Ağız Boşluğundan Simbiyotik Sakkarakterinin Kararlı İkili Kültürlerinin Kurulması

Özet

Diş plaklarını filtre ederek ve konak bakterilerle birlikte kültleştirerek, saccharibacteria adlı yeni bakteriyel fitülümün yetiştirilmede zor olan üyelerini izole etmek için bir yöntem gösteriyoruz.

Özet

Birçok bakteri türü standart yöntemler kullanılarak laboratuvarda kültürlenemez ve yeryüzündeki mikrobiyal çeşitliliğin çoğunluğunu incelemek için önemli bir engel oluşturur. Bu kültürsüz bakterileri kültüre etmek için yeni yaklaşımlar gereklidir, böylece araştırmacılar laboratuvarda bulunan güçlü araçları kullanarak fizyolojilerini ve yaşam tarzlarını etkili bir şekilde inceleyebilirler. Aday Phyla Radyasyon (CPR), dünyadaki canlı çeşitliliğinin ~ % 15'ini oluşturan en büyük kültürsüz bakteri gruplarından biridir. Bu grubun ilk izole saccharibacteria phylum bir üyesi oldu, 'Nanosynbacter lyticus' strain TM7x. TM7x bakteri konakçısı, Schaalia odontolytica, suş XH001 ile doğrudan temas halinde bir symbiont olarak yaşayan alışılmadık derecede küçük bir bakteridir. Alışılmadık derecede küçük hücre boyutundan ve simbiyotik bir organizma olarak yaşam tarzından yararlanarak, Saccharibacteria'yı diş plağını hızla kültüre etmek için bir protokol geliştirdik. Bu protokol, diş plağının askıya alınmasının 0,2 μm filtreden nasıl filtrelanacağını, daha sonra toplanan Saccharibacteria hücrelerinin nasıl konsantre olacağını ve konak organizma kültürünün nasıl enfekte olacağını gösterecektir. Ortaya çıkan kokültür, herhangi bir normal bakteri kültürü ve enfeksiyon PCR tarafından doğrulandıkça geçiş yapılabilir. Elde edilen ikili kültür laboratuvarda korunabilir ve gelecekteki deneyler için kullanılabilir. Kontaminasyon bir olasılık olsa da, ikili kültür, konağın daha fazla filtre edilmesi ve yeniden enfekte edilmesi veya ikili kültürün kaplanması ve enfekte koloniler için tarama ile arındırılabilir. Umarız bu protokol diğer örnek türlere ve ortamlara genişletilebilir ve cpr'da daha birçok türün yetiştirilmesine yol açabilir.

Giriş

Yeni bakteri türlerinin kült haline getirilmesi ve laboratuvara getirilmesi, güçlü deneylerin fizyolojilerini ve mikrobiyal topluluklarındaki daha geniş etkileşimlerini daha iyi anlamalarını sağlar. Bu soruları sorgulamanın kültürsüz yöntemleri (örneğin, "meta-omiks") olsa da, çeşitli mikrobiyal popülasyonların karmaşık etkileşimleri, tek değişkenleri birbirinden ayırmayı ve anlamlı sonuçlara ulaşmayı zorlaştırır. Bakterileri kültleştirmenin birçok faydası olsa da, bir bakteriyi izole etmenin ve saf kültürde yetiştirmenin birçok potansiyel engeli vardır. Potansiyel spesifik büyüme gereksinimleri arasında pH, oksijen gerginliği, vitaminler, büyüme faktörleri, sinyal molekülleri ve hatta büyümeyi ortaya çıkarmak için doğrudan hücre teması¹bulunur. Bununla birlikte, spesifik auxotrophies'in yeni bakteri türlerini kültlemede birincil caydırıcı olduğuna inanılmaktadır. Standart medya formülasyonları, belirli vitaminler veya karbon kaynakları gibi kültürsüz bakterilerin gerektirdiği birçok besin maddesinden yoksundir. Bu eksik moleküller, kültürsüz bakterilerin fizyolojisi için anahtar olabilir ve genellikle mikrobiyal topluluktaki başka bir organizma veya konak organizma tarafından sağlanır. Örneğin, mücinler gibi karmaşık karbonhidratlar hayvan konakçıları tarafından sağlanabilir. Bunları medyaya eklemek, Akkermansia muciniphila ve Mucinivorans hirudinis 2^,3,4dahil olmak üzere hayvan bağırsaklarından birkaç bakterinin yetiştirilmesine izin etti. Birçok patojenik bakteri, oral patojen Porphyromonas gingivalis⁵de dahil olmak üzere hayvan hücrelerinde hemin'e bağlı demir kullanma yeteneğini geliştirmüştür. Laboratuvarda, Porphyromonas ve diğer organizmaların büyümesi, hemin⁶ilavesi ile uyarılabilir.

Son zamanlarda, bakterilerin yeni izolelerini kültlemede birçok atılım, büyümeleri için gerekli olan kültürsüz bakterilere belirli faktörler sağlamak için bir "besleyici" organizma kullanarak birlikte kültleme yoluyla geldi. Vartoukian ve meslektaşları tarafından yapılan zarif bir çalışma, bakteriler tarafından üretilen demir bağlayıcı moleküller olan siderophores'un birkaç yeni oral izolatın büyümesini uyardığını göstermiştir. Pseudomonad türleri tarafından üretilen bir tür siderophoreolan pyoverdines , yeni bir Prevotella türünün büyümesini önemli ölçüde kolaylaştırdığı gösterilmiştir⁷. Aynı çalışmada, chloroflexi fitülotu için ilk oral izole, ayrıca F. nükleatum'un henüz bilinmeyen bileşik⁷sağlamak için yardımcı olarak kullanılmasıyla yetiştirildi. Daha yakın zamanda, Ruminococcaceae cinsinden bir bakteri, bacteroides fragilis yardımcı organizma olarak kullanılarak izole edildi⁸. Daha sonra laboratuvar ortamlarında büyüme için inhibitör bir nörotransmitter olan gama aminobütirik asidin (GABA) gerekli olduğu gösterilmiştir. Besleyici organizmaların kullanılması, kültürlenmemiş bakterilerin büyüdüğü belirli mikroçevreleri taklit etmek için önemli bir strateji olduğunu, büyüme ortamlarını farklı konsantrasyonlarda farklı katkı maddeleri ile sürekli olarak yeniden biçimlendirmekten daha verimli olduğunu kanıtlamıştır.

Kültürsüz bakterilerin en büyük gruplarından biri, birkaç aday bakteriyel phyla⁹,^10'danoluşan monofiletik bir grup^olan"Aday Phyla Radyasyonu" (CPR) içindedir. Bu yazıdan dolayı laboratuvarda sadece CPR içindeki Saccharibacteria fitilinin üyeleri başarıyla kültürlenmiştir. İlk izole, 'Nanosynbacter lyticus' suşu TM7x, kültürsüz TM7^11,12için zenginleşerek tahmin edilen antibiyotik streptomisin kullanılarak izole edildi. Bu çalışmanın önemli bir keşfi, yeni izolatın bakteri konak sahibi Schaalia odontolyticaile doğrudan temas halinde büyüyen bir parazit olarak büyümesi ve mikroskopinin bu parazitlerin ultrasmall bakteriler olduğunu göstermesiydi.

Bu ipuçlarını kullanarak, diş plağı ve diğer oral örnekleri 0,2 μm filtreden geçirerek, filtrattaki hücreleri santrifüjleme ile toplayarak ve aday konak bakteri kültürlerini enfekte etmek için kullanarak ortaklarıyla hızlı bir şekilde Sakkaripteri ikili kokültürleri oluşturmak için bir yöntem tasarladık. Bu yöntem, hızlı büyüyen organizmalarla boğulabilen zenginleştirme kültürlerinden kaçınma avantajına sahiptir. Ayrıca, hedeflenen Saccharibacteria türlerinin veya konaklarının büyümesini durdurabilecek antibiyotik kullanımından kaçınır. Burada gösterilen yöntemi kullanarak, Saccharibacteria fitilinden 32 izolatını başarıyla kültürledik.

Protokol

Bu protokol geliştirilirken IRB onayı aranarak onaylanmıştır (#14-10) ve tüm konulardan bilgilendirilmiş onam alınmıştır.

1. Hazırlık

1. İnsan deneklerle çalışırken, gerekli IRB onayını ve bilgilendirilmiş onayı alın.
2. Erken sabit faza büyümek için yeterli zamana sahip konak bakteri kültürlerine başlayın. Örneğin, 2-5 mL triptik soya suyunu% 0.1 maya özü eksik (TSBY) ile Arachnia propionica ile aşılayın ve 24 saat boyunca 37 ° C'de kuluçkaya yatırın.
3. Filtre tutucuları paletli 0,2 μm filtre membranıyla monte edin. Montajı folyoya sarın ve otomatik olarak kaplayarak sterilize edin.
4. Santrifüj tüplerini ve kapak montajlarını sterilize edin.

2. Oral bakteri örneği alın

NOT: Birçok oral örnek Saccharibacteria (örneğin tükürük, bademcik sürüntüleri, dil kazıma) diş plağı rutin olarak en başarılı olanıdır.

1. Steril bir kağıt noktası, Gracey curette kullanarak bir plak kazıma alın veya kendi kendine örnekleme yapıyorsanız steril bir kürdan veya pipet ucu kullanın. Planı maksimal geri kazanım seyreltici (MRD, %0,85 NaCl, %0,1 pepton) veya PBS gibi uygun bir tampona aktarın. Hemen işlenmezse, numuneyi devam etmeye hazır olana kadar buzda tutun.
2. Diş plağını MRD tamponunda, küçük bir pipet ucu ile girdaplama ve pipetleme kombinasyonu kullanarak kuvvetli bir şekilde yeniden depolayın.
3. Ek 9 mL MRD arabelleğine yeniden sulanmış plak örneği ekleyin.

3. Oral numuneden filtrat hazırlayın

1. Aseptik tekniği kullanarak steril bir filtre tertibatı çözün. İpliklerin düzgün takıldığından ve cihazın düzgün bir şekilde kapatıldığından emin olmak için çeyrek dönüşü açın ve filtre tutucuyu yeniden genişletin. Bir şırıng kullanarak, 10 mL MRD tamponunu aparattan geçirerek zarı yıkayın. Filtre tutucudan sıvı sızarak bu adımda yanlış montaj ortaya çıkar. Sızıntı meydana gelirse, başka bir steril filtre tertibatı edinin ve yıkama adımını tekrarlayın.
2. Örneği yıkanmış filtreye uygulayın. Pistonu bir şırınnadan çıkarın ve filtre cihazına takın. Şimdi 10 mL MRD tamponunda olan dağınık diş örneğini bir şırınna dökün ve filtreye yükleyin.
3. Filtratı yakalamak için filtre cihazının altına steril bir santrifüj tüpü yerleştirin, ardından numuneyi filtreden geçirmek için pistona hafif basınç uygulayın.
4. Membranı yıkamak için işlemi 10 mL daha MRD tamponu ile tekrarlayın ve akışı filtrelenmiş numuneyle aynı tüpte toplayın. Aseptik olarak tüpü kapla.

4. Saccharibacteria hücrelerini santrifüjleme ile konsantre edin

1. Tüp ve kapak üzerinde bir oryantasyon işareti yapın ve tüpü üst taraftaki işaretle birlikte yüksek hızlı bir santrifüje yerleştirin. Santrifüjlemeden oluşan pelet genellikle görünmezdir. İşaretleme, santrifüjleme yapıldığında ve tüp santrifüjden çıkarıldığında Saccharibacteria hücrelerinin peletinin nerede bulunduğunu belirlemeye yardımcı olacaktır.
2. Numuneleri 60.000 x g'da 4 °C'de 1 saat boyunca santrifüj edin.
   NOT: Bu kuvvet ve zaman tüm Saccharibacteria hücrelerini peletmek için yeterlidir. Bununla birlikte, Saccharibacteria hücreleri en azından 20.000 x g'da20 dakika kadar kısa bir süre santrifüjleme ile kısmen peletlenebilir.
3. Tüpleri santrifüjden dikkatlice çıkarın. Peletin tüpün üst tarafında tutularak sıvıyı tüpten dökün.
4. Genellikle görünmez peletin 1-2 mL MRD tamponunda güçlü girdap ile yeniden depolansın.

5. Ev sahibi kültürlere Saccharibacteria ile zenginleştirilmiş filtrat bulaştırın

1. 2 mL uygun büyüme ortamını (örneğin, TSBY, BHI, vb.) tüplere ayırarak kültür tüpleri hazırlayın.
2. Her tüpe 200 μL konak organizma kültürü ekleyin. Her tüpe 100-200 μL resüspended, filtrelenmiş numune ekleyin.
3. Kombine numuneleri konak organizma için uygun şekilde kuluçkaya yatırın (örneğin, 37 °C, A. propionicaiçin aerobik bir atmosferde).
4. Yeni bir tüpte 200 μL ikili kültürü 2 mL taze büyüme ortamına aktararak hücreleri iki ila üç günde bir aktarın. Geçişli kültürlerin büyüme göstermediği görülürse (yani, kültürün bulanıklığı / optik yoğunluğu taze ortama geçtikten sonra artmaz) Saccharibacteria tüm konak organizmayı ezici veya öldürebilir. Bunu düzeltmek için, hücreleri geçirirken 200 μL enfekte olmayan konak kültürü ekleyin. En az 5 pasaj için tekrarlayın.

6. PCR ile enfeksiyonu onaylayın

1. 5 pasajdan sonra PCR ile enfeksiyonu onaylayın. Beş pasaj, büyümeyen Saccharibacteria hücrelerinin 25 pcr döngüsü kullanılarak algılama sınırının ötesinde tükenmesini sağlayacaktır.
2. Bir PCR mastermix hazırlayın. Önerilen bir tarif aşağıdaki gibidir, ihtiyaç duyulan her tüp için 12,5 μL 2x PCR tamponu hazırlayın, 0,75 μL 10 μM İleri astar (580F¹² - AYT GGG CGT AAA GAG TTG C), 0,75 μL 10 10μM Ters astar (1177R¹³- GAC CTG ACA TCA TCC CCT TCC), 1 μL 25 mM MgCl₂ ve 9 μL su. Girdapla karıştırın.
3. Aliquot 24 μL mastermiks 0.2 mL PCR tüpüne. PCR reaksiyona 1 μL Saccharibacteria bulaşmış kültür ekleyin. Tüpü bir termosikleme içine yerleştirin ve aşağıdaki protokolü gerçekleştirin: İlk denatürasyon 95 °C 5 dakika, 25 döngü 95 °C 30 s, 60 °C 30 s, 72 °C 30 s, son uzama 72 °C 2 dakika, sonra 4 °C'de son tutma.
4. PCR ürünlerini % 1 agarose jelde yükleyin ve çalıştırın. ~600 bazlı bir grup Saccharibacteria'nın varlığını gösterecektir.

7. Saflık olup olmadığını kontrol edin ve kirletici organizmaları çıkarın

1. Saccharibacteria'nın kokültürünü konak organizmanın büyümesi için yeterli besin agarı üzerine kaplayarak pozitif kültürlerin saflığını onaylayın. Kültürün steril tamponda (örneğin MRD veya PBS) 10 kat seri seyreltilmesini gerçekleştirin ve bir agar plakasına 100 μL yayın. Agar plakasında yaklaşık 20-200 koloninin büyüyeceği şekilde seyreltmeler gerçekleştirin.
2. Kültürü uygun büyüme koşullarında kuluçkaya yatırın ve kirletici organizmalar için gözlemleyin.
   NOT: Axenik Sakkaribakteri kolonileri hiç gözlenmemiştir, bu nedenle bu plakalarda sadece konak organizmanın büyüdüğü gözlenir. Birden fazla koloni tipi genellikle kirlenmeyi gösterir. Kontaminasyon meydana gelirse, kültür istenmeyen kirleticileri gidermek için yeniden filtrelenmeli ve taze konakçıya yeniden aşılanmalıdır.
3. Bazen iki Saccharibacteria türünün aynı konağı enfekte ettiği çift enfeksiyon meydana gelir. Saccharibacteria türlerini ayırmak için, 20 μL steril PBS'de tek tek kolonileri yeniden kullanın ve Saccharibacteria enfeksiyonu olan kolonileri tespit etmek için PCR reaksiyonunda 1 μL süspansiyon kullanın.
4. İkili bir kültür başlatmak için büyüme ortamına olumlu sonuç veren askıya almaları aktarın. Başarı oranı, kültürdeki her Saccharibacteria türünün titrekliğine bağlı olacaktır. Yayılma için enfekte bir koloni bulmak için 50'den fazla koloniyi taramak gerekebilir.

8. Kültürlerin depolanmasını

1. Bir gecede yeterli hacimde (10-50 mL) ikili bir kültür büyütün.
2. Santrifüjleme ile pelet hücreleri (10 dakika boyunca 4.000 x g).
   NOT: Saccharibacteria hücreleri konağın daha büyük, daha ağır hücrelerine bağlanacağı ve onlarla peletileceği için burada yüksek hızlı santrifüjleme gerekli değildir.
3. Hücreleri kriyoprotektantta yeniden biriktirin. %5 DMSO veya %20 gliserol ile desteklenmiş büyüme ortamı genellikle yeterlidir. Konak organizmanın kriyoprotektör ortamla uyumlu olduğundan emin olun (örneğin, A. propionica büyümesi gliserol tarafından inhibe edilir ve dondurulmuş stoklar canlanmayabilir). Stokların donmada hayatta kalabilmesini sağlamak için enfekte olmayan bir konak kültürünün canlılığını kriyoprotektant ile test edin.
4. Hücre peletini aynı kültür hacminde (10-50 mL) yeniden dirildi. Etiketli cryovials içine Aliquot 0.5 mL. Hücre kültürlerini -80 °C'de dondurun.

Sonuçlar

Saccharibacteria'nın tespiti için PCR, saccharibacteria symbionts sayısının düşüklüğü nedeniyle ilk enfeksiyon kültürlerinde negatif görünebilir (yani, hiçbir ürün görülmez). Bununla birlikte, birkaç pasajdan sonra, kararlı bir enfeksiyonun meydana geldiğini gösteren güçlü bir PCR ürünü görünmelidir (Şekil 1A). Tersine, bazı enfeksiyonlar başlangıçta PCR tarafından pozitif görünecektir, ancak 1-4 pasajdan sonra tespit edilemeyene kadar azalacaktır (gösterilmez). Bu, ilk filtratta çok miktarda Saccharibacteria hücresinin bulunduğunu, ancak geçişle seyreltildiğini ve hiçbirinin konak kültürü ile istikrarlı bir simbiyoz içine giremediğini göstermektedir. Ağız boşluğundan aynı Saccharibacteria filtratı ile birkaç konak türünün test etmek, symbiont-konak etkileşimi çok spesifik olduğu için genellikle düşük bir başarı oranına (Şekil 1B) sahip olacaktır. Bir araştırmacı aynı konağı birkaç farklı konudan filtratlarla da test edebilir. İyi bir konak organizma (Araknia propionica veya Schaalia odontolyticagibi) kullanılırsa, % 50'lik bir başarı oranı beklenebilir.

PCR tarafından test etmek çok önemlidir. Deneyimli araştırmacılar, sadece yanlış pozitifleri bildirmek için mikroskopi ile enfeksiyonu doğrulamaya çalıştılar. Saccharibacteria hücreleri küçüktür ve veziklinler veya düzensiz hücre zarf çıkıntıları arasında ayırt etmek zordur. Birkaç geçitten stabil bir PCR sinyali, başarılı bir enfeksiyonu doğrulamak için anahtardır.

Enfekte kültürler büyüdükçe, normal bulanık büyüme ortaya çıkmalıdır. Simbiyoz kendini kurdukça, enfekte kültürler enfekte olmayan konak organizmaların kültürlerinden daha az bulanık görünecektir (Şekil 2A). Bazı durumlarda, enfekte kültürler tamamen büyümeyi durduruyor ve hiç bulanıklaşmamış gibi görünebilir. Bunun nedeni, Saccharibacteria hücrelerinin konak organizmayı bunalttığı bir enfeksiyon olabilir. Bu kültürlere "taze" (enfekte olmayan) konak eklemek, Saccharibacteria parazitlerinin sürekli büyümesini desteklemek için yeterli bir konak popülasyonu sağlamalıdır.

Aşırı büyüme veya aşırı bulanık kültürler, bir laboratuvar kirleticisi veya 0,2 μm filtreden geçebilen başka bir küçük oral bakteri tarafından kontaminasyona işaret edebilir. Campylobacter ve Capnocytophaga spp. bu deneylerin tipik oral kirleticileridir. Bu, kültürün kapılması ve konak organizmanın atipik kolonilerinin ve ardından 16S rRNA dizilimi ile doğrulanabilir. Kontaminasyon görülürse, bu kültürlerin 0,2 μm filtreden süzgeci genellikle kirleticileri gidermek için yeterlidir. Filtrattaki sakkaribacteria hücreleri santrifüjleme ile konsantre edilebilir ve saf bir konak kültürünü yeniden enfekte etmek için kullanılabilir.

Kontamine bir kültürü arındırmanın bir başka yolu da enfekte olmuş kolonileri enfekte bir kültürü kaplamaktan toplamaktır. Enfekte konakların kolonileri bazen enfekte olmayan kolonilere kıyasla düzensiz koloni şekli ile tanımlanabilir (Şekil 2B-D). Bu düzensiz koloniler ikili kültürde Saccharibacteria titreye bağlıdır ve titre düşükse kolonilerin daha küçük bir kısmı düzensiz görünecektir. Bu, saf bir ikili kültürü başlatmak için toplanabilen ve kullanılabilen enfekte kolonileri tanımlamayı kolaylaştırabilir. Sakkaripacteria enfekte kültüründen kaplamada düzensiz koloni görülmezse, symbiont'un düşük bir titrede olması veya düzensiz şekilli kolonilere neden olmaması mümkündür. Böyle bir durumda, normal bir görünüme sahip PCR tarama kolonileri Saccharibacteria tarafından enfeksiyon gösterebilir, ancak düşük bir oranda (tüm kolonilerin% 2-10'u).

Şekil 1: Konak kültürlerin Saccharibacteria enfeksiyonlarının tipik PCR sonuçları. (A) Saccharibacteria varlığını gösteren bir PCR ürünü ilk enfeksiyonla görünmeyebilir, ancak kokültür kendini kurdukça sonraki pasajlarda ortaya çıkabilir ve güçlenebilir. (B) Sakkarakteri ile zenginleştirilmiş filtrat ile enfekte olan çoğu konak, simbiyozun özgüllüğü nedeniyle büyümelerini desteklemez. Bu örnekte, yalnızca A. propionica başarıyla enfekte oldu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Saccharibacteria enfekte kültürlerinin büyüme özellikleri. (A) Enfekte kültürü gösteren enfekte ve enfekte olmayan A. propionica kültürlerinin büyüme eğrileri, enfekte olmayan kontrolle aynı yoğunluğa büyümeyecek ve daha az bulanık görünecektir. (B-D) Kokültürlerin kaplaması, Saccharibateria enfeksiyonlarının neden olduğu düzensiz koloniler üretebilir. Düzensiz koloniler, kokültürdeki Saccharibacteria titresine göre orantılı olarak azalacaktır. (B) Yüksek düzeyde Saccharibacteria ile ev sahibi. (C) 10 kat seyreltilmiş Saccharibacteria (D) Enfekte olmayan konak kültürü. Beyaz oklar düzensiz koloni örneklerini gösterir. Ölçek çubuğu= 1 cm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışmalar

Plak filtreleme ve konak organizmaların saf kültürlerine uygulama yöntemimiz büyük ölçüde ilk kültürlü Saccharibacteria, 'Nanosynbacter lyticus' suşu TM7x^{11 , 14,15}üzerindeki önceki gözlemlere dayanmaktadır. Küçük hücre büyüklüğü göz önüne alındığında, bir filtre kullanılarak diş plağından ayrılabileceklerini ve santrifüjleme ile konsantre olabileceklerini bulduk. İkincisi, bu organizmalar parazit olarak yaşadıklarından, bu hücrelere saf konak kültürleri sağlamak, bir simbiyoz içine girmelerine ve ikili kültürler olarak büyümelerine izin verecektir.

Bu yöntemin bir avantajı, zenginleştirme kültürü veya seçici baskı gerektirmemesidir. 'Nanosynbacter lyticus' suşu TM7x, streptomisin seçici bir ajan olarak kullanılarak zenginleştirme kültüründen kültürlenmiştir, bu da sıralamanın Saccharibacteria için zenginleştirmede etkili olacağını öne sürmüştür. Tesadüfen, 'Nanosynbacter lyticus' Schaalia odontolytica, streptomisin^16'yakarşı dirençli olduğu bilinmektedir. Antibiyotiklerin seçici bir ajan olarak kullanılması, konak organizmanın büyümesini de engelleyebilir ve bu da Saccharibacteria'nın büyümesini önler.

Zenginleştirme kültürlerini kullanmanın daha büyük bir sorunu, hızlı büyüyen organizmaların ilgi çekici organizmaları hızla yerinden edecek olmasıdır. Örneğin, ağız boşluğunda, Streptococcus türleri hızlı bir şekilde büyüyebilir ve büyüme ortamında şeker varsa, ortamı asitleştirmek için yeterli asit üretebilir ve ilgi çekici organizmalara karşı daha fazla seçim yapabilir. Zenginleştirme kültüründen ve seçici antibiyotiklerden kaçınarak, yöntemimiz, bu diğer yöntemlerin komplikasyonları olmadan daha geniş bir Saccharibacteria ve potansiyel konaklara uygulanabilecek genel bir yaklaşım sağlar.

Burada sunulan yöntemin önünde bazı engeller bulunmaktadır. İlk olarak, bu yöntem Saccharibacteria'nın ikili bir kültürde yaşadığını varsayar. Etkinliklerini ölçmek için trinary veya üçlü kültür kombinasyonlarını test etmedik, ancak tek bir konak organizmanın sağlayamadığı büyüme faktörleri gerektiren muhtemel Sakkarakteri vardır. Saccharibacteria'nın büyümesini destekleyebilecek geniş ağız bakteri kombinasyonlarını test etmek göz korkutucu bir iş olacaktır. İkinci olarak, yöntem tüm Saccharibacteria'nın 0,2 μm filtreden geçecek kadar küçük olduğunu varsayar. Diğer Saccharibacteria inanılandan daha büyük olabilir ve filtre bu organizmalara karşı seçiyor olabilir. Daha büyük gözenek boyutuna sahip bir filtre kullanılabilir, ancak bu, enfekte olmuş ortak kültüre daha fazla istenmeyen oral bakteriye izin verme riskiyle karşı karşıyadır. Son olarak, daha önce yayınlanmış olanların dışında konak türleri bulmak çok zordur. Şimdiye kadar, tek başarılı konakçı actinomyces, Schaalia, Arachnia ve Selülosimicrobiumcins türleridir, phylum Actinobacteria^15,17,18'intüm üyeleri. Ancak, bu konaklar sadece belirli Saccharibacteria'nın büyümesini destekler. Daha fazla Saccharibacteria türünü kültüre etmek için, daha birçok konak keşfedilmelidir.

Burada sunulan yöntemin Saccharibacteria ve diğer CPR organizmalarının gelecekteki araştırmalarına yardımcı olacağını umuyoruz. Metasagenomik dizileme, bu organizmaların da küçük genomlara sahip olduğunu ve symbiont olduğundan şüphelenildiğini veya metabolitler ve hayatta kalmaları için kritik olan diğer faktörleri sağlamak için yerel mikrobiyal topluluğa güvendiklerinden şüphelenilmelerini önermektedir¹⁹. Benzer bir filtreleme stratejisi, bu organizmaları yeterince küçük olmaları ve konak organizmalarının kültürlenebilmesi koşuluyla izole etmek için kullanılabilir. Burada açıklanan yöntemler, laboratuvar kültürünün güçlü araçlarını bu büyük ve çeşitli bakteri grubuna getirmenin ilk adımıdır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Fisher Scientific	BP160-100
Alphaimager	Cell Biosciences	FluorChem HD2	Or equivalent UV gel imaging system
Aluminum foil	Fisher Scientific	01-213-101
Brain Heart Infusion Broth (dehydrated powder)	Becton-Dickinson	211059	Or other growth media suitable for target organisms
Centrifuge Rotor 70-Ti	Beckman Coulter	337922
Cryovials	Fisher Scientific	12-567-500
DMSO	Fisher Scientific	BP231-100
Electrophoresis Power Supply	Bio-Rad	1645052
Electrophoresis Rig	Bio-Rad	1704467
Filter Forceps	Millipore Sigma	XX6200006P	Not essential, helps ensure filters are not punctured during handling
Glycerol	Fisher Scientific	G33-500
GoTaq Green Mastermix	Promega	M7122
Mastercycler Pro Thermocycler	Eppendorf	950040025	Or equivalent thermocycler for PCR
MgCl2 solution 25mM	Promega	A3513
Molecular Biology grade water	Fisher Scientific	BP2819100
O2 Control InVitro Glove Box	Coy Laoratories	031615	If needed for microaerobic organisms
Optima L-100 XP High Speed Centrifuge	Beckman Coulter	8043-30-1124
P-10 micro pipette	Gilson	F144802
P-1000 micro pipette	Gilson	F123601G
P-2 micro pipette	Gilson	F144801
P-20 micro pipette	Gilson	F123600
P-200 micro pipette	Gilson	F123602G
PBS	Fisher Scientific	BP399500
PCR tubes 0.2 mL	Fisher Scientific	14-230-205
Peptone	Fisher Scientific	BP1420-500
Pipette tips - 10 μL	Fisher Scientific	02-717-157
Pipette tips - 1000 μL	Fisher Scientific	02-717-166
Pipette tips - 20 μL	Fisher Scientific	02-717-161
Pipette tips - 200 μL	Fisher Scientific	02-717-165
Polycarbonate filters - 47mm, 0.2 μm pore size	Millipore	GTTP04700
Screw-cap conical centrifuge tubes 15 mL	Falcon	352096	Or other tube suitable for bacterial culture
Sodium chloride	Fisher Scientific	BP358-1
Swin-Lok Filter  - 47mm	Whatman	4200400
SYBR Safe DNA Gel stain	ThermoFisher Scientific	S33102
Syringes - 20 mL	Fisher Scientific	14-955-460
TAE Buffer (50x) concentrate	Fisher Scientific	P1332500
Thickwall Polycarbonate 25 x 89 mm (26.3mL capacity) centrifuge tubes with caps	Beckman Coulter	355618
Tryptic Soy Blood Agar Plates	Northeast Laboratory Services	P1100	Or other agar plate sufficient for growth of host organisms
Tryptic Soy Broth (dehydrated powder)	Becton-Dickinson	211825	Or other growth media suitable for target organisms
Vinyl Anaerobic Chamber	Coy Laboratories	032714	If needed for anaerobic organisms
Vortex mixer	Scientific Industries	SI-0236
Yeast Extract	Fisher Scientific	BP1422-500