzufügen. 5 min oder bis sich alle Zellen vollständig lösen (37 °C, 5% CO_2,95% Luftfeuchtigkeit) inkubieren.
2. Fügen Sie 2 ml Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor zur Platte hinzu und übertragen Sie die Zellen in ein 15-ml-Röhrchen.
3. Zentrifuge bei 250 x g für 5 min.
4. Entfernen Sie den Überstand und resuspend Pellet in 12 mL KSFM-scm.
5. Samenzellen bei geringer Dichte 1-2 x 10⁴ NHKc in einzelne 10 cm Geschirr und über Nacht inkubieren (37 °C, 5% CO_2,95% Luftfeuchtigkeit).
6. Zuführplatten mit 8 mL KSMF-scm am Folgetag. Füttern Sie alle 4 Tage, bis mindestens 25% konfluent, dann füttern Sie alle 2 Tage.
7. Serielle Passage Zellen 1:5 in 60 cm Geschirr, bis die zellproliferative Kapazität erschöpft ist. Quantifizieren Sie die Zelllebensfähigkeit durch Trypanblaufärbung. Bestimmen Sie die Populationsverdopplungen an jeder Passage mit der Formel: log(N /_{N 0}) / log2, wobei N die Gesamtzellzahl darstellt, die bei jeder Passage erhalten wurde, und_{N 0} die Anzahl der zellen, die zu Beginn des Experiments plattiert wurden.

Ergebnisse

Während des Hautepidermosphärentests werden NHKc-Kulturen in Agarose-beschichteten Vertiefungen einer 96-Well-Platte ausgesät (Abbildung 1A). Sphäroidbildende Zellen sollten sich innerhalb von 48 Stunden selbst aggregieren. Die autonome Sphäroidbildung kann bereits nach 24 Stunden mit einem Standard-Invertierten Phasenkontrastmikroskop beurteilt werden. Hautepidermosphärenbildung und Re-Plating-Assay modellieren verschiedene Phasen der epidermalen Geweberegeneration (

Diskussion

Die Verwendung von 3D-Sphäroidkultursystemen hat einen breiten Nutzen bei der Beurteilung der Zellstammhaftigkeit. Es wurde gezeigt, dass diese Systeme die Anreicherung von Gewebestammzellen^{verbessern 13}, aber ihr Nutzen für die Untersuchung menschlicher epidermaler Stammzellen wurde nur begrenzt untersucht. Hier beschreiben wir eine Strategie zur Anreicherung menschlicher Keratinozyten-Stammzellen mittels 3D-Kulturtechniken. In diesem System werden NHKc als selbstorganisierende mehrzellige Sph?...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Affymetrix platform	Affymetrix		For microarray experiments
Affymetrix’s HuGene-2_0-st library file	Affymetrix		Process
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent		For microarray experiments
All Prep DNA/RNA Mini Kit	Qiagen	80204	Used for RNA isolation
Analysis Console Software version 3.0.0.466			analyze cell type specific transcriptional responses using one-way between-subject analysis of variance
BD FACSAria II flow cytometer	Beckman		For flow cytometry
Console Software version 3.0.0.466/Expression console Software	Affymetrix/Thermo Fisher Scientific		For confirming data quality
Cytokeratin 14	Santa Cruz Biotechnology	sc-53253	1:200 dilution
Dispase	Sigma-Aldrich	D4818	For cell media
FITC-conjugated anti-integrinα6	Abcam	ab30496	For FACS analysis
GeneChip Command Console 4.0 software	Affymetrix/Thermo Fisher Scientific		For confirming data quality
GeneChip Fluidics Stations 450 (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific)	Affymetrix/Thermo Fisher Scientific		For washing and staining of hybridized arrays
GeneChip HuGene 2.0 ST Arrays	Affymetrix/Thermo Fisher Scientific		For hybridization and amplifycation of total RNA
GeneChip Hybridization Oven 640	Thermo Fisher Scientific		For hybridization and amplifycation of total RNA | Amplify labeled samples
GeneChip Hybridization Wash, and Stain Kit (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific).	Affymetrix/Thermo Fisher Scientific		For washing and staining of hybridized arrays
GeneChip Scanner 3000 7G system	Affymetrix/Thermo Fisher Scientific		Scanning hybridized arrays
GeneChip WT PLUS Reagent Kit	Affymetrix/Thermo Fisher Scientific		For amplifycation of biotinylating total RNA
Human Basic Fibroblast Growth Factor (hFGF basic/FGF2)	Cell Signaling Technology	8910	For cell media
Human Epidermal Growth Factor (hEGF)	Cell Signaling Technology	8916	For cell media
Human Insulin	Millipore Sigma	9011-M	For cell media
iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad)	Bio-Rad	1708880	Used for RT-qPCR
iScript cDNA Synthesis Kit	Bio-Rad	1708890	Used for RT-qPCR
KSFM	ThermoFisher Scientific	17005041	Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin
KSFM-scm	ThermoFisher Scientific	17005042	Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin
MCDB 153-LB basal medium	Sigma-Aldrich	M7403	MCDB 153-LB basal media w/ HEPES buffer
NEST Scientific 1-Well Cell Culture Chamber Slide, BLACK Walls on Glass Slide, 6/PK, 12/CS	Stellar Scientific	NST230111	For immunostaining
P63	Thermo Scientific	703809	1:200 dilution
PE-conjugated anti-EGFR ( San Jose, CA; catalog number )	BD Pharmingen	555997	For FACS analysis
pMSCV-IRES-EGFP plasmid vector	Addgene	20672	For transfection
Promega TransFast kit	Promega	E2431	For transfection
Qiagen RNeasy Plus Micro Kit	Qiagen		For microarray experiments
Thermo Scientific™ Sterile Single Use Vacuum Filter Units	Thermo Scientific	09-740-63D	For cell media
Zeiss Axionvert 135 fluorescence microscope	Zeiss		Use with Axiovision Rel. 4.5 software