Drosophila Oosyte'de Nükleer Göç

Özet

Drosophila'da, oosit çekirdeği oogenez sırasında mikrotübül bağımlı göçe uğrar. Burada, yumurta odaları ex-vivo üzerinde canlı görüntüleme yaparak göçü takip etmek için geliştirilen bir protokolü açıklıyoruz. Prosedürümüz, iplik disk konfokal mikroskopi kullanarak çok konumlu 3D hızlandırılmış filmler elde etmek için yumurta odalarını 12 saat boyunca canlı tutar.

Özet

Canlı hücre görüntüleme, özellikle organel hareketleri, sitoskeleton yeniden düzenlemelerini veya hücre içindeki polarite desenlerini düzenleyen hücresel ve moleküler mekanizmaları anlamak için gereklidir. Oosit çekirdek konumlandırmasını incelerken, bu sürecin dinamik olaylarını yakalamak için canlı görüntüleme teknikleri gereklidir. Drosophila yumurta odası, çok hücreli bir yapıdır ve çok sayıda genetik aletin büyüklüğü ve mevcudiyeti nedeniyle bu fenomeni incelemek için mükemmel bir model sistemidir. Drosophila orta-oogenez sırasında çekirdek, mikrotübül tarafından oluşturulan kuvvetlerin aracılık ettiği asimetrik bir pozisyonu benimsemek için oosit içindeki merkezi bir konumdan göç eder. Çekirdeğin bu göçü ve konumlandırılması, embriyonun ve sonraki yetişkin sineğinin polarite eksenlerini belirlemek için gereklidir. Bu geçişin bir özelliği, canlı görüntüleme için bir gereklilik yaratan üç boyutta (3D) gerçekleşmesidir. Böylece, nükleer göçü düzenleyen mekanizmaları incelemek için, parçalanmış yumurta odalarını kültüre etmek ve iplik disk konfokal mikroskopi kullanarak zaman atlamalı alımlarla 12 saat boyunca canlı görüntüleme yapmak için bir protokol geliştirdik. Genel olarak, koşullarımız Drosophila yumurta odalarını uzun süre canlı tutmamıza izin verir, böylece nükleer göçün tamamlanmasının 3D olarak çok sayıda örnekte görselleştirilmesini sağlar.

Giriş

Birkaç yıldır, Drosophila oosit nükleer göçü incelemek için bir model sistem olarak ortaya çıkmıştır. Drosophila oosit yumurta odası adı verilen çok hücreli bir yapıda gelişir. Yumurta odaları, foliküler somatik hücrelerin epitel tabakası ile çevrili 16 mikrop hücresini (15 hemşire hücresi ve oosit) kapsar. Yumurta odası gelişimi, oositin büyüyeceği ve embriyonun erken gelişimi için gerekli rezervleri biriktireceği 14 aşamaya (Şekil 1A) ayrılmıştır. Gelişim sırasında, maternal determinantların mikrotübül reorganasyonu ve asimetrik taşınması üzerine, oosit antero-dorsal ve dorso-ventral eksenler boyunca polarize eder. Bu eksenler embriyonun ve yetişkinin bu oositin döllenmesinden kaynaklanan sonraki polarite eksenlerini belirler¹. Oogenez sırasında çekirdek oositte asimetrik bir pozisyon benimsemiştir. Evre 6'da çekirdek hücrede ortalanır. Oosit tarafından alınan arka foliküler hücreler tarafından yayılan henüz tanımlanmış bir sinyal üzerine, çekirdek aşama 7'de ön ve lateral plazma membranları arasındaki kavşağa doğru göç eder (Şekil 1B)^2,3. Bu asimetrik pozisyon, dorso-ventral eksenin belirlenmesini sağlamak için gereklidir.

Şekil 1: Drosophila melanogaster yumurta odaları. (A) Plazma zarlarını etiketleyen nükleer zarfları ve ubi-PH-RFP'yi etiketleyen Fs(2)Ket-GFP'yi ifade eden transgenik sineklerden kaynaklanan yumurtalık düzeltildi. Yumurtalık, farklı aşamalarda gelişmekte olan yumurta odalarından oluşur. Olgunlaşma, mikrop kök hücresinin bulunduğu ön uçta (solda) germarium ve arka uçta (sağda) eski aşama ile antero-posterior eksen boyunca artar. (B) Çekirdeğin oositte ortaladığı oogenezin 6. Çekirdek, ön plazma zarı (oosit ve hemşire hücresi arasında) ve lateral plazma zarı (oosit ve foliküler hücreler arasında) ile temas halinde 7. Bu pozisyon, dorsal tarafın ve dolayısıyla yumurta odasının dorso-ventral ekseninin belirlenmesine neden olacaktır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Uzun yıllar boyunca, bu nükleer göç immünostaining ile sabit dokular üzerinde çalışılmıştır. Bu yaklaşım özellikle bu sürecin yoğun bir mikrotübül ağına bağlı olduğunu göstermeyi mümkün kıldı^4,5. Daha yakın zamanda, bu sürecin dinamik olarak incelenmesini mümkün hale getiren birkaç saat boyunca oosit canlı görüntüleme ile uyumlu koşullar sunan bir protokol geliştirdik⁶.

Bu nedenle, ilk kez, çekirdeğin göçü sırasında, biri ön plazma membranı (APM) ve diğeri oosit lateral plazma membranı (LPM) boyunca tercihli ve karakteristik yörüngelere sahip olduğunu tanımlayabildik (Şekil 2). Bu son sonuçlar, nükleer göç gibi dinamik süreçleri incelerken canlı görüntüleme protokollerinin öneminin altını çiziyor.

Şekil 2: Çekirdeğin farklı geçiş yollarının şematik gösterimi. Oogenezin 6. Bu aşamada, antero-arka polarite ekseni foliküler hücrelerle temas eden oositin arka/lateral plazma zarı ile ayarlanır ve ön plazma zarı (sarı) hemşire hücreleri ile temas halindedir². Çekirdeğin ön plazma zarı (APM), lateral plazma zarı (LPM) boyunca veya sitoplazma (STAD, doğrudan antero-dorsal korteks)⁶boyunca göç edebileceğini daha önce bildirmiştik. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Oosit çekirdek göçü yaklaşık 3 h⁶fenomenidir ve şimdiye kadar gerçek geçişin başlangıcını tetikleyen olay bilinmemektedir. Göçün başlangıcı, bu mekanizmayı incelemek için kullanılan protein mutantları tarafından da geciktirilebilir. Bu bilinmeyen değişkenler bizi uzun zaman dilimlerinde (10-12 saat) görüntü almaya motive etti. Bu nedenle, oositlerin hayatta kalmasını sağlamak önemlidir. Yumurta odası geliştikçe, antero-posterior eksen boyunca küresel bir şekilde eliptik bir şekle geçer. Bu uzama,^1. Ek olarak, pulsatile özelliğine sahip tübüler bir kas kılıfası yumurta odalarını çevreler. Fizyolojik işlevi, gelişmekte olan folikülleri sürekli olarak yumurta kanalına doğru itmektir⁸. Yumurta odalarının diseksiyondan sonra salınımlarını teşvik eden hareketleri sınırlamak için, yüksekliği 150 μm olan bir gözlem mikro odası tasarladık (Şekil 3A). Bu yükseklik, 10 ve 11. Yumurta odasının dönüşünü korurken numunenin dikey hareketlerini önemli ölçüde sınırlar, böylece folikül gelişiminde sınırlı kusurlara neden olur. Daha sonra eğirme diski konfokal mikroskobu kullanarak çok konumlu zaman atlamalı alımlarla parçalanmış yumurta odalarında 12 saat boyunca canlı görüntüleme gerçekleştiriyoruz. Burada 6 ve 7.

Şekil 3: Gözlem odasının şematik gösterimi. (A) (Üst görünüm) Alüminyum kaydırağın hassas boyutları, slaydın ortasında açılan kuyunun yükseklikleri (A') ve çevresi (A'') ile. (B) (Alt görünüm) Kuyuyu tıkayan bir kapak kapağı silikon gresle kaydırağa kapatılır. (C) (Üst görüş) Diseksiyonlu ovarioles, gaz geçirgen bir membranla kaplı bir görüntüleme ortamında gelişir. Halokarbon yağı zarı stabilize etmek için kullanılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Nükleer göçü takip etmek ve oositteki yörüngeleri hassas bir şekilde değerlendirmek için hem nükleer zarf hem de plazma zarı için işaretleyicilere ihtiyaç vardır. Bu amaçla, sinyal/gürültü oranı yüksek olan ve canlı görüntüleme boyunca solmayan iki transgene seçilmiştir. Plazma membranını etiketlemek için, RFP ile kaynaşmış İnsan Fosfolipaz C ∂1'in (PLC∂1) Pleckstrin Homology (PH) etki alanını kodlayan bir P[ubi-PH-RFP] kullanılması önerilir. Bu PH etki alanı, oosit^9'unplazma zarı boyunca dağıtılan fosfoinositid PI(4,5)P2'ye bağlanır. Nükleer zarf için, P[PPT-un1]Fs(2)GFP'nin Drosophila ß-importin'i kodlayan gen içine yerleştirildiği Ket-GFP protein kapanı suşu homojen ve yoğun bir sinyal^{görüntüler 10}. Genç sinekler (1-2 günlük) yumurtalık diseksiyonu öncesinde 24-48 saat kuru maya içeren taze şişelere yerleştirilir.

Bu canlı görüntüleme tahlil için, numune için tepkisel olmayan 1 mm kalınlığında bir alüminyum parçası, bir mikroskopi kaydırağı boyutlarına kesilmiştir. Slaytın ortasında 0,85 mm'ye karşı kontrabordlanmış 16 mm çapında bir deliğe sahiptir. Bu karşıbore, 150 μm derinliğe sahip ek bir 6 mm çapında deliğe sahiptir (Şekil 3A). Alüminyum haznenin alt kısmına silikon gres (numune için atıl) ile bir kapak saplanır(Şekil 3B). Numuneleri orta dolgulu kuyuya yerleştirdikten sonra, O₂/CO₂ değişimine geçirgen bir membran ortamın üzerine yerleştirilir ve halokarbon yağı ile çevrilidir (Şekil 3C).

Diseksiyon için, 0,05 x 0,02 mm uç boyutuna sahip paslanmaz çelik forseps ve yumurtalıkların ayrılması için 0,20 mm çapında iğneler kullanılması önerilir (Şekil 4B,C). Göç eden çekirdek, bir kamera ile donatılmış dönen disk konfokal ters mikroskop CSU-X1 üzerinde görüntülenir. Çok konumlu görüntüler, 24 °C'de her 15 dakikada bir zaman atlamalı olarak elde edildi. 15 dakikalık bir aralık, floresan proteinlerin sınırlı fotobleachingi ve numuneler için fototoksiklik ile çok pozisyonlu alımların gerçekleştirilmesini sağlar. Ayrıca, daha kısa bir aralık nükleer yörüngeleri takip etmek için çok daha bilgilendirici veriler sağlamaz. Filmler Fiji yazılımı¹¹ aracılığıyla işlenir ve analiz edilir.

Protokol

1. Görüntüleme ortamı hazırlığı

1. Kullanım gününde taze medya hazırlayın. Pipet 200 μL Schneider ortamı (L-Glutamin ve 0.40 g/L NaHCO₃ içeren% 10 ısı inaktive fetal baldır serumu, 100 U / mL penisilin ve 100 mg / mL streptomisin ile tamamlanır).
2. 30 μL insülin ile takviye 10 mg / mL.
3. 4 μL ısı inaktive fetal baldır serumu ekleyin.

2. Gözlem odası hazırlığı

1. Pipet ucu ile delinmiş slaydın alt tarafındaki deliğin etrafına az miktarda silikon gres uygulayın(Şekil 4D).
2. 0,13-0,16 mm kalınlığında 24 x 50 mm kapak kılıfı yerleştirin.
3. Bir pipet ucunun geniş ucuyla, kapak ucunu kapatmak ve slayda silikon halka iç oluşturmak için silikonu düzleştirmek için kapak ucuna basınç uygulayın (Şekil 4F,G).

3. Yumurtalık diseksiyonu

1. Bir CO₂ pedinde istenen fenotipin dişi bir sineğini uyuşturun.
2. Dişi görüntüleme ortamının 150 μL'sinde bir diseksiyon kuyusuna aktarın (Şekil 4H).
3. Toraksını topsla kaparak ve dorsal karın manikülünü ikinci bir çift tostikülle sıkıştırarak bir dişi açın.
4. Manikür açıklığı sırasında kolayca görülebilecek yumurtalık çiftini izole edin ve ayırın.
5. Uterus, oviduct ve kas kılımını dikkatlice çıkarın (Şekil 4I).
6. Görüntüleme ortamının 10-15 μL'lik bir damlasını yerleştirin ve görüntüleme odasına bir yumurtalık aktarın (Şekil 4J,K).

4. Yumurta odası izolasyonu

1. Yumurtalıkları ayırmak için, yumurtalığın arka ucunun (eski aşamalara doğru) iğneyle tutun. Başka bir iğne ile germarium dikkatlice çekerek yumurtalıkları ayırın.
2. Yumurta odalarında kalan kas kılımını çıkarın; bir iğne kılıdayı tutar ve diğeri daha büyük odalardan (aşama 9 veya daha büyük) yumurtalık çeker.
3. Duyulmamış yumurta boylarının batmasına ve kapakla temas etmesine izin verin.
4. Geç aşamaları ve yumurtalıkların geri kalanını, kümesler yardımıyla mikro odadan çıkarın. Kazanımı kolaylaştırmak için yumurtalıkları diğerlerinden iğnelerle dikkatlice uzaklaştırın (Şekil 4L).

5. Gözlem odası kapanışı

1. Küçük bir kare (10 x 10 mm) geçirgen membran kesin (Şekil 4M,N).
2. Herhangi bir hava kabarcığı çıkarmak için membranı görüntüleme ortamının üzerine dikkatlice uygulayın (Şekil 4O).
3. Membran konturu üzerindeki kuyunun etrafında ince bir halokarbon yağı tabakası ile odayı hermetik olarak kapatın(Şekil 4P,Q).

6. Görüntüleme

1. Görüntüleme kurulumunu 40x amaç kullanarak ters mikroskobun slayt tutucusuna yerleştirin (HCX PL Apo, 1.25NA, yağ daldırma).
2. Çekirdeğin göç etmeye hazır olduğu farklı aşama 6 oositlerin konumlarını bulun ve kaydedin.
3. 488 ve 561 nm lazerleri kurun. 150 mW'lık ölçülen çıkış lazer gücü ile lazer gücünün %30'unu ve sırasıyla 300 ms ve 500 ms pozlama kullanın.
4. Deneyi ayarla. Çekirdek üzerinde 1 μm ortalanmış 15 dk-41 bölüm aralığı ile 12 saat zaman atlamalı bir zaman aralığı alın.
   NOT: Yukarıda açıklanan pozlama süresine göre, bu ayar yaklaşık 45 s'de bir pozisyon alınmasına izin verir. Pozisyon değiştirme nedeniyle bir gecikme olduğundan, bu koşullarda en fazla 12 pozisyon ayarlanız önerilir.

7. Görüntü analizi

1. Yazılım Fiji'deki filmleri, eklenti Ortogonal görünümünü kullanarak işleyin ve çekirdeği manuel olarak izleyin.

Şekil 4: Adım adım mikro hazne montaj resimleri. (A,B,C) Gerekli aletlerin hazırlanması: iyi plaka, forseps, iğneler, görüntüleme ortamı, silikon gres, geçirgen membran ve alüminyum slayt. (D) Alüminyum kaydırağın arkasında silikon gresin pipet ucu ile uygulanması. (E) Odanın tabanını oluşturmak için silikon gres üzerine bir cam kapaklı yapıştırılır. (F,G) Odanın içinde bir eklem oluşturmak için pipet ucunun daha geniş ekstremitesi ile kapak ucuna basınç uygulaması. (H,I) Görüntüleme ortamındaki sinek yumurtalıklarının diseksiyonu. (J) Mikro bölmede bir damla görüntüleme medyasının pipetletlentir. (K,L) İğneler kullanılarak mikro bölmedeki yumurtalıkların ayrılması. (M,N,O) Geçirgen membran 10 x 10 mm kareye kesilir ve mikro haznedeki ortamın damlasının üzerine yerleştirilir. (P,Q) Mikro haznenin halokarbon yağı ile sızdırmazlık. Örnekler görüntülenmeye hazır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Sonuçlar

Göç öncesi, çekirdek dinamiktir ve göç öncesi olarak tanımlanan bir dönemde merkezi bir konum etrafında salınır. Bu küçük hareketler, oosit ortasında dengeyi koruyan itme ve çekme kuvvetleri dengesini yansıtır. Çekirdeklerin yörüngelerini ölçerek, APM ve LPM yörüngelerinin benzer oranlara sahip olduğunu gösterdik. Yörüngenin doğasını çekirdek ve plazma zarı arasındaki ilk temasla tanımlıyoruz⁶. Böylece, çekirdek, iki plazma zarının kesişimindeki son konum...

Tartışmalar

Diğer protokoller, Drosophila yumurta odalarının canlı görüntüleme için ex vivo'nun nasıl hazırlanacağını ve kültüre edilmesini açıklar^12,13. Bu protokolün yeniliği, içi boş bir alüminyum kaydırak, bir kapak kılıfı ve bir O₂/CO₂ geçirgen membran kullanılarak inşa edilen bir görüntüleme odasının kullanılmasıdır. Bu kurulumun ana avantajı, numuneye baskı uygulamadan Z'deki hareketi sınırlamakt?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthetize CO2 pad	Dutscher	789060	Anesthetize flies
Coverslip (24x50 mm)	Knittel Glass	VD12450Y100A	Observation-chamber preparation
Forceps Dumont #5	Carl Roth	K342.1	Dissection
Stainless steel needles	Entosphinx	20	Dissection
Heat-inactivated fetal calf serum	SIGMA-ALDRICH	F7524	Imaging medium
Insulin solution bovine pancreas	SIGMA-ALDRICH	10516 - 5ml	Imaging medium
Penicilin/Streptomycin solution	SIGMA-ALDRICH	P0781	Imaging medium
Permeable membrane	Leica	11521746	Observation-chamber preparation
Schneider Medium	Pan Biotech	P04-91500	Imaging medium
Silicon grease	BECKMAN COULTER	335148	Observation-chamber preparation
Spinning disk confocal	Zeiss	CSU-X1	Nuclear migration observation
Voltalef oil 10S	VWR	24627 - 188	Observation-chamber preparation