Doku ve İdrardan İnsan Böbrek Tubuloidlerinin Üretimi

Özet

İnsan böbrek tübuloid kültürleri, böbrek fizyolojisi ve hastalığını incelemek için değerli bir in vitro modeli temsil eder. Tübuloidler böbrek dokusundan (sağlıklı ve hastalıklı) ve idrardan da kurulabilir, ikincisi kolayca elde edilebilir ve daha az invaziv bir araştırma malzemesi kaynağını temsil eder.

Özet

Yetişkin kök hücre (ASC) türevi insan böbrek epitel organoidleri veya tübuloidler, yüksek verimle sağlıklı ve hastalıklı böbrek epitelinden kurulabilir. Normal böbrek tübuloidleri, menşe dokularının birçok yönünü yeniden dengeler. Farklı nefron segmentlerini temsil ederler - özellikle proksimal tübül, Henle döngüsü, distal tübüller ve toplama kanalı - ve normal böbrek fizyolojisini incelemek için kullanılabilirler. Ayrıca, tübuloid teknolojisi hastalık modellemesini kolaylaştırır, örneğinbulaşıcı hastalıklar için olduğu kadar kanser için de. Bununla birlikte, tübuloid üretimi için böbrek epitel hücrelerinin elde etmek, artık cerrahi malzemeye (kısmi) nefrektomiler gibi) veya iğne biyopsilerine bağlıdır. İdrardan tübuloid yetiştirme yeteneği, sağlıklı böbrek epitel hücrelerinin alternatif, daha az invaziv bir kaynağını sağlayacaktır. Daha önce tübuloid kültürlerinin sadece birkaç mililitre taze toplanan idrardan başarıyla üretilebileceği gösterilmiştir. Bu makalede, doku ve idrar örneklerinden ASC türevi insan böbrek tübuloid kültürleri oluşturmak ve yaymak için protokoller açıklanmaktadır.

Giriş

Böbrekler, vücut sıvılarının dengesini sistemik olarak kontrol etme işlevini yerine getirmektedir. Fizyolojik fonksiyonlarının bozulması diyabet, hipertansiyon ve ilaca bağlı toksisite dahil olmak üzere farklı faktörlerden kaynaklanabilir¹. Böbrek hastalıklarının gelişiminin yanı sıra normal böbrek fizyolojisinin daha iyi anlaşılması için, temsili preklinik modellerin kullanılması çok önemlidir. Son yıllarda, organoid teknolojisi². Organoidler, kaynaklandığı dokunun morfolojisine ve fizyolojisine (normal veya hastalıklı) benzeyen üç boyutlu, çok hücreli yapılardır. Her biri kendi özelliklerine ve uygulamalarına sahip pluripotent (PSC' ler) veya yetişkin kök hücrelerinden (ASC' ler) üretilebilirler.

PSC türevi böbrek organoidleri nefrogenez^3,4^,5'i taklit eder. Ayrıca, hasta kaynaklı taahhütlü hücrelerden zorla tahsis yoluyla (indüklenmiş pluripotency veya iPSC) kurulabilirler. iPSC'ler daha sonra belirli büyüme faktörü kokteyllerine zamanında maruz kalarak böbreğin fonksiyonel birimi olan nefronun farklı hücre tiplerine ayırt edilebilir. Bir tabakta oldukça eksiksiz bir mini organ oluştururken, kuruluşları zaman alıcı olmaya devam eder ve yeniden programlama protokolü nedeniyle iPSC'ler istenmeyen genetik kararsızlığa karşı hassas olabilir⁶. Ayrıca, iPSC organoidleri yetişkin böbrek hücrelerine tam olarak olgunlaşamamaktadır, erken gelişim aşamasında fetal böbreğe benzeyen bir transkriptom profili ortaya çıkarır⁷.

ASC türevi insan böbrek tubuloidlerinin erişkin böbrek epitelinin yenilenmesini yeniden nüksedenler gösterilmiştir. Öncelikle, farklı taşıyıcı proteinlerin ekspresyoyörü ile doğrulanan proksimal tübül, Henle döngüsü, distal tübüller ve toplama kanalını temsil ederler^8,9,10. Tübuloid kültür protokolü, stabil bir genom korurken, hasta kaynaklı böbrek dokusunun hızlı bir şekilde genişlemesini sağlar. Araştırma uygulamaları arasında normal böbrek fizyolojisi, nefrotoksisite, ilaç testi ve hastalık modellemesi⁸, 10^,11,12. Tubuloidler de dahil olmak üzere hasta kaynaklı organoid kültürlerinin kurulmasının potansiyel bir sınırlaması taze dokunun mevcudiyetidir. Bununla birlikte, birkaç rapor idrarın böbrek epitel hücreleri için bir kaynak görevi görebilmiştir, böylece tubuloid kültürleri için hasta materyali elde etmek için çok daha basit, daha az invaziv bir strateji sağlar^8,13,14. Gerçekten de, son zamanlarda tübuloidlerin idrardan yetiştirilebileceği gösterilmiştir⁸. Bu makalede böbrek dokusu ve idrardan tubuloid kültürlerinin kurulması ve sürdürülmesi açıklanmaktadır.

Protokol

NOT: Burada açıklanan deneyler Erasmus Tıp Merkezi (Rotterdam, Hollanda) ve Prenses Máxima Pediatrik Onkoloji Merkezi (Utrecht, Hollanda) tıbbi etik komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Dokudan insan böbrek tübuloidlerinin üretimi

1. Malzeme
   1. 37 °C'de bir gecede prewarm multiwell doku kültürü plakaları (6, 12 ve 24 kuyular).
   2. Gelişmiş DMEM/F12'ye 1x L-alanin/L-glutamin takviyesi, %1 w/v 4-(2-hidroksetil)-1-piperazine etanesülfik asit (HEPES, 10 mM) ve %1 Penisilin/Streptomisin antibiyotikleri ekleyerek bazal ortam (AdDF+++) hazırlayın.
   3. %1,5 B27 takviyesi, %10 R-spondin şartlandırılmış ortam ekleyerek kültür ortamı hazırlamak, epidermal büyüme faktörü (50 ng/mL), fibroblast büyüme faktörü-10 (100 ng/mL), N-asetilsistein (1,25 mM), Rho-kinas Y-27632 (10 μM), geniş spektrumlu antibiyotikler (0,1 mg/mL) ve AdDF+++'a A83-01 (5 μM) inhibitörü. Kullanmadan önce 37 °C'ye kadar ısıtın.
   4. Bir aliquot'ı 4 °C'de bir gecede eriterek bodrum membran ekstresini (BME) hazırlayın. İşlem sırasında BME'yi buzda tutun.
   5. Kollajenaz çözeltisini, 10 μM Y-27632 ilavesiyle AdDF+++'ta 1 mg/mL'lik son konsantrasyona seyrelterek hazırlayın. 37 °C'ye kadar ısıtın.
   6. 10 cm Petri yemekleri, neşterler ve cımbız hazırlayın. 20 dakika boyunca ultraviyole lamba uygulayarak mutfak eşyaları dezenfekte edin, ardından dezenfektan, demi suyu ve% 70 v / v etanol ile yıkayın. Mutfak eşyaları havadan kurulayın.
   7. 37 °C'ye kadar yatay bir çalkalayıcıyı önceden ısıtın.
2. Prosedür
   1. Böbrek dokusunu 30-40 mL AdDF+++ ortamı ile dolu 50 mL'lik bir tüpte toplayın. Doku parçasını 10 cm'lik bir Petri kabına ~1 mL orta olarak yerleştirin. Neşter kullanarak dokuyu ~1 mm³ boyutlu parçalar halinde kıyma yapın (Şekil 1A).
   2. Kıyılmış dokuyu neşter ve neşter kullanarak 15 mL'lik bir tüpe aktarın. Petri kabına 5 mL AdDF+++ ekleyin, 10 mL steril pipetle ortamı yıkayın ve toplayın. Tüm bu içerikleri aynı tüpe aktarın.
   3. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüj ve üst yapıyı çıkarın. 15 mL tüpe 3-4 mL kollajenaz çözeltisi ekleyin. Tüpü 37 °C'de ayarlanmış yatay bir çalkalayıcıya ve 250 rpm hıza taşıyın.
   4. kuluçkanın ilk 15 dakikasının ardından, numuneyi kontrol edin ve tüpü kuvvetlice sallayın. Süspansiyon homojen olana ve çoğu doku parçası kaybolana kadar, maksimum kuluçka süresi 45-60 dk olana kadar tekrarlayın.
   5. Tüpü AdDF+++ ile doldurun ve tüpü 5-10x ters çevirerek karıştırın. 4 °C'de 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüj ve süpernatantı çıkarın. Pelet kırmızıysa, 1.2.6 adımına geçin. Aksi takdirde, 1.2.8 adımına gidin.
   6. Hücre peletinin üzerine 1 mL kırmızı kan hücresi liziz tamponu ekleyin (Malzeme Tablosunabakın). Peleti yeniden çıkarmak için tüpe hafifçe dokunun (pipet ucuyla yeniden harcamayın). Oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatır.
   7. Tüpü AdDF+++ ile doldurun. 4 °C'de 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüj ve süpernatantı çıkarın. Kan hücreleri hala görünür durumdaysa, 1.2.6 adımından başlayarak prosedürü bir kez daha tekrarlayın. Aksi takdirde, 1.2.8 adımına geçin.
   8. Protokolün bu noktasında doku parçaları görünüyorsa, 1.2.8 adımına geçin. Aksi takdirde, 1.2.9 adımında pelet hacminin ölçümüne devam edin. Tüpe 5 mL AdDF+++ ekleyin ve 10 mL steril pipetle yeniden ıslatın. Süspansiyonu 50 mL'lik bir tüpe yerleştirilen 100 μm naylon hücre süzgecinden filtreleyin.
   9. Filtrelenmiş süspansiyonu yeni bir 15 mL tüpe aktarın. 4 °C'de 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüj ve süpernatantı çıkarın. Bilinen bir birime ayarlanmış bir p1000 pipet kullanarak hücre peletinin hacmini ölçün. Hava kabarcıkları oluşturmadan yeniden dirimek için dikkatlice yukarı ve aşağı pipet. Tüpü 1 dakika boyunca buza aktarın.
   10. Pelete% 70-75 hacim bme ekleyin. P1000 veya p200 pipet kullanarak yeniden biriktirin, ve plaka 15 μL damlacıklar önceden ısıtılmış, çok amaçlı hücre kültür plakasında (6, 12 veya 24 kuyular), toplam kaplama hacmine göre (<100 μL, 24 kuyu; 100-200 μL, 12 kuyu; >200 μL, 6 kuyu)).
   11. Plakayı ters çevirin ve plakayı 37 °C'de 15-20 dakika inkübatördedinlendirin (Şekil 1C). Önceden ısınmış kültür ortamı ekleyin ve kültürleri inceleyin (Şekil 1C,D).

2. İdrardan insan böbrek tübuloidlerinin üretimi

NOT: İdrar hücreler için düşmanca bir ortamdır. İdrar örneklerinin mümkün olan en kısa sürede, tercihen atılımdan itibaren 4 saat içinde işlenmesi bu protokolün başarılı bir şekilde yürütülmesi için önemlidir. Bu arada idrar örnekleri 4 °C'de saklanmalıdır.

1. Malzeme
   1. 37 °C'de bir gecede prewarm multiwell doku kültürü plakaları (6, 12 ve 24 kuyular).
   2. Yıkama ortamını hazırlayın: Geniş spektrumlu antibiyotiklerle (0,1 mg/mL) ve 10 μM Y-27632 ile desteklenmiş AdDF+++.
   3. Yukarıda açıklandığı gibi kültür ortamı hazırlayın. Kullanmadan önce 37 °C'de ısınan.
   4. BME matrisini hazırlayın. İşlem sırasında buzda tutun.
2. Prosedür
   1. Bir idrar örneği toplayın ve eşit olarak 50 mL tüplere bölün (Şekil 2A-I). Tüplerin her birine 10-20 mL yıkama ortamı ekleyin. 4 °C'de 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüj(Şekil 2A-II)ve süpernatantı dikkatlice çıkarın.
   2. Tüplerin her birine 10 mL yıkama ortamı ekleyin. Peletleri 10 mL steril pipet kullanarak dikkatlice yeniden dirildi. 4 °C'de 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj(Şekil 2A-III)ve süpernatantı dikkatlice çıkarın.
   3. Peletleri yeniden haline alın ve tüm tüplerin içeriğini tek bir 15 mL tüpe aktarın. Tüpü yıkama ortamı ile doldurun. 4 °C'de 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj(Şekil 2A-IV)ve süpernatantı çıkarın.
   4. Bilinen bir birime ayarlanmış bir p1000 pipet kullanarak hücre peletinin hacmini ölçün. Hava kabarcıkları oluşturmadan yeniden dirimek için dikkatlice yukarı ve aşağı pipet. Tüpü 1 dakika boyunca buza aktarın.
   5. Pelete% 70-75 bme hacmi ekleyin. P1000 veya p200 pipet kullanarak yeniden biriktirin, ve plaka 15 μL damlacıklar önceden ısıtılmış, çok amaçlı hücre kültür plakasında (6, 12 veya 24 kuyular), toplam kaplama hacmine göre (<100 μL, 24 kuyu; 100-200 μL, 12 kuyu; >200 μL, 6 kuyu)).
   6. 37 °C'de 15-20 dakika boyunca inkübatörde plakaları ters çevirin. Önceden ısınmış kültür ortamı ekleyin ve kültürleri inceleyin (Şekil 2B).

3. Tübuloid kültürlerinin genişlemesi

NOT: Tubuloid kültürleri yaklaşık 1-2 haftada bir 1:2-1:3 bölünme oranı ile geçiş yapılabilir. Genellikle çizgiye özgü varyasyonlarla yaklaşık 15 pasaj için genişletilebilirler.

1. Malzeme
   1. 37 °C'de bir gecede prewarm multiwell doku kültürü plakaları (6, 12 ve 24 kuyular).
   2. Bazal ortam (AdDF+++) hazırlayın ve işlem sırasında buzda tutun.
   3. Daha önce açıklandığı gibi kültür ortamı hazırlayın. Kullanmadan önce 37 °C'ye kadar ısıtın.
   4. BME matrisini hazırlayın ve işlem sırasında buzda tutun.
   5. 10 μM konsantrasyona Y-27632 ilavesi ile tripsin değiştirme maddesi hazırlayın.
   6. Filtrelenmemiş p10 uçlarını otomatik olarak örtün.
   7. Santrifüjü 4 °C'ye soğutun.
2. Prosedür
   1. Kuyuda bulunan ortamı kullanarak bir p1000 pipet ile yukarı ve aşağı pipetleme yaparak tubuloidleri içeren damlacıkları bozun. Ucu, kuyunun altını kazımak için kullanın, tabana bağlı tüm hücreleri topladığından emin olun.
   2. İçeriği 15 mL'lik bir tüpte toplayın. 10 mL AdDF+++ ekleyin. 4 °C'de 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj ve süpernatantı çıkarın.
   3. Peletin boyutuna bağlı olarak, 10 μM Y-27632 ile desteklenmiş tripsin yedek maddesi ekleyin. Tubuloid içeren 200 μL BME damlacıkları için 1 mL tripsin replasman maddesi kullanın. 5 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkaya yaslanın.
   4. Uçlu bir p1000 pipet kullanın ve 1000 μL ucun üzerine filtrelenmemiş, steril bir p10 ucu yerleştirin. Pipet, organoidleri mekanik olarak bozmak için 20-30x boyunca yukarı ve aşağı.
   5. Tüpte hala çok sayıda sağlam organoid olup olmadığını görmek için mikroskop altında kontrol edin (Şekil 3A). Bu noktada sağlam organoidlerin% 10'undan fazlası mevcutsa, 3.2.3 adımındaki 5 dakikalık inkübasyondan, 3.2.5 adımdaki bozulmamış organoidler için mikroskobik gözleme bir kez daha tekrarlayın. Aksi takdirde, adım 3.2.6 ile devam edin.
   6. Tüpü AdDF+++ ile doldurun. 4 °C'de 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüj ve süpernatantı çıkarın. Bilinen bir birime ayarlanmış bir p1000 pipet kullanarak hücre peletinin hacmini ölçün. Hava kabarcıkları oluşturmadan yeniden dirimek için dikkatlice yukarı ve aşağı pipet. Tüpü 1 dakika boyunca buza aktarın.
   7. Pelete% 70-75 hacim bme ekleyin. P1000 veya p200 pipet kullanarak yeniden biriktirin, ve plaka 15 μL damlacıklar önceden ısıtılmış, çok amaçlı hücre kültür plakasında (6, 12 veya 24 kuyular), toplam kaplama hacmine göre (<100 μL, 24 kuyu; 100-200 μL, 12 kuyu; >200 μL, 6 kuyu)).
   8. Plakaları ters çevirin ve plakayı 37 °C'de 15-20 dakika boyunca inkübatörde dinlendirin. Önceden ısınmış kültür ortamı ekleyin ve kültürleri inceleyin (Şekil 3B).

Sonuçlar

Böbrek dokusu için, tübuloid yapılar tipik olarak kurulduktan sonraki 7 gün içinde ortaya çıkar(Şekil 1D). İlk 7 gün içinde belirgin bir büyüme olmaması, protokolün başarısız bir sonucuna işaret ediyor. Genellikle, tübuloid kültürlerinin ilk kaplamadan sonraki 1-2 hafta içinde geçirilmesi gerekir. İdrar için, hücre büyümesi kurulduktan yaklaşık 14-21 gün sonra, plakanın altındaki kompakt tübuloid yapıların ve / veya yapışık hücrelerin ortaya çıkmasıyla belirginleşir (Şekil 2B). Kaplamadan sonraki 4 hafta içinde brightfield mikroskobu ile büyüme tespit edilemezse kültür kuruluşu büyük olasılıkla başarısız olmuştur. İdrar türevi kültürler için, ilk geçiş genellikle 3 ila 4 hafta arasında gerçekleşir. İlk pasajlarda böbrek tübuloid kültürleri esas olarak kompakt yapılardan oluşurken, geçiş sayısının artmasıyla kistik epitel tubuloidlerin varlığı artar (Şekil 1D ve Şekil 2B). İnsan böbrek tübuloid kültürlerinin başarılı nesli, eşleştirilmiş kutu gen 8 proteini (PAX8) gibi tübüler böbrek epitelinde ifade edilen belirteçler için immünohistokimyasal boyama yapılarak değerlendirilebilir (Şekil 4A,B).

Şekil 1: Dokudan türetilmiş böbrek tübuloid kültürleri. (A) Böbrek dokusunu kıyma prosedürüne genel bakış. Doku neşterler kullanılarak ~1 mm³ boyutuna kıyılır. (B) Sağlıklı böbrek dokusunun doğru enzmatik sindirimi örneği. Kollajenaz ile 45 dk enzimamatik sindirim öncesi (sol) ve sonrası doku gösterilir. Tüpün dibinde hala birkaç doku parçası görülebilir ve çözelti bulanık hale gelmelidir, bu da süspansiyondaki hücrelerin varlığını gösterir. (C) İşlenmiş böbrek dokusunu içeren BME damlacıklarının kapladıktan sonra hücre kültürü plakalarının temsili görüntüsü. Damlacıkları kapladıktan sonra, kültür plakaları ters çevrilir (solda) ve 37 ° C'de inkübatöre yerleştirilir. 15-20 dk sonra, kuyuya önceden ısınmış kültür ortamı eklenir (sağda). (D) Doku türevi tubuloid kültürlerinin temsili parlak alan görüntüleri. İlk tübuloid yapılar ilk tohumlamadan 2-3 gün sonra görünür hale gelir. Artan geçiş sayılarıyla, tübuloidler tipik olarak morfolojiyi daha kistik bir fenotipe değiştirir. Ölçek çubukları = 300 μm. Kısaltmalar: BME = bodrum membran özü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: İdrardan elde edilen böbrek tübuloid kültürleri. (A) İdrar örneği işlemeye genel bakış. Toplamadan en kısa sürede sonra (I), idrar örnekleri 50 mL tüplere ayrılır ve yıkama ortamında seyreltilir (II). İkinci bir yıkama adımından sonra (III), tüplerin içeriği havuzlanır ve kaplamadan önce üçüncü ve son yıkama adımı (IV) gerçekleştirilir. (B) İdrar türevi tubuloid kültürlerinin temsili brightfield görüntüleri. İlk tubuloid yapılar ve yapışık hücreler ilk kaplamadan sonraki 21 gün içinde görülebilir olmalıdır. Ölçek çubukları = 300 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Böbrek tübuloid kültürlerinin geçişi. (A) Enzimyak sindirim sonrası böbrek tübuloid kültürlerinin temsili görüntüsü. Sindirimi tamamladıktan sonra, bozulmamış tübuloid yapıların% 10'undan fazlası kalmamalıdır. Ölçek çubuğu = 300μm. (B) Kaplamadan sonra böbrek tübuloid kültürlerinin temsili görüntüsü. Kültürlerin incelenmesi, tubuloidlerin çoğunluğunun bozulduğunu doğrular. Ölçek çubuğu = 300 μm Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Tübuloid kültürlerinin histolojik karakterizasyonu. (A) Sağlıklı böbrek dokusu ve tübuloidlerin H&E lekelenmesi. Ölçek çubukları = 100 μm. (B) Normal böbrek dokusunda, tübüloidlerde, MRTK dokusunda ve MRTK organoidlerinde PAX8 immünostokimyası. Organoid yapıların PAX8 pozitifliği böbrek epitel kökenlerini doğrular. Sağlıklı böbrek dokusu hem pozitif (tübüller) hem de negatif yapıları (glomeruli) gösterir. MRTK dokusu ve organoidler negatif kontrol olarak dahil edildi. Ölçek çubukları = 100 μm. Kısaltmalar: H&E = hematoksilin ve eozin; PAX8 = eşleştirilmiş kutu geni 8; MRTK = böbreğin malign rabdoid tümörü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışmalar

Organoidler, türedikleri dokunun avatarları olarak kabul edilir. Menşe dokusunun genotipik ve fenotipik özelliklerini korurken hasta materyalinin hızlı genişlemesine izin verirler¹⁵. Organoid teknolojisi son zamanlarda, bulguları tezgahtan başucuna çevirmek için önemli araçlar olarak kullanılabilecek daha temsili preklinik modellerin geliştirilmesi için kapıları açmıştır. Böbrek tübüloidleri, birçok kemoterapötik ilacın ortak bir yan etkisi olan ilaca bağlı nefrotoksisi test etmek için in vitro modeller vaat ediyor^2,8,12. Bu nedenle, hasta kaynaklı tümör organoid kültürlerinin tedaviye hasta yanıtı için tahmine dayalı olduğu gösterilmiştir^16,17,18. Bu nedenle ilaçların tübuloidler üzerinde yüksek verimli bir şekilde test etmek potansiyel olarak terapötik pencerelerin daha iyi tanımlanmasına izin verir ve hastalarda ilaca bağlı nefrotoksisite riskini azaltır.

Yaygın olarak kullanılan antibiyotiklerin böbrekler üzerinde toksik bir etki yarattığı tanımlanmıştır¹⁹. Kontaminasyonu önleyerek kültürlerin başarılı bir şekilde kurulması için geniş spektrumlu antibiyotiklerin varlığı gerekli olsa da, potansiyel nefrotoksisitelerini göz önünde bulundurmak önemlidir. Tübuloid kültürlerinin kurulmasında antibiyotiklerin olumsuz bir etkisi gözlenmemiş olsa da, etkilerini iyice değerlendirmek için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır. Tubuloidler hastalıkları incelemek ve modellemek için kullanılabilir⁸. Ciliopatiler (cilia patolojik disfonksiyonu) ve böbreği etkileyen diğer genetik sendromlar, doğrudan etkilenen deneklerden tubuloid çizgileri üreterek veya CRISPR/Cas9 genom düzenleme ile hastalığa özgü sürücü mutasyonlarının getirilebileceği sağlıklı kültürler kullanılarak incelenebilir²⁰.

Tübuloidler çok hücreli böbrek kültürleri olmasına rağmen, podositler ve endotel hücreleri de dahil olmak üzere çeşitli böbrek hücresi tiplerinden^{yoksundurlar 8}. Ayrıca, diğer bazı ASC türevi organoid modellerinin aksine, tubuloidler yaklaşık 15 pasaj için kültürlenebildiği için sınırlı bir çoğaltıcı potansiyele sahiptir. Bununla birlikte, bu sınırlı ömür, Wnt'nin kültür ortamına eklenmesiyle önemli ölçüde uzatılabilir²¹. Tubuloid kültür protokolünün daha da optimizasyonu, daha farklı hücre tipleri de dahil olmak üzere böbreği daha da temsil etmelerini sağlamak için gereklidir. Doku örneklerinden tübuloid kuruluşunun verimliliği çok yüksek olmasına rağmen (%>95), nadir durumlarda başarısız olabilir. Aşağıdakiler de dahil olmak üzere farklı nedenler olabilir: 1) başlangıç malzemesinin kalitesiz(örneğin,ilaç tedavisinin bir sonucu olarak nekrotik doku), 2) doku örneğinin aşırı sindirilmesi veya 3) birincil numunenin kirlenmesi.

Alınan doku örneklerinin kalitesinin protokole devam etmek için yeterli olduğundan emin olmak için, ameliyat üzerine dokunun değerlendirmesini yapan patoloji personeli ile yakın temasın sürdürülmesi önemlidir. Yeterli malzeme mevcutsa, canlılığı histolojik muayene ile doğrulanmalıdır(örneğin,hematoksilin ve eozin lekeleme). Ayrıca, enzimatik sindirim sırasında hücre lizizini önlemek için, inkübasyon prosedürünün 1 saatten uzun olmaması önemlidir. Son olarak, bulaşmayı önlemek için, yıkama ve kültür ortamına antibiyotikler ve antifungal ajanlar eklenmelidir.

İdrar, böbrekten elde edilmeyen pul pul dökülmüş epitel hücreleri içerebilir²²Tubuloid kültürlerini kirletebilir. Bunlar, örneğin, renal tübüler hücrelerin aksine, tümör proteini P63 için pozitif ve PAX8⁸için negatif olan ürotel hücrelerini içerir. Bu nedenle, takip deneylerine devam etmeden önce yerleşik böbrek tübuloid hatlarının saflığını doğrulamak için kültürlerin PAX8 pozitifliği açısından test etmesi önerilir (Şekil 4B).

İdrar, yüksek ozmotik basınç ve düşük pH nedeniyle hücreler için düşmanca bir ortamı temsil eder. Bu nedenle, numunelerin idrar toplama sırasında mümkün olan en kısa sürede işlenmesi protokolün başarısı için çok önemlidir. Bu nedenle, toplanan idrar seyreltilmeli ve tohumlama anında canlı hücrelerin varlığını sağlamak için mümkün olan en kısa sürede tamponlanmış çözelti ile kapsamlı bir şekilde yıkanmalıdır. İdrar işlemden önce birkaç saat saklanırsa tübuloid kuruluşunun başarı oranı önemli ölçüde azalacaktır. Son olarak, steril olmasına rağmen, idrarın toplama işlemiyle ilişkili yüksek kontaminasyon riski vardır. Bu nedenle yıkama ve büyüme ortamını antibiyotikler ve antifungal ajanlarla takviye etmek önemlidir. Yukarıdakilerin tümü dikkate alındığında yaklaşık %50'lik bir başarı oranı elde edilebilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
A83-01	Tocris	2939/10	Stock of 5 mM, final concentration of 5 µM, activin receptor-like kinase 5 inhibitor
Advanced DMEM/F12	ThermoFisher Scientific	12634010
antiPAX8 antibody	LSBio	LS-B13466
B27 supplement	ThermoFisher Scientific	17504044	Stock of 50x, final concentration of  1x
BME	Trevigen	3533-010-02
Collagenase	Sigma Aldrich	C9407	Stock of 10 mg/mL, final concentration of 1 mg/mL
EGF	Peprotech	AF-100-15	Stock of 0.5 mg/mL, final concentration of 50 ng/mL
FGF10	Peprotech	100-26	Stock of 0.1 mg/mL, final concentration of 100 ng/mL
GlutaMAX - L-alanine/L-glutamine	Gibco	35050061	Stock of 100x, final concentration of 1x
Hepes	Gibco	15630106	Stock of 1 M, final concentration of 10 mM
Multiwell tissue culture plates 12 wells	CELLSTAR	665180
Multiwell tissue culture plates 24 wells	CELLSTAR	662160
Multiwell tissue culture plates 6 wells	CELLSTAR	657160
N-acetylcysteine	Sigma Aldrich	A9165	Stock of 500 mM, final concentration of 1.25 mM
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140163	Stock of 10.000 U/mL, final concentration of  100 U/mL
Primocin - broad-range antibiotics	Invivogen	ant-pm-1	Stock of 50 mg/mL, final concentration of 0.1 mg/mL
Red blood cells lysis buffer	Roche	11814389001
RhoKinase inhibitor Y-27632	Abmole Bioscience	M1817	Stock of 100 mM, final concentration of 10 µM
R-spondin conditioned medium			Produced in house with the use of stable cell lines generated by Calvin Kuo lab. Final concentration is 10%
TrypLe Express/ trypsin replacement agent	ThermoFisher Scientific	12605010