Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا نحن نصف بروتوكول للزراعة المنهجية للشفرات البشرة في ثقافة التعليق ثلاثي الأبعاد. هذا البروتوكول له تطبيقات واسعة النطاق للاستخدام في مجموعة متنوعة من أنواع الأنسجة الظهارية ولنمذجة العديد من الأمراض والحالات البشرية.

Abstract

dysregulation الظهارية هي عقدة لمجموعة متنوعة من الحالات والأمراض البشرية، بما في ذلك الجرح المزمن، والالتهاب، وأكثر من 80٪ من جميع أنواع السرطان البشري. كما بطانة الأنسجة، وظهارة الجلد غالبا ما تكون عرضة للإصابة وتكييفها تطوريا عن طريق الحصول على اللدونة الخلوية اللازمة لإصلاح الأنسجة التالفة. على مر السنين، بذلت عدة جهود لدراسة اللدونة الظهارية باستخدام نماذج في المختبر وخلايا الجسم الحي السابق. ومع ذلك، كانت هذه الجهود محدودة في قدرتها على تلخيص المراحل المختلفة من اللدونة الخلية الظهارية. نحن نصف هنا بروتوكولا لتوليد كرويدات البشرة ثلاثية الأبعاد والخلايا المشتقة من البشرة المشتقة من خلايا القرنية البشرية الوليدية الأولية. يحدد هذا البروتوكول قدرة ثقافات كروية البشرة على نموذج مراحل متميزة وظيفيا من اللدونة التوليدية للكيراتينية ويوضح أن إعادة طلاء كروية البشرة يمكن أن تثري ثقافات الكيراتينيات البشرية غير المتجانسة (NHKc) ل integrinα6hi/EGFRlo keratinocyte subpopulations مع خصائص معززة تشبه الجذعية. يصف تقريرنا تطوير وصيانة نظام إنتاجية عالية لدراسة اللدونة الكيراتينية الجلدية وتجديد البشرة.

Introduction

الظهارة الطبقية الثديية هي البنية الظهارية الأكثر تعقيدا في جميع الأنظمة الحية وغالبا ما تكون عرضة للتلف والإصابة. كما النسيج الواقي، تطورت ظهارة طبقية لتوليد استجابة معقدة وفعالة تلف الأنسجة. عند الإصابة ، يجب على هذه الخلايا تنشيط برامج اللدونة النسب ، والتي تمكنها من الهجرة إلى الموقع المصاب وتنفيذ إصلاح1،2،3. تحدث هذه الاستجابة متعددة الأوجه في عدة خطوات متتابعة لا تزال غير مفهومة بشكل جيد.

وتكمن إحدى العقبات الرئيسية في دراسة العملية المعقدة للتجديد الظهاري في ندرة نظم نماذج الإنتاجية العالية التي يمكن أن تلتقط الأنشطة الخلوية الديناميكية في مراحل محددة من تجديد الخلايا. بينما في نماذج الماوس في الجسم الحي تقدم نظرة ثاقبة ذات الصلة في التئام الجروح وتلخيص عن كثب عملية تجديد الإنسان، وتطويرها تتطلب جهودا شاقة وتكلفة كبيرة، والحد من قدرتها الإنتاجية. ولذلك، هناك حاجة ماسة لإنشاء نظم تمكن من إجراء تحقيق وظيفي في تجديد الأنسجة الظهارية البشرية على نطاق عال من الإنتاجية.

وفي السنوات الأخيرة، بذلت عدة محاولات لمواجهة التحدي المتمثل في قابلية التوسع. وينظر إلى هذا من خلال التوسع الكبير في النماذج المبتكرة في المختبر وسابقا فيفو الخلية القائمة على أن تحاكي عن كثب في السياق التجديدي في الجسم الحي. وهذا يشمل التقدم في الجهاز على رقاقة4, كروية5, organoid6, والثقافات organotypic7. هذه الأنظمة القائمة على الخلايا ثلاثية الأبعاد تقدم كل مزايا فريدة من نوعها وتقدم قيودا تجريبية متميزة. حتى الآن، لا تزال ثقافة كروية النموذج الأكثر فعالية من حيث التكلفة واستخدامها على نطاق واسع ثقافة الخلايا ثلاثية الأبعاد. وبينما أشارت العديد من التقارير إلى أنه يمكن استخدام ثقافات كروية لدراسة خصائص الخلايا الجذعية للبشرة ، فقد أجريت هذه الدراسات إلى حد كبير مع الأنسجة الحيوانية8،9، أو مع الخلايا الليفية الجلدية10، مع عدم وجود تقارير تقريبا تميز بدقة الخصائص التجديدية للثقافات الكروية البشرة البشرية. في هذا البروتوكول نحن بالتفصيل التنمية الوظيفية، والثقافة، والحفاظ على الثقافات كروية البشرة من الخلايا القرنية البشرية العادية (NHKc). نحن نفس القدر من وصف فائدة هذا النظام لنموذج مراحل متتابعة من تجديد البشرة واللدونة الخلايا الجذعية keratinocyte في المختبر.

Protocol

وقد استعرضت جامعة كارولينا الجنوبية بروتوكول جمع ومعالجة عينات الجلد وعزل خلايا القرنية البشرية (UofSC) IRB وصنفت على أنها "أبحاث لا تشمل البشر"، حيث كانت عينات القلفة عبارة عن تخلص جراحي تم إنتاجه أثناء العمليات الجراحية الروتينية (ختان الأولاد حديثي الولادة) وكانت خالية تماما من معلومات تحديد. كما استعرضت لجنة السلامة البيولوجية التابعة للجنة السلامة البيولوجية التابعة للجنة الاتحاد ووافق عليها على أساس منتظم، وخضع جميع موظفي المختبر لتدريب على السلامة البيولوجية في المختبرات. وقد أجريت جميع الإجراءات وفقا لمعايير السلامة والأخلاق في الاتحاد.

1. عزل وزراعة الخلايا القرنية البشرية من أنسجة القلفة الوليدية

  1. إعداد المتوسطة غسل بإضافة 0.1 M HEPES العازلة إلى 500 مل من المتوسط KSFM وضبطه إلى درجة الحموضة من 7.2. تعقيم المتوسطة في مرشح فراغ 500 مل (0.22 ميكرومتر حجم المسام). MCDB 153-LB المتوسط القاعدية يمكن أيضا أن تستخدم كحل بديل غسيل بدلا من KSFM.
  2. في غطاء تدفق صفح، اغسل القلفة الوليدية ب 5 مل من وسائط الغسيل في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. كرر مرتين.
  3. نقل القلفة المغسولة إلى طبق بيتري معقم. باستخدام مشرط والملقط، كشط قبالة الأنسجة الضامة الدهنية وفضفاضة من طبقة الجلد. إعادة غسل القلفة مع 5 مل من وسائل الإعلام غسل في أنبوب مخروطي 50 مل.
  4. ضع جانب البشرة القلفة في لوحة من 6 آبار تحتوي على 2 مل من إنزيم ديسباس المخفف في وسائط الغسيل (50 U/mL).
  5. نقل اللوحة إلى حاضنة لمدة 4 ساعات (37 درجة مئوية، 5٪ CO2، 95٪ رطوبة).
  6. إزالة القلفة من الحاضنة، وفي ظل ظروف معقمة، ونقله إلى طبق بيتري. باستخدام ملقط البقشيش الدقيق، افصل البشرة عن طبقة الأدمة.
  7. ضع البشرة في أنبوب مخروطي سعة 15 مل يحتوي على ملين من 0.25٪ تريبسين-EDTA. باستخدام ماصة مصلية سعة 5 مل ، سحق البشرة العائمة ميكانيكيا. حضانة لمدة 15 دقيقة في 37 درجة مئوية مع دوامة دورية لمدة 5 ق كل 5 دقائق.
  8. بعد الحضانة, إضافة 2 مل من مثبطات تريبسين فول الصويا ومزيج عن طريق pipetting لتحييد تريبسين.
  9. تعليق خلية الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 450 × ز، ثم لمدة 8 دقائق في 250 × ز.
  10. إزالة الحطام العائم مع ملقط، مع الحرص على عدم طرد بيليه الخلية. يستنشق بعناية فائقة من بيليه الخلية.
  11. Resuspend بيليه في 12 مل من كامل KSFM سم المتوسطة ولوحة في طبق 10 سم. طبق حضانة بين عشية وضحاها (37 درجة مئوية، 5٪ CO2، 95٪ رطوبة).
  12. في اليوم التالي، إزالة المتوسطة باستخدام ماصة aspirating واستبدال مع 12 مل كاملة KSFM-scm. كرر في اليومين 4 و 7.
  13. للحفاظ على النمو الأمثل لثقافات الكيراتينية البشرية العادية (NHKc) ، خلايا المرور 1:5 في اليوم 10 لمنع الخلايا من تحقيق التقاء أكبر من 80٪.

2. توليد ثقافات البشرة في المختبر

  1. إعداد خليط 5٪ agarose بإضافة 2.5 غرام من الآغاروز إلى 50 مل من المالحة العازلة 1x الفوسفات (PBS)، في زجاجة 50 مل. زجاجة الأوتوكلاف تحت دورة السائل. السماح لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة.
  2. لإعداد لوحات، ضع زجاجة تبريد تحتوي على محلول الآغروز في كوب بلاستيكي 1 لتر مملوءة 200 مل من الماء deionized (DH2O). تذوب خليط الآغروز في ميكروويف من الدرجة البحثية لمدة تصل إلى دقيقتين، وخلط أجار كل 60 ق عن طريق إمالة بلطف زجاجة جنبا إلى جنب.
    تنبيه: سيؤدي ذوبان أجار في الميكروويف إلى أن تصبح حاوية القارورة ساخنة للغاية مما يؤدي إلى تراكم الضغط. الإفراج عن تراكم الضغط كل 30 ق. ارتداء معدات الحماية المناسبة لمنع الإصابة.
  3. إضافة 3 مل من تذوب 5٪ agarose إلى 12 مل KSFM-SCM prewarmed إلى 42 درجة مئوية لتركيز نهائي من 1٪ agarose (wt/vol).
    اختياري: ما قبل الدافئة ماصة المصلية ونصائح ماصة لمنع البلمرة المبكرة من أجار لينة.
  4. ماصة بسرعة 200 ميكرولتر من مزيج أجار 1٪ في الآبار الفردية من لوحة مستديرة القاع 96 جيدا باستخدام ماسورة متعددة القنوات (الشكل 1A). اترك الطبق في بيئة معقمة عند 25 درجة مئوية لمدة 4 ساعة للسماح للأغاروز بالبوليمرات بالكامل.
    ملاحظة: يمكن إيقاف التجريب هنا ومواصلة اليوم التالي. يمكن الحفاظ على لوحات الآغاروز البلمرة عند 37 درجة مئوية حتى 24 ساعة أو عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 48 ساعة عند ختمها بغلاف البارافيلم. صفيحة دافئة إلى 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل الاستخدام.
  5. مرور شكل كروي NHKc عن طريق وسائل الإعلام aspirating وغسل الخلايا في 2 مل من برنامج تلفزيوني. أسبيرات برنامج تلفزيوني وإضافة 2 مل من 0.25٪ تريبسين-EDTA إلى الخلايا المغسولة. حضانة لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية أو حتى تنفصل جميع الخلايا تماما. إضافة 2 مل من فول الصويا تريبسين المانع لوحة ويغسل الخلايا من لوحة في أنبوب 15 مل. جهاز طرد مركزي عند 250 x g لمدة 5 دقائق.
  6. ريسوبيند بيليه في 1 مل من برنامج تلفزيوني. قياس صلاحية الخلية باستخدام تلطيخ أزرق تريبان ومقياس الدم أو عداد الخلايا الآلي.
  7. Aliquot 2 × 104 NHKc في 100 ميكرولتر من KSFM سم والبذور في الآبار الفردية من 96 جيدا أعدت سابقا لوحة مستديرة القاع. حضانة لوحة بين عشية وضحاها (37 درجة مئوية، 5٪ CO2،95٪ الرطوبة).
  8. باستخدام المجهر النقيض من المرحلة المقلوبة، وتحليل المصنف جيدا لتشكيل البشرة.
    ملاحظة: يمكن أن تظل البشرة البشرية من الخلايا القرنية البشرية العادية قابلة للحياة في ثقافة التعليق ثلاثي الأبعاد لمدة تصل إلى 96 ساعة ، على الرغم من انخفاض كبير في صلاحية الخلية(الشكل 2).

3. Epidermal كرويد إعادة الطلاء المقايسة

  1. 24-48 ساعة بعد تشكيل 3D البشرة، إضافة 4 مل من KSFM-SCM قبل الحرب إلى طبق 6 سم. استخدام واسعة تتحمل 1 مل ماصة تلميح لنقل كروية واحدة إلى لوحة، وضمان عدم كسرها إربا. بدلا من ذلك، قم بتوسيع طرف ماصة 1 مل باستخدام شفرة حلاقة معقمة لقطع الطرف.
  2. احتضان لوحة بين عشية وضحاها (37 درجة مئوية، 5٪ CO2،95٪ الرطوبة).
  3. تحليل كروية المصنف للتعلق إلى الجزء السفلي من لوحة ومراقبة لنشر الخلايا باستخدام المجهر النقيض المرحلة مقلوب(الشكل 3). تغذية الخلايا كل 96 ساعة عن طريق إزالة بلطف 2 مل من وسائل الإعلام داخل لوحة وببطء إضافة 2 مل جديدة KSFM سم وسائل الإعلام إلى لوحة.
  4. مرور المشتقة من كروية (SD) NHKc بمجرد أن تصل إلى التقاء 70-80٪ والاستمرار في الفحص من الاختيار. رصد SD-NHKc في كثير من الأحيان لمنع الخلايا من الوصول إلى التقاء كامل في الثقافة، لأن هذا يؤدي إلى التمايز المبكر وتوقف نمو الخلية(الشكل 3E-F).
  5. وepdermal spherlating نماذج الفحص التماثل الكيراتينوسي بوساطة إصلاح الجرح عن طريق التقاط كل من المراحل الرئيسية متتابعة من البشرة اللدونة التجديدية: أ) الصيانة المنزلية, ب) التمايز وقف / عكس ج) حركة سلالة الإجهاد, و د) استعادة الأنسجة (الشكل 1B; الجدول 2). ويمكن أيضا أن تستخدم هذا المقايسة لإنتاج مجموعات الخلايا لثقافات الطوافة organotypic أو لنموذج الورم الورمي بوساطة فيروس الورم الحليمي البشري كما هو موضح في عملنا السابق 11،12.

4.3D تتبع الخلايا الفلورية

  1. في طبق طوله 6 سم ، ثقافات NHKc أحادية الطبقة أحادية الطبقة ثلاثية الطبقات مع 1 ميكروغرام من ناقلات البلازميد pMSCV-IRES-EGFP التي تحمل جين البروتين الفلوري الأخضر المعزز (eGFP). حضانة لوحة بين عشية وضحاها (37 درجة مئوية، 5٪ CO2،95٪ الرطوبة) المجهر(الشكل 4A).
    ملاحظة: من المهم أن يتم الانتهاء من العدوى في ظروف خالية من المضادات الحيوية المصل.
  2. دون إزالة مزيج العدوى، إضافة 2 مل من KSFM-SCM prewarmed إلى الخلايا. حضانة لوحة بين عشية وضحاها (37 درجة مئوية، 5٪ CO2،95٪ الرطوبة).
  3. اسبير جميع وسائل الإعلام transfection من لوحة وخلايا التغذية مع 3 مل من KSFM-scm. تقييم لوجود الخلايا التعبير عن EGFP تحت قناة FITC من المجهر الفلورسنت.
  4. مرور والبذور 2 × 104 الخلايا EGFP-transfected في الآبار الفردية من لوحة 96-جيدا أعدت مسبقا جولة القاع. حضانة لوحة بين عشية وضحاها (37 درجة مئوية، 5٪ CO2،95٪ الرطوبة). تصور ورصد EGFPpos حركة الخلايا الكروية تحت قناة FITC من المجهر مضان(الشكل 4B-C).
  5. 24 ساعة بعد الطلاء، إضافة 3 مل من KSFM-SCM قبل الحرب إلى طبق 6 سم. استخدام واسعة تتحمل 1 مل ماصة تلميح لنقل كروية واحدة إلى لوحة، وضمان عدم كسرها إربا. حضانة لوحة بين عشية وضحاها (37 درجة مئوية، 5٪ CO2،95٪ الرطوبة).
  6. مراقبة وتحليل نشر SD-NHKcEGFP باستخدام مجهر مضان. تغذية الخلايا كل 96 ساعة عن طريق إزالة بلطف 2 مل وسائل الإعلام داخل لوحة وببطء إضافة 2 مل الطازجة KSFM سم وسائل الإعلام إلى لوحة.
  7. حصاد SD-NHKCEGFP لعزل FACS أو المقايسات المفضلة.

5- توصيف المجموعات الفرعية المشتقة من كروية (SD) بواسطة FACS

  1. مرور SD-NHKc والثقافات أحادية الطبقة 2D ذاتية المقابلة عن طريق قرصنة وسائل الإعلام القديمة وغسل الخلايا في 2 مل من برنامج تلفزيوني. إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 2 مل من 0.25٪ تريبسين-EDTA إلى الخلايا المغسولة. حضانة في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق أو حتى تنفصل جميع الخلايا تماما.
  2. إضافة 2 مل من فول الصويا تريبسين المانع لوحة ونقل الخلايا إلى أنبوب 15 مل. جهاز طرد مركزي عند 250 x g لمدة 5 دقائق.
  3. الكريات ريسوسبند في 1 مل من برنامج تلفزيوني. قياس صلاحية الخلية باستخدام الأزرق المثقبي وعداد الخلية الآلي لقياس الدم.
  4. Aliquot 100 ميكرولتر تحتوي على 0.1-4 × 106 خلايا NHKc إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيق 1.5 مل. ضع الأنبوب على الجليد في بيئة مظلمة ، تم إنشاؤها عن طريق إطفاء الأضواء الساطعة داخل غطاء الرأس.
  5. إضافة 2 ميكرولتر من FITC-اقتران المضادة integrinα6 و 2 ميكرولتر من PE-اقتران المضادة EGFR إلى أنابيب لتحقيق تخفيف 1:50. إعداد أنبوب مع عدم وجود أجسام مضادة المضافة لتكون بمثابة السيطرة غير ملطخة. احتضان الأنابيب على الجليد في الظلام أو في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. يمكن أن يكون استخدام الخرز أو خط SCC للبشرة بمثابة تحكم إيجابي ، حيث تعبر خلايا SCC الجلدية عن مستويات مرتفعة من integrinα6 و EGFR.
  6. إجراء تحليل قياس التدفق الخلوي باستخدام مقياس التدفق الخلوي المفضل الذي يحتوي على أشعة الليزر المناسبة.
  7. استخدام الضوابط السلبية والإيجابية لإنشاء البوابات. فرز السكان الفرعية للخلايا integrinα6مرحبا/ EGFRلو; هذه هي الخلايا الجذعية البشرة كسر. Integrinα6مرحبا/ EGFRمرحبا الخلايا هي كسر الخلية السلف التكاثري. و integrinα6لو/ EGFRمرحبا الخلايا هي جزء الخلية السلف ملتزمة (الشكل 4D). يجب أن يحتوي فرز أنبوب (أنابيب) FACS على ما لا يقل عن 1 مل من KSFM-scm الباردة الجليدية.
  8. اختبار للقدرة التكاثرية للخلايا الفرعية فرزها عن طريق نقل محتوى كل أنبوب الفرز كل منها في أنبوب مخروطي 15 مل تحتوي على 10x حجم الخلايا المفرزة في برنامج تلفزيوني. ملاحظة: من المهم إزالة جميع الخلايا المرفقة بالحافة عن طريق توصيل جدار أنبوب (أنابيب) FACS الفرز عدة مرات ، حيث يمكن أن تلتزم الكيراتينوسيات في كثير من الأحيان هناك.
  9. جهاز طرد مركزي 15 مل أنابيب في 250 x ز لمدة 5 دقائق. إزالة الكريات العملاقة وإعادة الإنفاق في 12 مل من KSFM-scm. نقل الخلايا التي أعيد إنفاقها إلى لوحة 6 سم واحتضان بين عشية وضحاها (37 درجة مئوية، 5٪ CO2،95٪ الرطوبة).
  10. في اليوم التالي، إزالة الوسائط في لوحات وإضافة 8 مل قبل تسخين KSFM-scm. احتضان في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2،95٪ الرطوبة. إعادة تغذية الخلايا مع 12 مل المتوسطة كل 3 أيام حتى 70-80٪ التقاء (الشكل 4E).

6. immunofluorescence وتلطيخ البشرة لعلامات الخلايا الجذعية القاعدية

  1. نقل البشرة على الأغطية المغلفة بولي ليسين. السماح SD-NHKc لنشر حتى التقاء 75٪.
  2. غسل الخلايا مرتين في برنامج تلفزيوني (4 درجة مئوية) لمدة 5 دقائق لكل منهما.
  3. إصلاح الخلايا مع 4٪ بارافورمالديهايد (PFA) لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  4. Permeabilize الخلايا مع 0.5٪ تريتون X-100 في 1٪ الجليسين. كتلة باستخدام 0.5٪ BSA و 5٪ مصل الماعز لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  5. احتضان العينات مع الأجسام المضادة ضد P63 (1:200) والسيتوكيراتين 14 (1:200) في حل حجب بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
  6. غسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني (4 درجة مئوية) التي تحتوي على توين 20 (PBST)، تليها حضانة مع FITC-واليكسا 568- الأجسام المضادة الثانوية المقترنة (1:1000 التخفيف).
  7. وصمة عار النوى مع 4'، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (1:5000 التخفيف) قبل تصاعد الخلايا.
  8. مراقبة الخلايا باستخدام المجهر الفلورسنت قادرة مع FITC وخطوط الليزر PE (الشكل 4F).

7. التحليل النسخي لثقافات الغلاف الجليدي

  1. إعداد لوحات ثلاثية من الثقافات NHKc مرور منخفض لعزل الجيش الملكي النيبالي يمكن أن يكون من الثقافات أحادية الطبقة، كروية، والشتقاء من كروية من نفس خط الخلية الذاتية.
  2. تجمع 3-5 البواسفير المقابلة في أنبوب الطرد المركزي الدقيق 1.5 مل. حصاد بشكل منفصل الذاتي SD-NHKc و2D الثقافات أحادية الطبقة.
  3. عزل إجمالي الحمض النووي الريبي من جميع المجموعات الثلاث.
  4. إجراء النسخ العكسي مع 1 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي.
  5. باستخدام cDNA، قم بإجراء PCR في الوقت الحقيقي، باستخدام GAPDH كعنصر تحكم داخلي (الجدول 1).
  6. التحقق من صحة حجم المنتج amplicon بواسطة أجاروز هلام الكهربائي (2٪ v/v).
    ملاحظة: بالنسبة للتنميط على نطاق النسخ لثقافات الغلاف البشرة باستخدام تحليل الجينوم الكامل للميكروبات، قم بعزل الحمض النووي الريبي الكلي عن الثقافات الجماهيرية لمتبرع واحد من NHKc وما يقابله من SD-NHKc من نفس المتبرع، في ست نسخ متماثلة لكل منها.
  7. تقييم جودة الحمض النووي الريبي باستخدام جهاز التحلل الحيوي لتحقيق أرقام النزاهة الحمض النووي الريبي (RIN) تتراوح بين 9.0 على الأقل إلى 9.1.
  8. إجراء تجارب microarray عن طريق تضخيم وbiotinylating مجموع عينات الحمض النووي الريبي.
  9. عكس نسخ 100 نانوغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي لكل عينة في DS-cDNA باستخدام التهيئة العشوائية NNN التي تحتوي على تسلسل المروج T7 RNA البوليميراز.
  10. إضافة T7 RNA بوليمرات إلى عينات cDNA لتضخيم الحمض النووي الريبي، ثم نسخ الحمض النووي الريبي إلى ss-cDNA. تتحلل RNA الزائدة باستخدام RNase H.
  11. جزيئات sscDNA جزء وتسمية مع البيوتين.
  12. تضخيم العينات المسماة لمدة 16 ساعة عند 45 درجة مئوية.
  13. تهجين العينات باستخدام فرن التهجين ومجموعة غسل وصمة عار.
  14. غسل وصمة عار صفائف هجينة.
  15. مسح صفائف باستخدام نظام ومحطة عمل الكمبيوتر.
  16. بعد الانتهاء من مسح الصفيف ، استيراد ملفات كثافة الخلية التحقيق (CEL) في برنامج وحدة التحكم التعبير وعملية على مستوى الجينات باستخدام ملف المكتبة وتحليل Multichip قوية (RMA) خوارزمية لتوليد ملفات CHP.
  17. بعد تأكيد جودة البيانات داخل وحدة التحكم في التعبير، قم باستيراد ملفات CHP التي تحتوي على إشارات تعبير log2 لكل مسبار في برنامج تحليل النسخ لتحليل استجابات النسخ الخاصة بنوع الخلية باستخدام تحليل التباين في اتجاه واحد بين الموضوع.

8. تقييم كفاءة تشكيل مستعمرة SD-NHKc

  1. يستنشق الوسائط من لوحات عندما تصل الخلايا التقاء 70-80٪. غسل الخلايا ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني (4 درجة مئوية) لمدة 5 دقائق لكل منهما.
  2. إصلاح الخلايا مع 3 مل من الميثانول 100٪ (4 درجة مئوية) لمدة 15 دقيقة. غسل ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما.
  3. وصمة عار الخلايا في 3 مل من 10٪ Giemsa لمدة 30 دقيقة. غسل ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما. السماح للخلايا بالهواء الجاف بين عشية وضحاها.
  4. تحليل تشكيل المستعمرة في اليوم التالي وتحديد عدد المستعمرات التي تم الحصول عليها

9. تحديد عدد سكان SD-NHKc مضاعفة

  1. مرور SD-NHKc والثقافات أحادية الطبقة 2D ذاتية المقابلة عن طريق التجسس وسائل الإعلام القديمة وغسل الخلايا في برنامج تلفزيوني 2mL. إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 2 مل 0.25٪ تريبسين-EDTA إلى الخلايا المغسولة. حضانة لمدة 5 دقائق أو حتى تنفصل جميع الخلايا تماما (37 درجة مئوية، 5٪ CO2،95٪ رطوبة).
  2. إضافة 2 مل من فول الصويا تريبسين المانع لوحة ونقل الخلايا إلى أنبوب 15 مل.
  3. جهاز طرد مركزي عند 250 x g لمدة 5 دقائق.
  4. إزالة بيليه supernatant و ريسوسبند في 12 مل من KSFM-SCM.
  5. خلايا البذور في كثافة منخفضة 1-2 × 104 NHKc في أطباق فردية 10 سم واحتضان بين عشية وضحاها (37 درجة مئوية، 5٪ CO2،95٪ الرطوبة).
  6. لوحات تغذية مع 8 مل KSMF-SCM في اليوم التالي. تغذية كل 4 أيام حتى التقاء 25٪ على الأقل، ثم تغذية كل يومين.
  7. خلايا مرور تسلسلي 1:5 في 60 سم أطباق حتى يتم استنفاد قدرة التكاثر الخلية. قياس صلاحية الخلية عن طريق تلطيخ الأزرق تريبان. تحديد عدد السكان يتضاعف في كل مرور باستخدام الصيغة: سجل (N / N0) / log2، حيث يمثل N إجمالي عدد الخلايا التي تم الحصول عليها في كل مرور و N0 يمثل عدد الخلايا المطلية في بداية التجربة.

النتائج

خلال فحص البشرة البشرة، يتم بذر الثقافات NHKc في آبار المغلفة agarose من لوحة 96 جيدا(الشكل 1A). يجب أن تقوم الخلايا التي تشكل كروية بتجميع نفسها في غضون 48h. يمكن تقييم تكوين كروي مستقل في وقت مبكر من 24 ساعة باستخدام المجهر المعياري المقلوب على النقيض من المرحلة. تشكيل البشرة البشرة ...

Discussion

كان لاستخدام أنظمة زراعة كروية ثلاثية الأبعاد فائدة واسعة في تقييم جذع الخلايا. وقد ثبت هذه النظم لتعزيز إثراء الخلايا الجذعية الأنسجة13, ومع ذلك فقد تم استكشاف فائدتها لدراسة الخلايا الجذعية البشرة البشرية محدودة. هنا، ونحن نصف استراتيجية لإثراء الخلايا الجذعية الكيراتينية...

Disclosures

ولا تربط المؤلفين علاقات مالية يكشفان عنها.

Acknowledgements

100- ووفر مرفق موارد كلية الطب التابعة لمدرسة UofSC إمكانية الوصول إلى معدات التصوير وفرز الخلايا والمساعدة التقنية. وقد تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال المنحة 1R21CA201853. يتلقى صندوق تحدي الألفية والمعهد دعما جزئيا من منحة المعاهد القومية للصحة P20GM103499، SC INBRE. كما يتلقى الصندوق الدعم من منحة المعاهد القومية للصحة P20GM109091. تم دعم إيفون وابي جزئيا من خلال منح المعاهد القومية للصحة 2R25GM066526-06A1 (PREP) وR25GM076277 (IMSD) ، وزمالة من قبل برنامج أساتذة غريس جوردان ماكفادن في UofSC. تم دعم جيرالدين حزيكا وجاستن فيرسيلينو من قبل المعاهد القومية للصحة منح 2R25GM066526-10A1 (PREP) في UofSC. حصل شون م. بلووس على دعم جائزة ماجلان للباحث لعام 2016 في جامعة أوفوس.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Affymetrix platformAffymetrixFor microarray experiments
Affymetrix’s HuGene-2_0-st library fileAffymetrixProcess
Agilent 2100 BioanalyzerAgilentFor microarray experiments
All Prep DNA/RNA Mini KitQiagen80204Used for RNA isolation
Analysis Console Software version 3.0.0.466analyze cell type specific transcriptional responses using one-way between-subject analysis of variance
BD FACSAria II flow cytometerBeckmanFor flow cytometry
Console Software version 3.0.0.466/Expression console SoftwareAffymetrix/Thermo Fisher ScientificFor confirming data quality
Cytokeratin 14Santa Cruz Biotechnologysc-532531:200 dilution
DispaseSigma-AldrichD4818For cell media
FITC-conjugated anti-integrinα6Abcamab30496For FACS analysis
GeneChip Command Console 4.0 softwareAffymetrix/Thermo Fisher ScientificFor confirming data quality
GeneChip Fluidics Stations 450 (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific)Affymetrix/Thermo Fisher ScientificFor washing and staining of hybridized arrays
GeneChip HuGene 2.0 ST ArraysAffymetrix/Thermo Fisher ScientificFor hybridization and amplifycation of total RNA
GeneChip Hybridization Oven 640Thermo Fisher ScientificFor hybridization and amplifycation of total RNA | Amplify labeled samples
GeneChip Hybridization Wash, and Stain Kit (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific).Affymetrix/Thermo Fisher ScientificFor washing and staining of hybridized arrays
GeneChip Scanner 3000 7G systemAffymetrix/Thermo Fisher ScientificScanning hybridized arrays
GeneChip WT PLUS Reagent KitAffymetrix/Thermo Fisher ScientificFor amplifycation of biotinylating total RNA
Human Basic Fibroblast Growth Factor (hFGF basic/FGF2)Cell Signaling Technology8910For cell media
Human Epidermal Growth Factor (hEGF)Cell Signaling Technology8916For cell media
Human InsulinMillipore Sigma9011-MFor cell media
iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad)Bio-Rad1708880Used for RT-qPCR
iScript cDNA Synthesis KitBio-Rad1708890Used for RT-qPCR
KSFMThermoFisher Scientific17005041Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml
basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin
KSFM-scmThermoFisher Scientific17005042Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml
basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin
MCDB 153-LB basal mediumSigma-AldrichM7403MCDB 153-LB basal media w/ HEPES buffer
NEST Scientific 1-Well Cell Culture Chamber Slide, BLACK Walls on Glass Slide, 6/PK, 12/CSStellar ScientificNST230111For immunostaining
P63Thermo Scientific7038091:200 dilution
PE-conjugated anti-EGFR ( San Jose, CA; catalog number )BD Pharmingen555997For FACS analysis
pMSCV-IRES-EGFP plasmid vectorAddgene20672For transfection
Promega TransFast kitPromegaE2431For transfection
Qiagen RNeasy Plus Micro KitQiagenFor microarray experiments
Thermo Scientific™ Sterile Single Use Vacuum Filter UnitsThermo Scientific09-740-63DFor cell media
Zeiss Axionvert 135 fluorescence microscopeZeissUse with Axiovision Rel. 4.5 software

References

  1. Patel, G. K., Wilson, C. H., Harding, K. G., Finlay, A. Y., Bowden, P. E. Numerous keratinocyte subtypes involved in wound re-epithelialization. Journal of Investigative Dermatology. 126 (2), 497-502 (2006).
  2. Dekoninck, S., Blanpain, C. Stem cell dynamics, migration and plasticity during wound healing. Nature Cell Biology. 21 (1), 18-24 (2019).
  3. Byrd, K. M., et al. Heterogeneity within Stratified Epithelial Stem Cell Populations Maintains the Oral Mucosa in Response to Physiological Stress. Cell Stem Cell. , (2019).
  4. Rothbauer, M., Rosser, J. M., Zirath, H., Ertl, P. Tomorrow today: organ-on-a-chip advances towards clinically relevant pharmaceutical and medical in vitro models. Current Opinion in Biotechnology. 55, 81-86 (2019).
  5. Kim, S. J., Kim, E. M., Yamamoto, M., Park, H., Shin, H. Engineering Multi-Cellular Spheroids for Tissue Engineering and Regenerative Medicine. Advanced Healthcare Materials. , 2000608 (2020).
  6. Lee, J., et al. Hair-bearing human skin generated entirely from pluripotent stem cells. Nature. 582 (7812), 399-404 (2020).
  7. Zhang, Q., et al. Early-stage bilayer tissue-engineered skin substitute formed by adult skin progenitor cells produces an improved skin structure in vivo. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 407 (2020).
  8. Borena, B. M., et al. Sphere-forming capacity as an enrichment strategy for epithelial-like stem cells from equine skin. Cellular Physiology and Biochemistry. 34 (4), 1291-1303 (2014).
  9. Vollmers, A., et al. Two- and three-dimensional culture of keratinocyte stem and precursor cells derived from primary murine epidermal cultures. Stem Cell Reviews and Reports. 8 (2), 402-413 (2012).
  10. Kang, B. M., Kwack, M. H., Kim, M. K., Kim, J. C., Sung, Y. K. Sphere formation increases the ability of cultured human dermal papilla cells to induce hair follicles from mouse epidermal cells in a reconstitution assay. Journal of Investigative Dermatology. 132 (1), 237-239 (2012).
  11. Woappi, Y., Hosseinipour, M., Creek, K. E., Pirisi, L. Stem Cell Properties of Normal Human Keratinocytes Determine Transformation Responses to Human Papillomavirus 16 DNA. Journal of Virology. 92 (11), (2018).
  12. Woappi, Y., Altomare, D., Creek, K., Pirisi, L. Self-assembling 3D spheroid cultures of human neonatal keratinocytes have enhanced regenerative properties. Stem Cell Research. , (2020).
  13. Toma, J. G., McKenzie, I. A., Bagli, D., Miller, F. D. Isolation and characterization of multipotent skin-derived precursors from human skin. Stem Cells. 23 (6), 727-737 (2005).
  14. Li, F., et al. Loss of the Epigenetic Mark 5-hmC in Psoriasis: Implications for Epidermal Stem Cell Dysregulation. Journal of Investigative Dermatology. , (2020).
  15. Kuo, C. T., et al. Three-dimensional spheroid culture targeting versatile tissue bioassays using a PDMS-based hanging drop array. Scientific Reports. , (2017).
  16. Woappi, Y., Ezeka, G., Vercellino, J., Bloos, S. M., Creek, K. E., Pirisi, L. GSE94244 - Expression data from normal human spheroid-forming keratinocytes in monolayer mass culture and from corresponding cornified-like spheroid ring structures. Gene Expression Omnibus (GEO). , (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

167

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved