Генерация почечных тубулоидов человека из тканей и мочи

Резюме

Тубулоидные культуры почек человека представляют собой ценную модель in vitro для изучения физиологии и заболеваний почек. Тубулоиды могут быть получены из почечной ткани (здоровой и больной), а также мочи, причем последняя представляет собой легко доступный и менее инвазивный источник исследовательского материала.

Аннотация

Эпителиальные органоиды почек человека, полученные из взрослых стволовых клеток (ASC), или тубулоиды, могут быть получены из здорового и больного эпителия почек с высокой эффективностью. Нормальные почечные тубулоиды повторяют многие аспекты своей ткани происхождения. Они представляют собой отдельные сегменты нефронов - в первую очередь проксимального канальца, петли Генле, дистальных канальцев и собирающего протока - и могут быть использованы для изучения нормальной физиологии почек. Кроме того, тубулоидная технология облегчает моделирование заболеваний, например,для инфекционных заболеваний, а также для рака. Получение эпителиальных клеток почки для генерации тубулоидов, однако, зависит от остатков хирургического материала (таких как частичная) нефрэктомия) или биопсии иглы. Способность выращивать тубулоиды из мочи обеспечит альтернативный, менее инвазивный источник здоровых эпителиальных клеток почек. Ранее было показано, что тубулоидные культуры могут быть успешно получены всего из нескольких миллилитров свежесбранной мочи. В этой статье описываются протоколы для создания и распространения ансульских культур почек человека из образцов тканей и мочи.

Введение

Почки выполняют функцию системного контроля баланса жидкостей организма. Нарушение их физиологической функции может быть вызвано различными факторами, включая диабет, гипертонию и лекарственную токсичность^1. Для лучшего понимания нормальной физиологии почек, а также развития почечных заболеваний, использование репрезентативных доклинических моделей имеет решающее значение. В последние годы было сгенерировано несколько моделей почек in vitro на основе так называемой органоидной технологии^2. Органоиды представляют собой трехмерные, многоклеточные структуры, напоминающие морфологию и физиологию ткани (нормальной или больной), из которой они происходят. Они могут быть получены из плюрипотентных (PSC) или взрослых стволовых клеток (ASC), каждый из которых имеет свои собственные характеристики и применения.

Органоиды почек, полученные из PSC, имитируют нефрогенез^3,4,5. Они также могут быть установлены из производных от пациента совершенных клеток путем принудительной дедифференциации (индуцированная плюрипотентность или iPSC). ИПСК впоследствии могут быть дифференцированы в различные типы клеток нефрона, функциональной единицы почки, путем своевременного воздействия специфических коктейлей фактора роста. При создании довольно полного мини-органа в блюде их создание остается трудоемким, а благодаря протоколу перепрограммирования иПСК могут быть подвержены нежелательной генетической нестабильности^6. Кроме того, органоиды iPSC не способны полностью созревать во взрослые клетки почек, выявляя профиль транскриптома, который напоминает почку плода на ранней стадии развития^7.

Было показано, что тубулоиды почек человека, полученные из ASC, повторяют обновление эпителия почек взрослых. Они в первую очередь представляют собой проксимальный каналец, петлю Генле, дистальные канальцы и собирающий проток, что подтверждается экспрессией различных белков-транспортеров^8,9,10. Протокол тубулоидной культуры позволяет быстро расширять ткани почек, полученных пациентом, сохраняя при этом стабильный геном. Исследовательские приложения включают изучение нормальной физиологии почек, нефротоксичности, тестирование лекарств, а также моделирование заболеваний^8,10,11,12. Потенциальным ограничением создания органоидных культур, полученных от пациента, включая тубулоиды, является наличие свежих тканей. Тем не менее, несколько отчетов показали, что моча может служить источником эпителиальных клеток почек, тем самым обеспечивая гораздо более простую, менее инвазивную стратегию получения материала пациента для тубулоидных культур^8,13,14. Действительно, недавно было показано, что тубулоиды можно выращивать из мочи^8. В данной статье описывается создание и поддержание тубулоидных культур из почечной ткани и мочи.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперименты, описанные в настоящем документе, были одобрены медицинским этическим комитетом Медицинского центра Эразма (Роттердам, Нидерланды) и Центром детской онкологии принцессы Максимы (Утрехт, Нидерланды).

1. Генерация почечных тубулоидов человека из ткани

1. Материалы
   1. Предваряемые многоязычные пластины для культивирование тканей (6, 12 и 24 скважины) на ночь при 37 °C.
   2. Готовят базальную среду (AdDF+++), добавляя 1x добавку L-аланина/L-глутамина, 1% мас./v 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазин этанесульфоновую кислоту (HEPES, 10 мМ) и 1% пенициллин/стрептомициновые антибиотики к Advanced DMEM/F12.
   3. Готовят культуральную среду, добавляя 1,5% добавки B27, 10% R-спондин-кондиционированную среду, эпидермальный фактор роста (50 нг/мл), фактор роста фибробластов-10 (100 нг/мл), N-ацетилцистеин (1,25 мМ), ингибитор ро-киназы Y-27632 (10 мкМ), антибиотики широкого спектра действия (0,1 мг/мл) и A83-01 (5 мкМ) к AdDF+++. Перед использованием нагревают до 37 °C.
   4. Приготовьте экстракт базальной мембраны (BME), разморозив аликвоту на ночь при 4 °C. Держите BME на льду во время процедуры.
   5. Готовят раствор коллагеназы путем разведения коллагеназы до конечной концентрации 1 мг/мл в AdDF+++, с добавлением 10 мкМ Y-27632. Прогреть до 37 °C.
   6. Приготовьте 10 см чашки Петри, скальпели и пинцет. Продезинфицируйте посуду, применяя ультрафиолетовую лампу в течение 20 мин, с последующим промыванием дезинфицирующим средством, полуводой и 70% v/v этанола. Высушите посуду на воздухе.
   7. Предваренный горизонтальный шейкер до 37 °C.
2. Процедура
   1. Соберите почечную ткань в пробирке 50 мл, заполненной 30-40 мл среды AdDF+++. Поместите кусочек ткани в ~1 мл среды в чашку Петри 10 см. Измерзайте ткань на кусочки размером ~1 мм³ с помощью скальпелей(рисунок 1А).
   2. Переложите измельченную ткань в трубку 15 мл с помощью щипцов и скальпелей. Добавьте 5 мл AdDF+++ в чашку Петри, вымойте и соберите среду стерильной пипеткой 10 мл. Переложите все это содержимое в одну трубку.
   3. Центрифугу при 300 × г в течение 5 мин при комнатной температуре и удаляют супернатант. Добавьте 3-4 мл раствора коллагеназы в пробирку 15 мл. Переместите трубку в горизонтальный шейкер, установленный при 37 °C и скорости 250 об/мин.
   4. После первых 15 мин инкубации проверьте образец и энергично встряхните трубку. Повторяют до тех пор, пока суспензия не будет однородной и большинство кусочков ткани не исчезнут, с максимальным временем инкубации 45-60 мин.(Рисунок 1В).
   5. Заполните трубку AdDF+++ и перемешайте, перевернив трубку в 5-10 раз. Центрифугу при 300 × г в течение 5 мин при 4 °С и удаляют супернатант. Если гранула красного цвета, перейдите к шагу 1.2.6. В противном случае перейдите к шагу 1.2.8.
   6. Добавьте 1 мл буфера лизиса эритроцитов (см. Таблицу материалов)поверх клеточной гранулы. Осторожно постучите по трубке, чтобы повторно суспендировать гранулу (не повторно суспендируйте с помощью наконечника пипетки). Инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин.
   7. Заполните трубку AdDF+++. Центрифугу при 300 × г в течение 5 мин при 4 °С и удаляют супернатант. Если клетки крови все еще видны, повторите процедуру еще раз, начиная с шага 1.2.6. В противном случае перейдите к шагу 1.2.8.
   8. Если в этой точке протокола видны куски ткани, перейдите к шагу 1.2.8. В противном случае приступайте к измерению объема гранул на этапе 1.2.9. Добавьте 5 мл AdDF+++ в пробирку и повторно суспендировать 10 мл стерильной пипеткой. Фильтруйте суспензию через ситечко нейлоновых клеток толщиной 100 мкм, помещенное на трубку 50 мл.
   9. Перенесите отфильтрованную суспензию в новую трубку 15 мл. Центрифугу при 300 × г в течение 5 мин при 4 °С и удаляют супернатант. Измерьте объем ячейки гранулы с помощью пипетки p1000, установленной на известный объем. Осторожно пипетку вверх и вниз, чтобы повторно суспендировать, не создавая пузырьков воздуха. Переложить трубку на лед на 1 мин.
   10. Добавьте 70-75% объема BME в гранулу. Повторное суспендирование с использованием пипетки p1000 или p200 и пластины капель 15 мкл в предварительно разоплавленной многоязычной клеточной культуральной пластине (6, 12 или 24 скважины, исходя из общего объема гальванировки (<100 мкл, 24 скважины; 100-200 мкл, 12 скважин; >200 мкл, 6 скважин)).
   11. Переверните тарелку вверх дном, и дайте пластине покоиться в инкубаторе в течение 15-20 мин при 37 °C(рисунок 1C). Добавьте предварительно распавленную питательную среду и осмотрите культуры(рисунок 1С,D).

2. Генерация почечных тубулоидов человека из мочи

ПРИМЕЧАНИЕ: Моча является враждебной средой для клеток. Для успешного выполнения этого протокола важно, чтобы образцы мочи обрабатывались как можно скорее, предпочтительно в течение 4 ч от выведения. В то же время образцы мочи должны храниться при 4 °C.

1. Материалы
   1. Предваряемые многоязычные пластины для культивирование тканей (6, 12 и 24 скважины) на ночь при 37 °C.
   2. Приготовить моющее средство: AdDF+++ дополнено антибиотиками широкого спектра действия (0,1 мг/мл) и 10 мкМ Y-27632.
   3. Подготовьте культурную среду, как описано выше. Разогрейте при 37 °C перед использованием.
   4. Подготовьте матрицу BME. Держите на льду во время процедуры.
2. Процедура
   1. Соберите образец мочи и разделите его поровну на пробирки по 50 мл(рисунок 2А-I). Добавьте 10-20 мл моющее средство в каждую из пробирок. Центрифугу при 300 × г в течение 5 мин при 4 °C(рисунок 2A-II)и осторожно удаляют супернатант.
   2. Добавьте 10 мл моющее средство в каждый из пробирок. Тщательно повторно суспендируете гранулы, используя стерильную пипетку 10 мл. Центрифугу при 300 х г в течение 5 мин при 4 °C(рисунок 2A-III)и осторожно удаляют супернатант.
   3. Повторно суспендируют гранулы и переложите содержимое всех пробирок в одну трубку объемом 15 мл. Наполните трубку моющее средство. Центрифугу при 300 х г в течение 5 мин при 4 °C(рисунок 2A-IV)удаляют и удаляют супернатант.
   4. Измерьте объем ячейки гранулы с помощью пипетки p1000, установленной на известный объем. Осторожно пипетку вверх и вниз, чтобы повторно суспендировать, не создавая пузырьков воздуха. Переложить трубку на лед на 1 мин.
   5. Добавьте 70-75% объема BME в гранулу. Повторное суспендирование с использованием пипетки p1000 или p200 и пластины капель 15 мкл в предварительно разоплавленной многоязычной клеточной культуральной пластине (6, 12 или 24 скважины, исходя из общего объема гальванировки (<100 мкл, 24 скважины; 100-200 мкл, 12 скважин; >200 мкл, 6 скважин)).
   6. Переверните тарелки вверх дном в инкубаторе на 15-20 мин при 37 °C. Добавьте предварительно высупленную питательную среду и осмотрите культуры(рисунок 2B).

3. Расширение тубулоидных культур

ПРИМЕЧАНИЕ: Тубулоидные культуры можно проходить примерно каждые 1-2 недели с соотношением расщепления 1:2-1:3. Они обычно могут быть расширены примерно на 15 проходов с вариациями, специфичными для линии.

1. Материалы
   1. Предваряемые многоязычные пластины для культивирование тканей (6, 12 и 24 скважины) на ночь при 37 °C.
   2. Подготовьте базальную среду (AdDF+++) и держите ее на льду во время процедуры.
   3. Подготовьте культурную среду, как описано выше. Прогрейте до 37 °C перед использованием.
   4. Подготовьте матрицу BME и держите на льду во время процедуры.
   5. Готовят трипсиновый заместитель с добавлением Y-27632 до концентрации 10 мкМ. Перед применением нагревают до 37 °C.
   6. Автоклавные нефильтрованные наконечники p10.
   7. Охладите центрифугу до 4 °C.
2. Процедура
   1. Разрушайте капли, содержащие тубулоиды, пипеткой вверх и вниз пипеткой p1000 с использованием среды, присутствующей в скважине. Используйте наконечник, чтобы соскрести дно колодца, убедившись, что собраны все ячейки, прикрепленные к дну.
   2. Соберите содержимое в пробирку объемом 15 мл. Добавьте 10 мл AdDF+++. Центрифугу при 300 х г в течение 5 мин при 4 °C и удалите супернатант.
   3. В зависимости от размера гранулы, добавьте заместитель трипсина, дополненное 10 мкМ Y-27632. Используйте 1 мл заменителя трипсина на 200 мкл капель BME, содержащих тубулоиды. Инкубировать при 37 °C в течение 5 мин.
   4. Используйте пипетку p1000 с наконечником и вставьте нефильтрованный, стерильный наконечник p10 поверх наконечника 1000 мкл. Пипетка вверх и вниз в течение 20-30 раз, чтобы механически нарушить работу органоидов.
   5. Проверьте под микроскопом, чтобы увидеть, много ли неповрежденных органоидов все еще присутствуют в трубке(рисунок 3A). Если в этой точке присутствует более 10% интактных органоидов, повторите от 5-минутной инкубации на этапе 3.2.3 до микроскопического наблюдения за интактными органоидами на этапе 3.2.5 еще раз. В противном случае перейдите к шагу 3.2.6.
   6. Заполните трубку AdDF+++. Центрифугу при 300 × г в течение 5 мин при 4 °С и удаляют супернатант. Измерьте объем ячейки гранулы с помощью пипетки p1000, установленной на известный объем. Осторожно пипетку вверх и вниз, чтобы повторно суспендировать, не создавая пузырьков воздуха. Переложить трубку на лед на 1 мин.
   7. Добавьте 70-75% объема BME в гранулу. Повторное суспендирование с использованием пипетки p1000 или p200 и пластины капель 15 мкл в предварительно разоплавленной многоязычной клеточной культуральной пластине (6, 12 или 24 скважины, исходя из общего объема гальванировки (<100 мкл, 24 скважины; 100-200 мкл, 12 скважин; >200 мкл, 6 скважин)).
   8. Переверните тарелки вверх дном, и дайте пластине отдохнуть в инкубаторе в течение 15-20 мин при 37 °C. Добавьте предварительно высупленную питательную среду и осмотрите культуры(рисунок 3В).

Результаты

Для почечной ткани тубулоидные структуры обычно появляются в течение 7 дней после установления(рисунок 1D). Отсутствие видимого роста в течение первых 7 дней свидетельствует о неудачном исходе протокола. Как правило, тубулоидные культуры необходимо пройти в течение 1-2 недель после первого покрытия. Для мочи рост клеток становится очевидным примерно через 14-21 день после установления, с появлением компактных тубулоидных структур и/или адгезивных клеток на нижней части пластины(рисунок 2B). Создание культуры, скорее всего, потерпело неудачу, если в течение 4 недель после нанесения покрытия не удалось обнаружить рост с помощью яркого микроскопа. Для культур, полученных из мочи, первое прохождение обычно происходит между 3 и 4 неделями. В то время как в первых проходах почечные тубулоидные культуры состоят в основном из компактных структур, наличие кистозных эпителиальных тубулоидов увеличивается с увеличением числа проходов(рис. 1D и фиг. 2В). Успешная генерация тубулоидных культур почек человека может быть оценена путем выполнения иммуногистохимического окрашивания маркеров, экспрессируемых в трубчатом эпителии почек, таких как парный белок бокс-гена 8 (PAX8) (рисунок 4A,B).

Рисунок 1:Тканевые тубулоидные культуры почек. (A) Обзор процедуры измельчения почечной ткани. Ткань измеивают до размера ~1^мм3 с помощью скальпелей. (B) Пример правильного ферментативного переваривания здоровой почечной ткани. Ткань показана до (слева) и после (справа) 45 мин ферментативного пищеварения с коллагеназой. На дне трубки еще видны немногие кусочки ткани, и раствор должен стать мутнеющим, что свидетельствует о наличии клеток в суспензии. (C) Репрезентативное изображение пластин клеточной культуры после нанесения капель BME, содержащих обработанную почечную ткань. После обшивки капель культуральная пластина переворачивают вверх дном (влево) и помещают в инкубатор при 37 °C. Через 15-20 мин в колодец добавляют предварительно прогремую питательную среду (справа). (D) Репрезентативные изображения ярких тубулоидных культур, полученных из тканей. Первые тубулоидные структуры становятся видимыми через 2-3 дня после первого посева. С увеличением числа проходов тубулоиды обычно изменяют морфологию на более кистозный фенотип. Шкала стержней = 300 мкм. Сокращения: BME = экстракт базальной мембраны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2:Тубулоидные культуры почек, полученные из мочи. (A) Обзор обработки образцов мочи. Как можно скорее после сбора(I)образцы мочи делят на пробирки по 50 мл и разводят в промывочной среде(II). После второй ступени промывки(III)содержимое трубок объединяются, а третья и заключительная этап промывки(IV)выполняется перед покрытием. (B) Репрезентативные изображения тубулоидных культур, полученных из мочи. Первые тубулоидные структуры и адгезивные клетки должны быть видны в течение 21 дня после первого покрытия. Шкала = 300 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3:Прохождение почечных тубулоидных культур. (А) Репрезентативное изображение тубулоидных культур почек после ферментативного пищеварения. После завершения пищеварения должно остаться не более 10% интактных тубулоидных структур. Шкала бара = 300 мкм. (B) Репрезентативное изображение почечных тубулоидных культур после нанесения покрытия. Осмотр культур подтверждает, что большинство тубулоидов были нарушены. Шкала = 300 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4:Гистологическая характеристика тубулоидных культур. (A) H&E окрашивание здоровой почечной ткани и тубулоидов. Шкала баров = 100 мкм. (B) Иммуногистохимия PAX8 в нормальной почечной ткани, тубулоидах, ткани MRTK и органоидах MRTK. PAX8 положительность органоидных структур подтверждает их эпителиальное происхождение почек. Здоровая почечная ткань показывает как положительные (канальцы), так и отрицательные структуры (клубочки). Ткани и органоиды МРТК были включены в качестве отрицательного контроля. Шкала баров = 100 мкм. Аббревиатуры: H&E = гематоксилин и эозин; PAX8 = парный бокс-ген 8; MRTK = злокачественная рабдоидная опухоль почки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

Органоиды считаются аватарами ткани, из которой они получены. Они позволяют быстро расширять материал пациента при сохранении генотипических и фенотипических характеристик ткани происхождения^15. Органоидная технология недавно открыла двери для разработки более репрезентативных доклинических моделей, которые могут быть использованы в качестве важных инструментов для перевода результатов со скамейки на прикроватную. Почечные тубулоиды являются перспективными моделями in vitro для тестирования лекарственно-индуцированной нефротоксичности, распространенного побочного эффекта многих химиотерапевтических препаратов^2,8,12. Таким образом, было продемонстрировано, что полученные от пациента опухолевые органоидные культуры прогностические для ответа пациента на лечение^16,17,18. Таким образом, тестирование лекарств с высокой пропускной способностью на тубулоидах потенциально позволяет лучше финировать терапевтические окна и снижает риск лекарственно-индуцированной нефротоксичности у пациентов.

Было описано, что обычно используемые антибиотики оказывают токсическое действие на почки^19. Хотя наличие антибиотиков широкого спектра действия необходимо для успешного создания культур путем предотвращения загрязнения, важно учитывать их потенциальную нефротоксичность. Хотя никаких негативных эффектов антибиотиков на создание тубулоидных культур не наблюдалось, необходимы дальнейшие исследования для тщательной оценки их эффектов. Тубулоиды могут быть использованы для изучения и моделирования заболеваний⁸. Цилиопатии (патологическая дисфункция ресничек), а также другие генетические синдромы, влияющие на почки, могут быть изучены либо путем генерации тубулоидных линий непосредственно от пораженных субъектов, либо с использованием здоровых культур, в которые мутации драйвера заболевания могут быть введены с помощью редактирования генома CRISPR / Cas9^20.

Хотя тубулоиды являются многоклеточными культурами почек, в них отсутствует несколько типов почечных клеток, включая подоциты и эндотелиальные клетки^8. Более того, в отличие от некоторых других органоидных моделей, полученных из ASC, тубулоиды имеют ограниченный репликативный потенциал, поскольку их можно культивировать примерно в течение 15 проходов. Однако эта ограниченная продолжительность жизни может быть значительно увеличена путем добавления Wnt к питательной среде^21. Требуется дальнейшая оптимизация протокола тубулоидных культур, чтобы сделать их еще более репрезентативными для почек, включая более дифференцированные типы клеток. Хотя эффективность тубулоидного учреждения из образцов тканей очень высока (>95%), она может, в редких случаях, выйти из строя. Могут быть различные причины, в том числе: 1) низкое качество исходного материала(например,некротическая ткань в результате медикаментозного лечения), 2) переваривание образца ткани или 3) загрязнение первичного образца.

Чтобы убедиться, что качество полученных образцов ткани достаточно для выполнения протокола, важно поддерживать тесный контакт с патологоанатомом, выполняющим оценку ткани после операции. При наличии достаточного количества материала его жизнеспособность должна быть подтверждена гистологическим исследованием(например,окрашиванием гематоксилина и эозина). Кроме того, для предотвращения лизиса клеток во время ферментативного пищеварения важно, чтобы процедура инкубации не превышала 1 ч. Наконец, для предотвращения загрязнения в промывные и культуральные среды следует добавлять антибиотики и противогрибкальные средства.

Моча может содержать отшелушиваемые эпителиальные клетки, которые не получены из почки^22,которые могут загрязнять тубулоидные культуры. К ним относятся, например, клетки уротелия, которые, в отличие от почечных канальцевых клеток, положительны для опухолевого белка P63 и отрицательны для PAX8^8. Поэтому рекомендуется проверить культуры на позитивность PAX8 для подтверждения чистоты установленных почечных тубулоидных линий, прежде чем приступать к последующим экспериментам(рисунок 4B).

Моча представляет собой враждебную среду для клеток из-за высокого осмотического давления и низкого рН. Поэтому для успеха протокола крайне важно, чтобы образцы обрабатывались как можно скорее после сбора мочи. Таким образом, собранную мочу следует как можно скорее разбавить и тщательно промыть буферным раствором, чтобы обеспечить наличие жизнеспособных клеток во время посева. Успешность тубулоидного учреждения значительно снизится, если моча будет храниться в течение нескольких часов перед обработкой. Наконец, хотя моча стерильная, она имеет высокий риск загрязнения, связанного с процессом сбора. Поэтому важно дополнять промывочную и питательную среду антибиотиками и противогрибковые средства. Принимая во внимание все вышесказанное, можно достичь успеха примерно в 50%.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
A83-01	Tocris	2939/10	Stock of 5 mM, final concentration of 5 µM, activin receptor-like kinase 5 inhibitor
Advanced DMEM/F12	ThermoFisher Scientific	12634010
antiPAX8 antibody	LSBio	LS-B13466
B27 supplement	ThermoFisher Scientific	17504044	Stock of 50x, final concentration of  1x
BME	Trevigen	3533-010-02
Collagenase	Sigma Aldrich	C9407	Stock of 10 mg/mL, final concentration of 1 mg/mL
EGF	Peprotech	AF-100-15	Stock of 0.5 mg/mL, final concentration of 50 ng/mL
FGF10	Peprotech	100-26	Stock of 0.1 mg/mL, final concentration of 100 ng/mL
GlutaMAX - L-alanine/L-glutamine	Gibco	35050061	Stock of 100x, final concentration of 1x
Hepes	Gibco	15630106	Stock of 1 M, final concentration of 10 mM
Multiwell tissue culture plates 12 wells	CELLSTAR	665180
Multiwell tissue culture plates 24 wells	CELLSTAR	662160
Multiwell tissue culture plates 6 wells	CELLSTAR	657160
N-acetylcysteine	Sigma Aldrich	A9165	Stock of 500 mM, final concentration of 1.25 mM
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140163	Stock of 10.000 U/mL, final concentration of  100 U/mL
Primocin - broad-range antibiotics	Invivogen	ant-pm-1	Stock of 50 mg/mL, final concentration of 0.1 mg/mL
Red blood cells lysis buffer	Roche	11814389001
RhoKinase inhibitor Y-27632	Abmole Bioscience	M1817	Stock of 100 mM, final concentration of 10 µM
R-spondin conditioned medium			Produced in house with the use of stable cell lines generated by Calvin Kuo lab. Final concentration is 10%
TrypLe Express/ trypsin replacement agent	ThermoFisher Scientific	12605010