Génération de tubuloïdes rénaux humains à partir de tissus et d’urine

Résumé

Les cultures de tubuloïdes rénaux humains représentent un modèle in vitro précieux pour étudier la physiologie et la maladie rénales. Les tubuloïdes peuvent être établis à partir de tissus rénaux (sains et malades) ainsi que d’urine, cette dernière représentant une source de matériel de recherche facilement accessible et moins invasive.

Résumé

Les organoïdes épithéliaux rénaux humains dérivés de cellules souches adultes (ASC), ou tubuloïdes, peuvent être établis à partir d’un épithélium rénal sain et malade avec une efficacité élevée. Les tubuloïdes rénaux normaux récapitulent de nombreux aspects de leur tissu d’origine. Ils représentent des segments de néphron distincts - notamment du tubule proximal, de l’anse de Henle, des tubules distaux et du canal collecteur - et peuvent être utilisés pour étudier la physiologie rénale normale. En outre, la technologie des tubuloïdes facilite la modélisation des maladies, par exemplepour les maladies infectieuses ainsi que pour le cancer. L’obtention de cellules épithéliales rénales pour la génération de tubuloïdes dépend toutefois des restes de matériel chirurgical (tels que les néphrectomies partielles) ou des biopsies à l’aiguille. La capacité de cultiver des tubuloïdes à partir de l’urine fournirait une source alternative, moins invasive, de cellules épithéliales rénales saines. Il a déjà été démontré que les cultures tubuloïdes peuvent être générées avec succès à partir de seulement quelques millilitres d’urine fraîchement collectée. Cet article décrit les protocoles pour générer et propager des cultures de tubuloïdes rénaux humains dérivés de l’ASC à partir d’échantillons de tissus et d’urine.

Introduction

Les reins remplissent la fonction de contrôle systémique de l’équilibre des fluides corporels. L’altération de leur fonction physiologique peut être causée par différents facteurs, notamment le diabète, l’hypertension et la toxicité induite par les médicaments¹. Pour une meilleure compréhension de la physiologie rénale normale ainsi que du développement des maladies rénales, l’utilisation de modèles précliniques représentatifs est cruciale. Ces dernières années, plusieurs modèles rénaux in vitro ont été générés sur la base de la technologie dite organoïde². Les organoïdes sont des structures tridimensionnelles et multicellulaires ressemblant à la morphologie et à la physiologie du tissu (normal ou malade) dont ils proviennent. Ils peuvent être générés à partir de cellules souches pluripotentes (PSC) ou adultes (ASC), chacune ayant ses propres caractéristiques et applications.

Les organoïdes rénaux dérivés de la CSP imitent la néphrogenèse^3,4,5. Ils peuvent également être établis à partir de cellules engagées dérivées du patient par dédifférenciation forcée (pluripotence induite ou iPSC). Les CSPic peuvent ensuite être différenciés en différents types de cellules du néphron, l’unité fonctionnelle du rein, par une exposition rapide à des cocktails de facteurs de croissance spécifiques. Tout en créant un mini-organe plutôt complet dans une parabole, leur établissement reste chronophage, et en raison du protocole de reprogrammation, les CSI IP peuvent être sensibles à une instabilité génétique indésirable⁶. De plus, les organoïdes iPSC ne sont pas capables de mûrir complètement en cellules rénales adultes, révélant un profil de transcriptome qui ressemble au rein fœtal à un stade précoce de développement^7.

Il a été démontré que les tubuloïdes rénaux humains dérivés de l’ASC récapitulent le renouvellement de l’épithélium rénal adulte. Ils représentent principalement le tubule proximal, la boucle de Henle, les tubules distaux et le canal collecteur, comme le confirme l’expression de différentes protéines transporteuses^8,9,10. Le protocole de culture tubuloïde permet l’expansion rapide du tissu rénal dérivé du patient, tout en conservant un génome stable. Les applications de recherche comprennent l’étude de la physiologie rénale normale, de la néphrotoxicité, des tests de drogues, ainsi que la modélisation des maladies⁸,^10,11,12. Une limitation potentielle de l’établissement de cultures organoïdes dérivées de patients, y compris les tubuloïdes, est la disponibilité de tissus frais. Cependant, plusieurs rapports ont montré que l’urine peut servir de source de cellules épithéliales rénales, fournissant ainsi une stratégie beaucoup plus simple et moins invasive pour obtenir du matériel patient pour les cultures tubuloïdes^8,13,14. En effet, il a été récemment démontré que les tubuloïdes peuvent être cultivés à partir de l’urine⁸. Cet article décrit l’établissement et l’entretien de cultures tubuloïdes à partir de tissus rénaux et d’urine.

Protocole

NOTE: Les expériences décrites ici ont été approuvées par le comité d’éthique médicale du Centre médical Erasmus (Rotterdam, Pays-Bas) et du Centre Princesse Máxima pour l’oncologie pédiatrique (Utrecht, Pays-Bas).

1. Génération de tubuloïdes rénaux humains à partir de tissus

1. Matériaux
   1. Plaques de culture tissulaire multipuit pré-préwarmes (6, 12 et 24 puits) pendant la nuit à 37 °C.
   2. Préparer le milieu basal (AdDF+++) en ajoutant 1x supplément de L-alanine/L-glutamine, 1 % p/v d’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazine éthanesulfonique (HEPES, 10 mM) et 1 % d’antibiotiques pénicilline/streptomycine à Advanced DMEM/F12.
   3. Préparer le milieu de culture en ajoutant 1,5 % de supplément de B27, un milieu conditionné à 10 % de R-spondine, un facteur de croissance épidermique (50 ng/mL), un facteur de croissance des fibroblastes de 10 (100 ng/mL), de la N-acétylcystéine (1,25 mM), un inhibiteur de la rho-kinase Y-27632 (10 μM), des antibiotiques à large spectre (0,1 mg/mL) et de l’A83-01 (5 μM) à AdDF+++. Réchauffer à 37 °C avant utilisation.
   4. Préparer l’extrait de membrane basale (EEM) en décongelant une aliquote pendant la nuit à 4 °C. Gardez le BME sur la glace pendant la procédure.
   5. Préparer la solution de collagénase en diluant la collagénase à une concentration finale de 1 mg/mL dans l’AdDF+++, avec l’addition de 10 μM Y-27632. Réchauffer jusqu’à 37 °C.
   6. Préparez des boîtes de Petri de 10 cm, des scalpels et des pinces à épiler. Désinfectez les ustensiles en appliquant une lampe ultraviolette pendant 20 minutes, suivie d’un lavage avec du désinfectant, de l’eau et de l’éthanol à 70% v / v. Séchez les ustensiles à l’air.
   7. Pré-pré-pré-pré-pré-pressent un agitateur horizontal à 37 °C.
2. Procédure
   1. Prélever du tissu rénal dans un tube de 50 mL rempli de 30 à 40 mL de milieu AdDF+++. Placez le morceau de tissu dans environ 1 mL de milieu dans une boîte de Petri de 10 cm. Émincez le tissu en morceaux de taille^~1 mm 3 à l’aide de scalpels (Figure 1A).
   2. Transférer le tissu haché dans un tube de 15 ml à l’aide d’une pince et d’un scalpel. Ajouter 5 mL d’AdDF+++ à la boîte de Pétri, laver et recueillir le milieu avec une pipette stérile de 10 mL. Transférer tout ce contenu dans le même tube.
   3. Centrifuger à 300 × g pendant 5 min à température ambiante et retirer le surnageant. Ajouter 3-4 mL de solution de collagénase dans le tube de 15 mL. Déplacez le tube vers un agitateur horizontal réglé à 37 °C et à une vitesse de 250 tr/min.
   4. Après les 15 premières minutes d’incubation, vérifiez l’échantillon et secouez vigoureusement le tube. Répéter jusqu’à ce que la suspension soit homogène et que la plupart des morceaux de tissu aient disparu, avec un temps d’incubation maximal de 45 à 60 min. (Figure 1B).
   5. Remplissez le tube avec de l’AdDF+++ et mélangez en inversant le tube 5-10x. Centrifuger à 300 × g pendant 5 min à 4 °C, et retirer le surnageant. Si la pastille est rouge, passez à l’étape 1.2.6. Sinon, passez à l’étape 1.2.8.
   6. Ajouter 1 mL de tampon de lyse des globules rouges (voir le tableau des matériaux)au-dessus de la pastille cellulaire. Tapotez doucement le tube pour ressuspender la pastille (ne pas ressuspend avec l’embout de la pipette). Incuber à température ambiante pendant 5 min.
   7. Remplissez le tube avec AdDF+++. Centrifuger à 300 × g pendant 5 min à 4 °C, et retirer le surnageant. Si les cellules sanguines sont encore visibles, répétez la procédure une fois de plus, à partir de l’étape 1.2.6. Sinon, passez à l’étape 1.2.8.
   8. Si des morceaux de tissu sont visibles à ce stade du protocole, passez à l’étape 1.2.8. Sinon, procédez à la mesure du volume de granulés à l’étape 1.2.9. Ajouter 5 mL d’AdDF+++ au tube et resuspendez avec une pipette stérile de 10 mL. Filtrer la suspension à travers une crépine à cellules en nylon de 100 μm placée sur un tube de 50 mL.
   9. Transférer la suspension filtrée dans un nouveau tube de 15 mL. Centrifuger à 300 × g pendant 5 min à 4 °C, et retirer le surnageant. Mesurez le volume de la pastille de cellule à l’aide d’une pipette p1000 réglée sur un volume connu. Pipetez soigneusement de haut en bas pour ressuspenter sans créer de bulles d’air. Transférer le tube sur de la glace pendant 1 min.
   10. Ajouter 70 à 75 % de volume de BME à la pastille. Remise en service à l’aide d’une pipette p1000 ou p200 et plaquer des gouttelettes de 15 μL dans une plaque de culture cellulaire pré-avertie à plusieurs puits (6, 12 ou 24 puits, en fonction du volume total de placage (<100 μL, 24 puits; 100-200 μL, 12 puits; >200 μL, 6 puits)).
   11. Tournez la plaque à l’envers et laissez la plaque reposer dans l’incubateur pendant 15-20 min à 37 °C(Figure 1C). Ajouter le milieu de culture pré-averti et inspecter les cultures (Figure 1C, D).

2. Génération de tubuloïdes rénaux humains à partir de l’urine

REMARQUE: L’urine est un environnement hostile pour les cellules. Il est important pour une exécution réussie de ce protocole que les échantillons d’urine soient traités dès que possible, de préférence dans les 4 heures suivant l’excrétion. En attendant, les échantillons d’urine doivent être conservés à 4 °C.

1. Matériaux
   1. Plaques de culture tissulaire multipuit pré-préwarmes (6, 12 et 24 puits) pendant la nuit à 37 °C.
   2. Préparer le milieu de lavage : AdDF+++ complété par des antibiotiques à large spectre (0,1 mg/mL) et 10 μM Y-27632.
   3. Préparez le milieu de culture comme décrit ci-dessus. Réchauffer à 37 °C avant utilisation.
   4. Préparez la matrice BME. Restez sur la glace pendant la procédure.
2. Procédure
   1. Prélever un échantillon d’urine et le diviser également en tubes de 50 mL(Figure 2A-I). Ajouter 10 à 20 mL de milieu de lavage à chacun des tubes. Centrifuger à 300 × g pendant 5 min à 4 °C(Figure 2A-II),et retirer soigneusement le surnageant.
   2. Ajouter 10 mL de milieu de lavage à chacun des tubes. Ressuspendez soigneusement les granulés à l’aide d’une pipette stérile de 10 mL. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 4 °C(Figure 2A-III),et retirer soigneusement le surnageant.
   3. Resuspendez les granulés et transférez le contenu de tous les tubes dans un tube de 15 mL. Remplissez le tube avec du produit de lavage. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 4 °C(Figure 2A-IV),et retirer le surnageant.
   4. Mesurez le volume de la pastille de cellule à l’aide d’une pipette p1000 réglée sur un volume connu. Pipetez soigneusement de haut en bas pour ressuspenter sans créer de bulles d’air. Transférer le tube sur de la glace pendant 1 min.
   5. Ajouter 70 à 75 % du volume du BME à la pastille. Remise en service à l’aide d’une pipette p1000 ou p200 et plaquer des gouttelettes de 15 μL dans une plaque de culture cellulaire pré-avertie à plusieurs puits (6, 12 ou 24 puits, en fonction du volume total de placage (<100 μL, 24 puits; 100-200 μL, 12 puits; >200 μL, 6 puits)).
   6. Tournez les plaques à l’envers dans l’incubateur pendant 15-20 min à 37 °C. Ajouter le milieu de culture pré-averti et inspecter les cultures (Figure 2B).

3. Expansion des cultures tubuloïdes

REMARQUE: Les cultures tubuloïdiques peuvent être adoptées environ toutes les 1-2 semaines avec un rapport de fractionnement de 1: 2-1: 3. Ils peuvent généralement être étendus sur environ 15 passages, avec des variations spécifiques à la ligne.

1. Matériaux
   1. Plaques de culture tissulaire multipuit pré-préwarmes (6, 12 et 24 puits) pendant la nuit à 37 °C.
   2. Préparez le milieu basal (AdDF+++) et conservez-le sur la glace pendant la procédure.
   3. Préparez le milieu de culture comme décrit précédemment. Réchauffer jusqu’à 37 °C avant utilisation.
   4. Préparez la matrice BME et conservez-la sur la glace pendant la procédure.
   5. Préparer l’agent de remplacement de la trypsine avec l’ajout de Y-27632 à une concentration de 10 μM. Réchauffer jusqu’à 37 °C avant utilisation.
   6. Autoclave non filtré p10 embouts.
   7. Refroidir la centrifugeuse à 4 °C.
2. Procédure
   1. Perturber les gouttelettes contenant les tubuloïdes en pipetant de haut en bas avec une pipette p1000 en utilisant le milieu présent dans le puits. Utilisez la pointe pour gratter le fond du puits, en vous assurant de recueillir toutes les cellules attachées au fond.
   2. Recueillir le contenu dans un tube de 15 mL. Ajoutez 10 mL d’AdDF+++. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 4 °C, et retirer le surnageant.
   3. En fonction de la taille de la pastille, ajouter un agent de remplacement de la trypsine complété par 10 μM Y-27632. Utilisez 1 mL d’agent de remplacement de la trypsine pour 200 μL de gouttelettes de BME contenant des tubuloïdes. Incuber à 37 °C pendant 5 min.
   4. Utilisez une pipette p1000 avec embout et insérez une pointe p10 stérile non filtrée sur l’embout de 1000 μL. Pipette de haut en bas pendant 20-30x pour perturber mécaniquement les organoïdes.
   5. Vérifiez au microscope si de nombreux organoïdes intacts sont encore présents dans le tube (Figure 3A). Si plus de 10% des organoïdes intacts sont présents à ce stade, répétez à nouveau l’incubation de 5 minutes à l’étape 3.2.3 à l’observation microscopique des organoïdes intacts à l’étape 3.2.5. Sinon, passez à l’étape 3.2.6.
   6. Remplissez le tube avec AdDF+++. Centrifuger à 300 × g pendant 5 min à 4 °C, et retirer le surnageant. Mesurez le volume de la pastille de cellule à l’aide d’une pipette p1000 réglée sur un volume connu. Pipetez soigneusement de haut en bas pour ressuspenter sans créer de bulles d’air. Transférer le tube sur de la glace pendant 1 min.
   7. Ajouter 70 à 75 % de volume de BME à la pastille. Remise en service à l’aide d’une pipette p1000 ou p200 et plaquer des gouttelettes de 15 μL dans une plaque de culture cellulaire pré-avertie à plusieurs puits (6, 12 ou 24 puits, en fonction du volume total de placage (<100 μL, 24 puits; 100-200 μL, 12 puits; >200 μL, 6 puits)).
   8. Tournez les plaques à l’envers et laissez reposer la plaque dans l’incubateur pendant 15-20 min à 37 °C. Ajouter le milieu de culture préwarmed et inspecter les cultures (Figure 3B).

Résultats

Pour le tissu rénal, les structures tubuloïdes apparaissent généralement dans les 7 jours suivant l’établissement(Figure 1D). L’absence de croissance apparente dans les 7 premiers jours indique un résultat infructueux du protocole. Généralement, les cultures de tubuloïdes doivent être adoptées dans les 1 à 2 semaines suivant le premier placage. Pour l’urine, la croissance cellulaire devient apparente environ 14 à 21 jours après l’établissement, avec l’apparition de structures tubuloïdes compactes et / ou de cellules adhérentes au bas de la plaque (Figure 2B). L’établissement de la culture a très probablement échoué si aucune croissance ne peut être détectée avec un microscope à champ lumineux dans les 4 semaines suivant le placage. Pour les cultures dérivées de l’urine, le premier passage se produit généralement entre 3 et 4 semaines. Alors que dans les premiers passages, les cultures de tubuloïdes rénaux sont principalement constituées de structures compactes, la présence de tubuloïdes épithéliaux kystique augmente avec l’augmentation du nombre de passages (Figure 1D et Figure 2B). La génération réussie de cultures de tubuloïdes rénaux humains peut être évaluée en effectuant une coloration immunohistochimique pour les marqueurs exprimés dans l’épithélium rénal tubulaire, tels que la protéine DU gène 8 de la boîte appariée (PAX8) (Figure 4A,B).

Figure 1: Culturesde tubuloïdes rénaux dérivés de tissus. (A) Aperçu de la procédure d’échissage du tissu rénal. Le tissu est haché à une taille d’environ 1 mm³ à l’aide de scalpels. (B) Exemple de digestion enzymatique correcte du tissu rénal sain. Le tissu est montré avant (à gauche) et après (à droite) 45 min de digestion enzymatique avec de la collagénase. Peu de morceaux de tissu sont encore visibles au bas du tube et la solution doit devenir trouble, indiquant la présence de cellules dans la suspension. (C) Image représentative des plaques de culture cellulaire après placage des gouttelettes de BME contenant le tissu rénal traité. Après le placage des gouttelettes, les plaques de culture sont retournées (à gauche) et placées dans l’incubateur à 37 °C. Après 15-20 min, un milieu de culture pré-averti est ajouté au puits (à droite). (D) Images représentatives en champ clair de cultures tubuloïdes dérivées de tissus. Les premières structures tubuloïdes deviennent visibles 2-3 jours après le premier ensemencement. Avec l’augmentation du nombre de passages, les tubuloïdes changent généralement de morphologie pour un phénotype plus kystique. Barres d’échelle = 300 μm. Abréviations : BME = extrait de membrane basale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2: Culturesde tubuloïdes rénaux dérivés de l’urine. (A) Vue d’ensemble du traitement des échantillons d’urine. Dès que possible après le prélèvement (I), les échantillons d’urine sont divisés en tubes de 50 mL et dilués dans un milieu de lavage (II). Après une deuxième étape de lavage (III), le contenu des tubes est regroupé et une troisième et dernière étape de lavage (IV) est effectuée avant le placage. ( B )Imagesreprésentatives en champ lumineux de cultures tubuloïdes dérivées de l’urine. Les premières structures tubuloïdes et les cellules adhérentes doivent être visibles dans les 21 jours suivant le premier placage. Barres d’échelle = 300 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3: Passage de cultures de tubuloïdes rénaux. (A) Image représentative de cultures de tubuloïdes rénaux après digestion enzymatique. Après avoir terminé la digestion, pas plus de 10% des structures tubuloïdes intactes ne doivent rester. Barre d’échelle = 300μm. (B) Image représentative de cultures de tubuloïdes rénaux après placage. L’inspection des cultures confirme que la majorité des tubuloïdes ont été perturbés. Barre d’échelle = 300 μm Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4: Caractérisation histologique des cultures tubuloïdes. (A) Coloration H&E du tissu rénal sain et des tubuloïdes. Barres d’échelle = 100 μm. (B) Immunohistochimie de PAX8 dans le tissu rénal normal, les tubuloïdes, le tissu MRTK et les organoïdes MRTK. La positivité PAX8 des structures organoïdes confirme leur origine épithéliale rénale. Le tissu rénal sain présente à la fois des structures positives (tubules) et négatives (glomérules). Les tissus et organoïdes MRTK ont été inclus comme témoin négatif. Barres d’échelle = 100 μm. Abréviations: H&E = hématoxyline et éosine; PAX8 = gène de boîte appariée 8; MRTK = tumeur rhabdoïde maligne du rein. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Les organoïdes sont considérés comme des avatars du tissu dont ils sont dérivés. Ils permettent une expansion rapide du matériel du patient tout en conservant les caractéristiques génotypiques et phénotypiques du tissu d’origine¹⁵. La technologie organoïde a récemment ouvert la porte au développement de modèles précliniques plus représentatifs, qui peuvent être utilisés comme des outils importants pour traduire les résultats du laboratoire au chevet du patient. Les tubuloïdes rénaux sont des modèles in vitro prometteurs pour tester la néphrotoxicité induite par les médicaments, un effet secondaire commun de nombreux médicaments chimiothérapeutiques^2,8,12. En tant que tels, il a été démontré que les cultures organoïdes tumorales dérivées du patient étaient prédictives de la réponse du patient au traitement^16,17,18. Tester les médicaments de manière à haut débit sur les tubuloïdes permet donc potentiellement une meilleure définition des fenêtres thérapeutiques et diminue le risque de néphrotoxicité induite par les médicaments chez les patients.

Les antibiotiques couramment utilisés ont été décrits pour exercer un effet toxique sur les reins¹⁹. Bien que la présence d’antibiotiques à large spectre soit nécessaire à la réussite de l’établissement des cultures en prévenant la contamination, il est important de tenir compte de leur néphrotoxicité potentielle. Bien qu’aucun effet négatif des antibiotiques n’ait été observé sur l’établissement de cultures tubuloïdes, des recherches plus approfondies sont nécessaires pour évaluer en profondeur leurs effets. Les tubuloïdes peuvent être exploités pour étudier et modéliser les maladies⁸. Les ciliopathies (dysfonctionnement pathologique des cils) ainsi que d’autres syndromes génétiques affectant le rein pourraient être étudiés soit en générant des raies tubuloïdes directement à partir de sujets affectés, soit en utilisant des cultures saines dans lesquelles des mutations de conducteur spécifiques à la maladie peuvent être introduites via l’édition du génome CRISPR / Cas9²⁰.

Bien que les tubuloïdes soient des cultures rénales multicellulaires, il leur manque plusieurs types de cellules rénales, y compris les podocytes et les cellules endothéliales⁸. De plus, contrairement à d’autres modèles organoïdes dérivés de l’ASC, les tubuloïdes ont un potentiel de réplication limité car ils peuvent être cultivés pendant environ 15 passages. Cette durée de vie limitée peut cependant être considérablement prolongée par l’ajout de Wnt au milieu de culture²¹. Une optimisation supplémentaire du protocole de culture tubuloïde est nécessaire pour les rendre encore plus représentatifs du rein, y compris des types de cellules plus différenciés. Bien que l’efficacité de l’établissement tubuloïdien à partir d’échantillons de tissus soit très élevée (>95%), elle peut, dans de rares cas, échouer. Il peut y avoir différentes causes, notamment: 1) mauvaise qualité du matériel de départ(par exemple,tissu nécrotique à la suite d’un traitement médicamenteux), 2) surdigestion de l’échantillon de tissu ou 3) contamination de l’échantillon primaire.

Pour s’assurer que la qualité des échantillons de tissus reçus est suffisante pour suivre le protocole, il est important de maintenir un contact étroit avec le personnel de pathologie effectuant l’évaluation du tissu lors de la chirurgie. Si suffisamment de matériel est disponible, sa viabilité doit être confirmée par un examen histologique (parexemple,coloration à l’hématoxyline et à l’éosine). De plus, pour éviter la lyse cellulaire pendant la digestion enzymatique, il est important que la procédure d’incubation ne soit pas supérieure à 1 h. Enfin, pour éviter toute contamination, des antibiotiques et des agents antifongiques doivent être ajoutés aux milieux de lavage et de culture.

L’urine peut contenir des cellules épithéliales exfoliées qui ne sont pas dérivées du rein²², ce qui peut contaminer les cultures tubuloïdes. Ceux-ci incluent, par exemple, les cellules urothéliales qui sont, contrairement aux cellules tubulaires rénales, positives pour la protéine tumorale P63 et négatives pour PAX8⁸. Il est donc recommandé de tester les cultures pour la positivité PAX8 afin de confirmer la pureté des lignes tubuloïdes rénales établies avant de procéder à des expériences de suivi (Figure 4B).

L’urine représente un environnement hostile pour les cellules en raison de la pression osmotique élevée et du faible pH. Il est donc crucial pour le succès du protocole que les échantillons soient traités dès que possible lors de la collecte d’urine. En tant que tel, l’urine recueillie doit être diluée et lavée abondamment avec une solution tamponnée dès que possible pour assurer la présence de cellules viables au moment de l’ensemencement. Le taux de réussite de l’établissement tubuloïdien diminuera considérablement si l’urine est stockée pendant plusieurs heures avant le traitement. Enfin, bien que stérile, l’urine présente un risque élevé de contamination associée au processus de collecte. Il est donc important de compléter le milieu de lavage et de croissance avec des antibiotiques et des agents antifongiques. En tenant compte de tout ce qui précède, un taux de réussite d’environ 50% peut être atteint.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
A83-01	Tocris	2939/10	Stock of 5 mM, final concentration of 5 µM, activin receptor-like kinase 5 inhibitor
Advanced DMEM/F12	ThermoFisher Scientific	12634010
antiPAX8 antibody	LSBio	LS-B13466
B27 supplement	ThermoFisher Scientific	17504044	Stock of 50x, final concentration of  1x
BME	Trevigen	3533-010-02
Collagenase	Sigma Aldrich	C9407	Stock of 10 mg/mL, final concentration of 1 mg/mL
EGF	Peprotech	AF-100-15	Stock of 0.5 mg/mL, final concentration of 50 ng/mL
FGF10	Peprotech	100-26	Stock of 0.1 mg/mL, final concentration of 100 ng/mL
GlutaMAX - L-alanine/L-glutamine	Gibco	35050061	Stock of 100x, final concentration of 1x
Hepes	Gibco	15630106	Stock of 1 M, final concentration of 10 mM
Multiwell tissue culture plates 12 wells	CELLSTAR	665180
Multiwell tissue culture plates 24 wells	CELLSTAR	662160
Multiwell tissue culture plates 6 wells	CELLSTAR	657160
N-acetylcysteine	Sigma Aldrich	A9165	Stock of 500 mM, final concentration of 1.25 mM
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140163	Stock of 10.000 U/mL, final concentration of  100 U/mL
Primocin - broad-range antibiotics	Invivogen	ant-pm-1	Stock of 50 mg/mL, final concentration of 0.1 mg/mL
Red blood cells lysis buffer	Roche	11814389001
RhoKinase inhibitor Y-27632	Abmole Bioscience	M1817	Stock of 100 mM, final concentration of 10 µM
R-spondin conditioned medium			Produced in house with the use of stable cell lines generated by Calvin Kuo lab. Final concentration is 10%
TrypLe Express/ trypsin replacement agent	ThermoFisher Scientific	12605010