Создание высокопроизводительной системы эпидермальных сфероидных культур для моделирования пластичности стволовых клеток кератиноцитов

Резюме

Здесь мы описываем протокол систематического культивирования эпидермальных сфероидов в 3D суспензии культуры. Этот протокол имеет широкий спектр применений для использования в различных типах эпителиальных тканей и для моделирования нескольких заболеваний и состояний человека.

Аннотация

Дисрегуляция эпителия является узлом для различных состояний и заболеваний человека, включая хронические раны, воспаление и более 80% всех видов рака человека. Как подкладочная ткань, эпителий кожи часто подвергается повреждению и эволюционно адаптируется, приобретая клеточную пластичность, необходимую для восстановления поврежденной ткани. На протяжении многих лет было предпринято несколько усилий по изучению эпителиальной пластичности с использованием моделей на основе клеток in vitro и ex vivo. Однако эти усилия были ограничены в их способности рекапитулировать различные фазы пластичности эпителиальных клеток. Здесь мы описываем протокол для генерации 3D-эпидермальных сфероидов и эпидермальных сфероидных клеток из первичных неонатальных кератиноцитов человека. Этот протокол описывает способность эпидермальных сфероидных культур функционально моделировать различные стадии генеративной пластичности кератиноцитов и демонстрирует, что эпидермальное сфероидное повторное покрытие может обогащать гетерогенные культуры нормальных кератиноцитов человека (NHKc) для интегринα6^hi/ EGFR^lo кератиноцитарных субпопуляций с улучшенными стволовыми характеристиками. В нашем отчете описывается разработка и поддержание высокопроизводительной системы для исследования пластичности кератиноцитов кожи и регенерации эпидермиса.

Введение

Стратифицированный эпителий млекопитающих является наиболее сложной эпителиальной архитектурой во всех живых системах и чаще всего подвержен повреждениям и травмам. Как защитная ткань, стратифицированный эпителий эволюционировал, чтобы генерировать сложную и эффективную реакцию на повреждение тканей. При травме эти клетки должны активировать программы пластичности линии, которые позволяют им мигрировать в поврежденный участок и проводить ремонт^1,2,3. Эта многогранная реакция происходит в несколько последовательных шагов, которые остаются плохо изученными.

Основное препятствие в изучении сложного процесса регенерации эпителия заключается в нехватке высокопроизводительных модельных систем, которые могут захватывать динамическую клеточную активность на определенных этапах регенерации клеток. В то время как мышиные модели in vivo предлагают соответствующее понимание заживления ран и наиболее точно повторяют регенеративный процесс человека, их разработка требует трудоемких усилий и значительных затрат, ограничивая их пропускную способность. Поэтому существует острая необходимость в создании систем, позволяющих проводить функциональное исследование регенерации эпителиальной ткани человека в масштабе высокой пропускной способности.

В последние годы было предпринято несколько попыток решить проблему масштабируемости. Это видно через значительное расширение инновационных моделей на основе клеток in vitro и ex vivo, которые близко имитируют регенеративный контекст in vivo. Это включает в себя достижения в области органа на чипе^4,сфероида^5,органоида⁶и органотипических культур^7. Каждая из этих 3D-систем на основе ячеек предлагает уникальные преимущества и представляет собой явные экспериментальные ограничения. На сегодняшний день сфероидная культура остается наиболее экономически эффективной и широко используемой моделью 3D-культуры клеток. И хотя в нескольких отчетах указывалось, что сфероидные культуры могут быть использованы для изучения характеристик стволовых клеток кожи, эти исследования в основном проводились с тканями животных^8,9или с дермальными фибробластами^10,практически без отчетов, полностью характеризующих регенеративные свойства эпидермальных сфероидных культур человека. В этом протоколе мы подробно описываем функциональное развитие, культуру и поддержание эпидермальных сфероидных культур из нормальных кератиноцитов человека (NHKc). Мы также описываем полезность этой системы для моделирования последовательных фаз регенерации эпидермиса и пластичности стволовых клеток кератиноцитов in vitro.

протокол

Протокол сбора и обработки образцов кожи и выделения кератиноцитов человека был пересмотрен IRB Университета Южной Каролины (UofSC) и классифицирован как «исследование, не связанное с человеческими субъектами», поскольку образцы конечной плоти были хирургическими выбросами, полученными во время обычных хирургических процедур (обрезание новорожденных мальчиков), и были полностью лишены идентифицирующей информации. Протокол также рассматривался и утверждался Комитетом по биобезопасности UofSC на регулярной основе, и весь лабораторный персонал прошел лабораторную подготовку по биобезопасности. Все процедуры проводились в соответствии со стандартами безопасности и этики УОФСК.

1. Выделение и культивирование кератиноцитов человека из ткани неонатальной ткани конечной плоти

1. Подготовьте промывочную среду, добавив 0,1 M HEPES буфера к 500 мл среды KSFM и отрегулируйте его до рН 7,2. Стерилизуйте среду в вакуумном фильтре объемом 500 мл (размер пор 0,22 мкм). Базальная среда MCDB 153-LB также может быть использована в качестве альтернативного моющего раствора вместо KSFM.
2. В ламинарной проточной вытяжке промыть неонатальную плоть 5 мл моющих средств в конической трубке 50 мл. Повторите дважды.
3. Переложите промытую крайню в стерильную чашку Петри. С помощью скальпеля и щипцов соскоблите жировую и рыхлую соединительную ткань с дермального слоя. Промыть плоть 5 мл промывочной среды в конической трубке 50 мл.
4. Поместите эпидермис конечной плоти стороной вверх в 6-ямочную пластину, содержащую 2 мл фермента диспазы, разведенного в промывочной среде (50 Ед/мл).
5. Переложите плиту в инкубатор на 4 часа (37 °C, 5% CO_2,95% влажности).
6. Удалите крайнюю плоть из инкубатора и в стерильных условиях перенесите ее в чашку Петри. С помощью тонких щипцов отделите эпидермис от слоя дермы.
7. Поместите эпидермис в коническую трубку 15 мл, содержащую 2 мл 0,25% трипсина-ЭДТА. Используя серологическую пипетку 5 мл, механически раздавите плавающий эпидермис. Инкубировать в течение 15 мин при 37 °C с периодическим вихрем в течение 5 с каждые 5 мин.
8. После инкубации добавляют 2 мл ингибитора трипсина сои и смешивают путем пипетирования для нейтрализации трипсина.
9. Центрифужная клеточная суспензия в течение 2 мин при 450 х г,а затем в течение 8 мин при 250 х г.
10. Удаляйте плавающий мусор щипцами, стараясь не выбить ячейку гранулы. Осторожно аспирировать супернатант из ячейки гранулы.
11. Повторное суспендирование гранул в 12 мл полной среды KSFM-scm и тарелка в 10-сантиметровой посуде. Инкубировать блюдо на ночь (37 °C, 5% CO_2,95% влажность).
12. На следующий день удалите среду с помощью аспирирующей пипетки и замените 12 мл полной KSFM-scm. Повторите на 4 и 7 день.
13. Чтобы поддерживать оптимальный рост нормальных культур кератиноцитов человека (NHKc), проходим клетки 1:5 на 10-й день, чтобы предотвратить достижение клетками более 80% конфлюции.

2. Формирование культур эпидермосферы кожи in vitro

1. Приготовьте 5% смесь агарозы, добавив 2,5 г агарозы в 50 мл 1x фосфатного буферного физиологического раствора (PBS) в стеклянной бутылке емкостью 50 мл. Автоклавная бутылка в жидком цикле. Дайте остыть до комнатной температуры.
2. Для приготовления тарелок поместите охлажденную стеклянную бутылку, содержащую раствор агарозы, в пластиковый стакан объемом 1 л, наполненный деионизированной водой объемом 200 мл (dH₂O). Расплавляйте смесь агарозы в микроволновой печи исследовательского класса в течение 2 минут, перемешивая агар каждые 60 с, осторожно наклоняя бутылку из стороны в сторону.
   ВНИМАНИЕ: Плавление агара в микроволновой печи приведет к тому, что контейнер для колбы станет чрезвычайно горячим, что приведет к увеличению давления. Давление высвобождения нарастает каждые 30 с. Носите соответствующие защитные средства для предотвращения травм.
3. Добавьте 3 мл расплавленной 5% агарозы к 12 мл KSFM-scm предварительно расплавленного до 42 °C для конечной концентрации 1% агарозы (масс./об.).
   Дополнительно: предварительно разогрейте серологические пипетки и наконечники пипеток, чтобы предотвратить преждевременную полимеризацию мягкого агара.
4. Быстро пипетку 200 мкл 1% агара смешивают в отдельные скважины из 96-скважинной круглодонной плиты с помощью многоканального пипетка(рисунок 1А). Оставьте пластину в стерильной среде при 25 °C в течение 4 ч, чтобы агароза полностью полимеризовала.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперименты могут быть остановлены здесь и продолжены на следующий день. Полимеризованные агарозные пластины могут поддерживаться при 37 °C до 24 ч или при 4 °C в течение 48 ч при герметизации парапленочной пленкой. Нагревают пластину до 37 °С в увлажненный инкубатор не менее 1 ч перед применением.
5. Прохождение сфероидообразующих NHKc путем аспирации среды и промывки клеток в 2 мл PBS. Аспирировать PBS и добавить 2 мл 0,25% трипсина-ЭДТА в промытые клетки. Инкубировать в течение 5 мин при 37 °C или до полного отсоединения всех клеток. Добавьте 2 мл ингибитора трипсина сои в пластину и смойте клетки с пластины в трубку с 15 мл. Центрифуга при 250 х г в течение 5 мин.
6. Повторное суспендирование гранул в 1 мл PBS. Количественно оцените жизнеспособность клеток с помощью окрашивания трипановым синим цветом и гемоцитометра или автоматизированного счетчика клеток.
7. Аликвота 2 х 10⁴ NHKc в 100 мкл KSFM-scm и засеять в отдельные скважины из предварительно подготовленной 96-скважинной круглодонной плиты. Инкубационная плита на ночь (37 °C, 5% CO_2,95% влажность).
8. Используя инвертированный фазовый контрастный микроскоп, хорошо проанализируйте посев на формирование эпидермосферы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эпидермосферы человека из нормальных кератиноцитов человека могут оставаться жизнеспособными в культуре 3D-суспензии до 96 ч, хотя и со значительным снижением жизнеспособности клеток(рисунок 2).

3. Эпидермальный сфероидный анализ

1. Через 24-48 ч после формирования 3D эпидермосферы добавить 4 мл предварительно распохленного KSFM-scm в тарелку 6 см. Используйте широкий наконечник пипетки 1 мл для переноса одного сфероида на пластину, гарантируя, что она не разобьется. В качестве альтернативы, расширьте наконечник пипетки 1 мл, используя стерильное лезвие бритвы, чтобы разрезать наконечник.
2. Инкубировать плиту в течение ночи (37 °C, 5% CO_2,95% влажности).
3. Проанализируйте семенной сфероид для прикрепления к нижней части пластины и наблюдайте за размножением клеток с помощью инвертированного фазового контрастного микроскопа(рисунок 3). Подавая ячейки каждые 96 ч, осторожно удаляя 2 мл среды внутри пластины и медленно добавляя 2 мл свежей среды KSFM-scm в пластину.
4. Прохождение сфероидного происхождения (SD) NHKc, как только они достигают 70-80% слияния и продолжают с анализом по выбору. Часто контролируйте SD-NHKc, чтобы предотвратить достижение клетками полного слияния в культуре, поскольку это приводит к преждевременной дифференцировке и остановке роста клеток(рисунок 3E-F).
5. Эпидермальный сфероидный анализ моделирует кератиноцитарно-опосредованное восстановление раны путем захвата каждой из ключевых последовательных фаз регенеративной пластичности эпидермиса: а) гомеостатическое поддержание, б) дифференцировка остановки/обращения в) подвижность линии стресса и г) восстановление тканей(рисунок 1B); Таблица 2). Этот анализ также может быть использован для получения клеточных популяций для оловоорганических культур плотов или для моделирования ВПЧ-опосредопосредооченной неоплазии, как показано в нашей предыдущей работе ^11,12.

4.3D флуоресцентные клетки отслеживания

1. В 6-сантиметровой чашке трансфектируют сфероидообразующие 2D монослойные культуры NHKc с 1 мкг плазмидного вектора pMSCV-IRES-EGFP, несущего ген усиленного зеленого флуоресцентного белка (eGFP). Инкубировать пластинчатый на ночь (37 °C, 5% CO_2,95% влажности) микроскоп(рисунок 4A).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы трансфекция была завершена в условиях, не емких антибиотиков.
2. Не удаляя трансфекционную смесь, добавьте в ячейки 2 мл предварительно выгремленного KSFM-scm. Инкубационная плита на ночь (37 °C, 5% CO_2,95% влажность).
3. Аспирировать все трансфекционные среды из пластинчатых и питательных клеток 3 мл предварительно располагаемого KSFM-scm. Оцените наличие EGFP-экспрессирующих клеток под каналом FITC флуоресцентного микроскопа.
4. Прохождение и посев 2 х 10⁴ EGFP-трансфехтированных клеток в отдельные колодцы из предварительно подготовленной 96-скважинной круглодонной пластины. Инкубационная плита на ночь (37 °C, 5% CO_2,95% влажность). Визуализация и мониторинг движения сфероидных клеток EGFP под каналом FITC флуоресцентного микроскопа(рисунок 4B-C).
5. Через 24 ч после нанесения покрытия добавьте 3 мл предварительно распаленного KSFM-scm в блюдо 6 см. Используйте широкий наконечник пипетки 1 мл для переноса одного сфероида на пластину, гарантируя, что она не разобьется. Инкубационная плита на ночь (37 °C, 5% CO_2,95% влажность).
6. Наблюдение и анализ распространения SD-NHKc^EGFP с помощью флуоресцентного микроскопа. Подавая ячейки каждые 96 ч, осторожно удаляя 2 мл носителя внутри пластины и медленно добавляя 2 мл свежей среды KSFM-scm на пластину.
7. Сбор урожая SD-NHKC^EGFP для изоляции FACS или анализов по выбору.

5. Характеристика субпуллей, полученных из сфероидов (SD) с помощью FACS

1. Прохождение SD-NHKc и соответствующих аутологичных 2D монослойных культур путем аспирации старых сред и промывки клеток в 2 мл PBS. Удалите PBS и добавьте 2 мл 0,25% трипсина-ЭДТА в промытые клетки. Инкубировать при 37 °C в течение 5 мин или до полного отсоединения всех клеток.
2. Добавьте 2 мл ингибитора трипсина сои к пластине и перенесите клетки в трубку с 15 мл. Центрифуга при 250 х г в течение 5 мин.
3. Повторное суспендирование гранул в 1 мл PBS. Количественно оцените жизнеспособность клеток с помощью трипан-синего и автоматизированного счетчика клеток гемоцитометра.
4. Аликвот 100 мкл, содержащий 0,1-4 х^{10 6} nhKc клеток до 1,5 мл микроцентрифужных пробирок. Поместите трубку на лед в темной среде, созданной путем выключения яркого света внутри ламинарного капота.
5. Добавьте 2 мкл FITC-конъюгированного анти-интегринаα6 и 2 мкл PE-конъюгированного анти-EGFR в пробирки для достижения разведения 1:50. Подготовьте трубку без добавления антител, чтобы служить в качестве незапятнанный контроль. Инкубировать трубки на льду в темное время суток или при 4 °C в течение 30 мин. Использование бусин или линии SCC кожи может служить положительным контролем, так как клетки SCC кожи экспрессировали повышенные уровни интегринаα6 и EGFR.
6. Выполните анализ проточной цитометрии с использованием проточного цитометра по выбору, содержащего соответствующие лазеры.
7. Используйте отрицательные и позитивные элементы управления для установления ворот. Сортировка субпопуляции integrinα6^hi/EGFR^lo cells; это фракция эпидермальных стволовых клеток. Integrinα6^hi/ EGFR^hi клетки являются пролиферативной фракцией клеток-прородиторов. Интегринα6^lo/EGFR^hi клетки являются зафиксированной фракцией клеток-прародителя(рисунок 4D). Сортировочная трубка (трубы) FACS должна содержать не менее 1 мл ледяного KSFM-scm.
8. Тест на пролиферативную способность отсортированных клеточных субпопуляций путем переноса содержимого каждой соответствующей сортировочной трубки в коническую трубку объемом 15 мл, содержащую в 10 раз больше объема отсортированных клеток в PBS. ПРИМЕЧАНИЕ: Важно удалить все клетки, прикрепленные к ободу, путем пипетки стенки сортировочной трубки (трубок) FACS несколько раз, так как кератиноциты часто могут прилипать туда.
9. Центрифуга 15 мл в тубах по 250 х г в течение 5 мин. Удалите супернатант и повторно суспендировать гранулы в 12 мл KSFM-scm. Переложите повторно суспендированные ячейки в пластину размером 6 см и инкубируем в течение ночи (37 °C, 5% CO_2,95% влажности).
10. На следующий день удалите жижи в пластины и добавьте 8 мл предварительно подогретого KSFM-scm. Инкубировать при 37 °C, 5% CO_2,95% влажности. Повторно подавать клетки со средой 12 мл каждые 3 дня до 70-80% слияния(рисунок 4Е).

6. Иммунофлуоресценция и окрашивание эпидермосфер маркерами базальных стволовых клеток

1. Перенесите эпидермосферы на покровные листы, покрытые полилизином. Позвольте SD-NHKc распространяться до 75% слияния.
2. Промывайте ячейки дважды в PBS (4 °C) в течение 5 мин каждая.
3. Фиксируйте клетки 4% параформальдегидом (PFA) в течение 20 мин при комнатной температуре.
4. Пермеабилизируют клетки с 0,5% тритона X-100 в 1% глицина. Блокируйте с использованием 0,5% BSA и 5% козьей сыворотки в течение 30 мин при комнатной температуре.
5. Инкубировать образцы с антителами против Р63 (1:200) и цитокератина 14 (1:200) в блокирующем растворе на ночь при 4 °С.
6. Трижды промыть PBS (4 °C), содержащим Tween 20 (PBST), с последующим инкубацией с FITC- и Alexa 568-конъюгированных вторичных антител (разведение 1:1000).
7. Окрашивание ядер 4', 6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) (разведение 1:5000) перед установкой клеток.
8. Наблюдайте за клетками с помощью флуоресцентного микроскопа с лазерными линиями FITC и PE(рисунок 4F).

7. Транскрипционный анализ культур эпидермосферы

1. Установка тройных пластин низкопролетных культур NHKc для выделения РНК может быть из монослойных, сфероидных и сфероидных культур из одной и той же аутологиозной клеточной линии.
2. Пул 3-5 соответствующих эпидермосфер в 1,5 мл микроцентрифужной трубки. Отдельно собирают автологичные SD-NHKc и 2D монослойные культуры.
3. Изолируйте общую РНК из всех трех групп.
4. Выполняют обратную транскрипцию с 1 мкг общей РНК.
5. Используя кДНК, выполняют ПЦР в режиме реального времени, используя GAPDH в качестве внутреннего контроля(табл. 1).
6. Проверить размер продукта ампликона электрофорезом агарозного геля (2% v/v).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для транскриптомного профилирования культур эпидермосферы с использованием анализа микрочипов всего генома изолируйте общую РНК из массовых культур одного донора NHKc и соответствующих SD-NHKc от одного и того же донора в шести репликах каждая.
7. Оцените качество РНК с помощью биоанализатора для достижения показателей целостности РНК (RIN) в диапазоне от не менее 9,0 до 9,1.
8. Проводите эксперименты с микрочипами путем амплификации и биотинилирования общих образцов РНК.
9. Обратная транскрибирование 100 нг общей РНК на образец в ds-кДНК с использованием случайных праймеров NNN, содержащих последовательность промотора полимеразы РНК T7.
10. Добавьте РНК-полимеразу T7 в образцы кДНК для амплиации РНК, а затем скопируйте РНК в ss-кДНК. Разлагать избыток РНК с помощью РНКазы Н.
11. Фрагмент молекулы сцДНК и метка с биотином.
12. Усиливать маркированные образцы в течение 16 ч при 45 °C.
13. Гибридизируйте образцы с помощью гибридной печи и комплекта для стирки и окрашивания.
14. Мойка и окрашивание гибридизированных массивов.
15. Сканирование массивов с помощью системы и рабочей станции компьютера.
16. После завершения сканирования массива импортируйте файлы интенсивности зондовых клеток (CEL) в консольное программное обеспечение экспрессии и обрабатывайте на уровне генов файл с использованием библиотечного файла и алгоритма Robust Multichip Analysis (RMA) для создания файлов CHP.
17. После подтверждения качества данных в Expression Console импортируйте файлы CHP, содержащие сигналы экспрессии log2 для каждого зонда, в программное обеспечение для анализа транскриптома для анализа специфических для типа клеток транскрипционных ответов с использованием одностороннего анализа дисперсии между субъектами.

8. Оценка колониеобразующей эффективности SD-NHKc

1. Аспиратные среды из пластин, когда клетки достигают 70-80% слияния. Промывайте ячейки три раза в PBS (4 °C) в течение 5 мин каждая.
2. Зафиксируйте клетки 3 мл 100% метанола (4 °C) в течение 15 мин. Трижды вымыть в PBS по 5 мин каждый.
3. Окрашивание клеток в 3 мл 10% Гимса в течение 30 мин. Трижды вымыть в PBS по 5 мин каждый. Дайте клеткам высохнуть на воздухе в течение ночи.
4. Анализ формирования колоний на следующий день и количественная оценка количества полученных колоний

9. Определение удвоения популяции SD-NHKc

1. Прохождение SD-NHKc и соответствующих аутологичных 2D монослойных культур путем аспирации старых сред и промывки клеток в 2мл PBS. Удалите PBS и добавьте 2 мл 0,25% трипсина-ЭДТА в промытые клетки. Инкубировать в течение 5 мин или до полного отсоединения всех ячеек (37 °C, 5% CO_2,влажность 95%).
2. Добавьте 2 мл ингибитора трипсина сои к пластине и перенесите клетки в трубку с 15 мл.
3. Центрифуга при 250 х г в течение 5 мин.
4. Удалить супернатант и повторно суспендировали гранулы в 12 мл KSFM-scm.
5. Семенные ячейки при низкой плотности 1-2 х^{10 4} NHKc в отдельные 10 см блюда и инкубируют в течение ночи (37 °C, 5% CO_2,95% влажности).
6. Кормовые пластины с 8 мл KSMF-scm на следующий день. Кормят каждые 4 дня до 25% впадие, затем кормят каждые 2 дня.
7. Последовательно проходит клетки 1:5 в 60 см посуде до тех пор, пока пролиферативная способность клеток не будет исчерпана. Количественная оценка жизнеспособности клеток путем окрашивания трипан-синим цветом. Определите удвоение популяции при каждом прохождении по формуле: log(N/N₀) / log2, где N представляет общее число клеток, полученное при каждом прохождении, а N₀ представляет количество клеток, покрытых в начале эксперимента.

Результаты

Во время анализа эпидермосферы кожи культуры NHKc высевают в покрытые агарозой колодцы из 96-скважинной пластины(рисунок 1А). Сфероидообразующие клетки должны самоагрегироваться в течение 48 ч. Автономное образование сфероидов может быть оценено уже через 24 ч с помощью ста...

Обсуждение

Использование систем 3D-сфероидных культур имело широкую полезность при оценке стволовой анемии. Было продемонстрировано, что эти системы улучшают обогащение тканевых стволовых клеток^13,но их полезность для изучения эпидермальных стволовых клеток человека была ограничен...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Affymetrix platform	Affymetrix		For microarray experiments
Affymetrix’s HuGene-2_0-st library file	Affymetrix		Process
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent		For microarray experiments
All Prep DNA/RNA Mini Kit	Qiagen	80204	Used for RNA isolation
Analysis Console Software version 3.0.0.466			analyze cell type specific transcriptional responses using one-way between-subject analysis of variance
BD FACSAria II flow cytometer	Beckman		For flow cytometry
Console Software version 3.0.0.466/Expression console Software	Affymetrix/Thermo Fisher Scientific		For confirming data quality
Cytokeratin 14	Santa Cruz Biotechnology	sc-53253	1:200 dilution
Dispase	Sigma-Aldrich	D4818	For cell media
FITC-conjugated anti-integrinα6	Abcam	ab30496	For FACS analysis
GeneChip Command Console 4.0 software	Affymetrix/Thermo Fisher Scientific		For confirming data quality
GeneChip Fluidics Stations 450 (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific)	Affymetrix/Thermo Fisher Scientific		For washing and staining of hybridized arrays
GeneChip HuGene 2.0 ST Arrays	Affymetrix/Thermo Fisher Scientific		For hybridization and amplifycation of total RNA
GeneChip Hybridization Oven 640	Thermo Fisher Scientific		For hybridization and amplifycation of total RNA | Amplify labeled samples
GeneChip Hybridization Wash, and Stain Kit (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific).	Affymetrix/Thermo Fisher Scientific		For washing and staining of hybridized arrays
GeneChip Scanner 3000 7G system	Affymetrix/Thermo Fisher Scientific		Scanning hybridized arrays
GeneChip WT PLUS Reagent Kit	Affymetrix/Thermo Fisher Scientific		For amplifycation of biotinylating total RNA
Human Basic Fibroblast Growth Factor (hFGF basic/FGF2)	Cell Signaling Technology	8910	For cell media
Human Epidermal Growth Factor (hEGF)	Cell Signaling Technology	8916	For cell media
Human Insulin	Millipore Sigma	9011-M	For cell media
iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad)	Bio-Rad	1708880	Used for RT-qPCR
iScript cDNA Synthesis Kit	Bio-Rad	1708890	Used for RT-qPCR
KSFM	ThermoFisher Scientific	17005041	Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin
KSFM-scm	ThermoFisher Scientific	17005042	Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin
MCDB 153-LB basal medium	Sigma-Aldrich	M7403	MCDB 153-LB basal media w/ HEPES buffer
NEST Scientific 1-Well Cell Culture Chamber Slide, BLACK Walls on Glass Slide, 6/PK, 12/CS	Stellar Scientific	NST230111	For immunostaining
P63	Thermo Scientific	703809	1:200 dilution
PE-conjugated anti-EGFR ( San Jose, CA; catalog number )	BD Pharmingen	555997	For FACS analysis
pMSCV-IRES-EGFP plasmid vector	Addgene	20672	For transfection
Promega TransFast kit	Promega	E2431	For transfection
Qiagen RNeasy Plus Micro Kit	Qiagen		For microarray experiments
Thermo Scientific™ Sterile Single Use Vacuum Filter Units	Thermo Scientific	09-740-63D	For cell media
Zeiss Axionvert 135 fluorescence microscope	Zeiss		Use with Axiovision Rel. 4.5 software