RNA Girişiminin Çam Ağacı Nematodunda Uygulanması, Bursaphelenchus xylophilus

Özet

Burada, gen fonksiyonlarının incelenmesini kolaylaştırmak için Bursaphelenchus xylophilus'ta RNA girişiminin ayrıntılı bir ıslatma yöntemini tanıtıyoruz.

Özet

Çam ağacı nematodu Bursaphelenchus xylophilus, dünya çapında en yıkıcı istilacı türlerden biridir ve çam ağaçlarının solmasına ve nihayetinde ölümüne neden olur. Ekonomik ve çevresel önemlerinin tanınmasına rağmen, geleneksel ileri genetik ve transgenik yöntemler kullanarak bitki-parazitik nematodların (PPN'ler) ayrıntılı gen fonksiyonlarını incelemek şimdiye kadar imkansız olmuştur. Bununla birlikte, ters genetik bir teknoloji olarak, RNA girişimi (RNAi), B. xylophilus da dahil olmak üzere nematodların fonksiyonel genlerinin incelenmesini kolaylaştırır.

Bu makalede, diğer patojenik nematodların gelişiminde ve çoğaltılmasında önemli rol oynadığı bildirilen B. xylophilus'taki ppm-1 geninin RNAi için yeni bir protokol özetlenmektedir. RNAi için, T7 promotörü polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile hedef fragmanın 5'-terminaline bağlandı ve çift sarmallı RNA (dsRNA) in vitro transkripsiyon ile sentezlendi. Daha sonra, dsRNA dağıtımı, nematodların sentetik nörostimülanlarla karıştırılmış bir dsRNA çözeltisine batırılmasıyla gerçekleştirildi. B. xylophilus'un senkronize yavruları (yaklaşık 20.000 kişi) yıkandı ve 25 ° C'de karanlıkta 24 saat boyunca ıslatma tamponunda dsRNA'ya (0.8 μg / mL) batırıldı.

Aynı miktarda nematod, kontrol olarak dsRNA olmadan ıslatıcı bir tampona yerleştirildi. Bu arada, aynı miktarda nematod, kontrol olarak yeşil floresan protein (gfp) geni dsRNA ile ıslatma tamponuna yerleştirildi. Islattıktan sonra, hedef transkriptlerin ekspresyon seviyesi gerçek zamanlı kantitatif PCR kullanılarak belirlendi. RNAi'nin etkileri daha sonra fenotiplerin mikroskobik gözlemi ve yetişkinler arasındaki vücut büyüklüğünün karşılaştırılması kullanılarak doğrulandı. Mevcut protokol, genetik mühendisliği yoluyla kontrol stratejileri geliştirmeye yönelik B. xylophilus ve diğer parazitik nematodların genlerinin işlevlerini daha iyi anlamak için araştırmaların ilerlemesine yardımcı olabilir.

Giriş

Bitki-paraziter nematodlar (PPN'ler) gıda güvenliği ve orman ekosistemleri için devam eden bir tehdittir. Her yıl tahmini 100 milyar ABD doları ekonomik kayba neden olurlar¹, bunların en sorunlu olanları öncelikle kök-düğüm nematodları, kist nematodları ve çam ağacı nematodlarıdır. Çam ağacı nematodu Bursaphelenchus xylophilus, çam solgunluğu hastalığının nedensel patojeni olan göçmen, endoparaziter bir nematoddur². Dünya çapında çam ormanlarına büyük zarar vermiştir³. Van Megen ve ^ark.4'ün terminolojisini kullanarak, B. xylophilus Parasitaphelenchidae'nin bir üyesidir ve klad 10'a aittir, oysa diğer büyük bitki parazitlerinin çoğu klad 12'ye aittir.

Bağımsız ve yakın zamanda evrimleşmiş bir bitki paraziti olan B. xylophilus , karşılaştırmalı çalışmalar için çekici bir modeldir. Bugüne kadar, zorunlu, sedanter endoparazitler olan ve en yoğun çalışılan nematodlardan bazıları olan klad 12'ye ait kök-düğüm nematodları ve kist nematodları hakkında önemli araştırmalar yapılmıştır. Bununla birlikte, bu önemli alanda daha fazla araştırma yapmak büyük bir zorlukla birlikte gelir: parazitizm genlerinin işlevi bir araştırma darboğazıdır. Fonksiyonel çalışmalar genellikle ektopik ekspresyon ve nakavt / çıkış deneylerini içerir, ancak nematod için etkili genetik dönüşüm protokollerine dayanır. Sonuç olarak, PPN'lerdeki ters genetik neredeyse sadece RNAi tarafından gen susturulmasına dayanır.

Ökaryotik hücrelerde yaygın olarak bulunan bir mekanizma olan RNAi, çift sarmallı RNA (dsRNA)⁵ ekleyerek gen ekspresyonunu susturur. Bugüne kadar, dsRNA tarafından indüklenen posttranskripsiyonel gen susturma mekanizması, çalışılan tüm ökaryotlarda bulunmuştur ve fonksiyonel genomik araştırmaların ve diğer uygulamaların bir aracı olarak RNAi teknolojisi, birçok organizmada hızla gelişmiştir. 1998 yılında Caenorhabditis elegans'ta RNAi makinesinin keşfinden bu yana⁶, RNAi teknikleri nematodların gen fonksiyonunu tanımlamak için etkili yöntemler haline gelmiştir ve patojenik nematodları etkili bir şekilde kontrol etmenin yeni bir yolu olarak önerilmiştir⁷.

RNAi teknik olarak gençleri dsRNA'ya batırmak yeterli olabilir; Bununla birlikte, bu yaklaşımın etkinliği ve tekrarlanabilirliği, nematod türleri ve hedef gen⁸ ile büyük ölçüde değişmektedir. Kök-düğüm nematodunun RNAi yollarında yer alan 20 genin susturulması, Meloidogyne incognita, tetikleyici olarak uzun dsRNA'lar kullanılarak araştırıldı ve bazı genlerin ekspresyonunda bir artış ve hiçbir değişiklik olmaması da dahil olmak üzere çeşitli tepkilerle sonuçlandı⁹. Bu sonuçlar, hedef genlerin RNAi nakavtına farklı tepki verebileceğini ve RNAi yoluyla nematod kontrolü için hedef olarak uygunluklarının kapsamlı bir değerlendirmesini gerektirdiğini göstermektedir. Bununla birlikte, şu anda B. xylophilus'un gelişim ve üreme biyolojisi üzerine araştırma yetersizliği vardır.

Önceki çalışmanın devamı olarak^10,11,12,13, burada dsRNA sentezi^, sentetik nörostimülan ıslatma ve kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) tespiti dahil olmak üzere B. xylophilus'un ppm-1 geninin işlevini incelemek için RNAi'nin uygulanması için bir protokol açıklıyoruz. Bu deneysel yaklaşımdan elde edilen bilgiler muhtemelen temel biyolojik sistemlerin anlaşılmasına ve çam solgunluğu hastalığının önlenmesine önemli ölçüde katkıda bulunacaktır.

Protokol

Çalışma, Zhejiang Tarım ve Ormancılık Üniversitesi hayvan deneyleri konseyi tarafından onaylandı. B. xylophilus izolatı NXY61, başlangıçta Çin'in Zhejiang eyaletinin Ningbo bölgesindeki hastalıklı bir Pinus massoniana'dan çıkarıldı¹¹.

1. Gen klonlama

NOT: Bu protokolde kullanılan astarlarla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.

1. Nematodları toplayın.
   1. Kültür B. xylophilus , 3-5 gün boyunca 25 ° C'de Patates Dekstroz Agar (PDA) plakaları üzerindeki Botrytis cinerea'nın miselyası üzerinde gerilir.
   2. Bellman huni yöntemi^14'ü kullanarak nematodları toplayın.
      1. Bir huninin altına kelepçelenmiş bir lastik tüp yerleştirin ve huninin ağzına iki kat filtre kağıdı yerleştirin. Mantar kültürlerini huniye aktarın ve mantar paspasını batırmak için su ekleyin. 2 saat bekleyin, ardından nematodları toplayın.
2. Aşağıdaki adımlara göre, toplam RNA ekstraksiyon reaktifi kullanarak nematodlardan toplam RNA'yı çıkarın (Malzeme Tablosuna bakınız)¹¹ .
   1. 2 mL'lik bir santrifüj tüpüne 500 μL ekstraksiyon reaktifi ve 100 μL manyetik boncuk ekleyin. Nematodların 20 μL'sini aspire edin ve numuneyi 30 s için 9.000 × g'da öğütmek üzere bir öğütücüye aktarın. 5 dakika boyunca inkübe edin ve ardından 12.000 × g ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın.
   2. Süpernatantı yeni bir santrifüj tüpüne aktarın. 100 μL kloroform ekleyin, tüpü kapatın ve tüpü birkaç kez ters çevirerek karıştırın. 3 dakika boyunca inkübe edin ve ardından 4 ° C'de 12.000 × g'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın.
   3. Süpernatantı yeni bir santrifüj tüpüne aktarın. 250 μL izopropil alkol ve vorteksi kuvvetli bir şekilde ekleyin. 10 dakika boyunca 12.000 × g'da santrifüj.
   4. Süper natantı atın. RNA'yı yıkamak için 500 μL% 75 etanol ekleyin ve ardından numuneyi vorteksleyin. 12.000 × g ve 4 ° C'de 5 dakika santrifüj yapın.
   5. RNA peletini 5 dakika boyunca hava ile kurutun.
   6. Peleti 30 μL RNaz içermeyen suda yeniden askıya alın.
   7. Formülü kullanarak RNA konsantrasyonunu hesaplayın: A260 × seyreltme × 40 = μg RNA / mL. A260/A280 oranını hesaplayın.
      NOT: ~2 oranı saf olarak kabul edilir.
3. cDNA şablonunu elde etmek için kaliteli RNA'nın ters transkripsiyonunu gerçekleştirin.
   1. B. xylophilus'taki Bx-ppm-1 geninin kısmi kodlama dizisini yükseltmek için ppm-1-F / R (Malzeme Tablosuna bakınız) bir çift spesifik primer tasarlayın ve kullanın (GenBank katılım numarası QTZ96795).
   2. ppm-1 gen dizilerini, standart bir klonlama protokolü^11'i izleyerek T7 promotörünü içeren pGEM-Teasy vektörüne klonlayın.
      1. PCR reaksiyonlarını aşağıdaki gibi ayarlayın: 2 μL cDNA, 25 μL 2x Ex Taq Polimeraz Premiks, her astardan 2 μL (10 pmol / l) ve steril damıtılmış su 50 μL'lik son hacme kadar.
      2. Amplifikasyon prosedürünü aşağıdaki gibi uygulayın: 94 ° C'de 5 dakika; bunu 94 °C'de 30 sn, 55 °C'de 30 s ve 72 °C'de 1 dk'lık 35 döngü izledi; ve 5 dakika boyunca 72 °C'de son bir uzatma adımı.
      3. Güçlendirilmiş ürünleri sıralama için bir pGEM-T Kolay vektöre klonlayın.

2. dsRNA sentezi

1. Her iki uca T7 promotör bölgeleri eklemek için tasarlanmış primerlerle PCR kullanarak dsRNA sentezi için DNA şablonunu hazırlayın. T7 promotör dizisini astarların 5' ucuna ekleyin.
2. PCR şablonu olarak ppm-1 gen fragmanını (894 bp) içeren plazmidi kullanın ve T7 promotörü^11'i içeren parçayı kurtarın. Yukarıda açıklanan PCR prosedürünü ve sistemini kullanın.
3. DsRNA^11'i sentezlemek için bir in vitro transkripsiyon kiti kullanın.
   1. Dondurulmuş reaktifleri buz üzerinde çözün.
   2. Bir santrifüj tüpüne 2 μL 10x reaksiyon tamponu, 2 μL enzim karışımı ve 1 μg DNA ekleyin. Standart bir 4 μL reaksiyon üretmek için nükleaz içermeyen su ekleyin. Daha sonra, dört ribonükleotid çözeltisinin (ATP, CTP, GTP ve UTP) eşit hacimlerini karıştırın ve karışımın 8 μL'sini tüpe ekleyin. İyice karıştırın ve 4 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
   3. 1 μL DNaz ekleyin, iyice karıştırın ve 37 ° C'de 15 dakika boyunca inkübe edin.
   4. Reaksiyonu durdurun ve RNA'yı çökeltmek için 30 μL nükleaz içermeyen su ve 30 μL LiCl çökeltme çözeltisi ekleyin. İyice karıştırın. Gece boyunca -20 ° C'de inkübe edin.
   5. 12.000 × g ve 4 °C'de 15 dakika santrifüj. Süper natantı atın.
   6. RNA'yı yıkamak için 1 mL% 75 etanol ekleyin. Numuneyi vorteksleyin ve 12.000 × g ve 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın.
   7. RNA peletini 3 dakika boyunca hava ile kurutun.
   8. Peleti 30 μL RNaz içermeyen suda yeniden askıya alın.
   9. Bir spektrofotometre kullanarak dsRNA'nın kalitesini analiz edin. Ölçüm kaidesine dsRNA numunesinin 1 μL'lik pipeti ve dalga boyunu 340 nm olarak ayarlayın. Ürünleri %1.0'lık bir agaroz jeli üzerinde görselleştirin.

3. Sırılsıklam ederek RNAi

1. Toplam 20 μL hacim ve 0,8 μg / mL'lik bir son RNA konsantrasyonu üretmek için dsRNA ve ddH 2 O ile 4 μL 5x ıslatma tamponunu (% 0,05 jelatin, 5,5 mM KH ₂PO 4, 2,1 mM NaCl, 4,7 mM NH₄Cl, 3 mM spermidin) karıştırın.
2. J2 larvalarını edinin.
   1. Nematodları mantar kültürlerinden toplayın ve 6 cm çapında bir cam Petri kabına aktarın. Nematodların serbestçe yüzebilmelerini sağlamak için yemeğe 10 mL su ekleyin. Nematodları 30 dakika boyunca tabakta tutun ve yumurtaların dibe yapışmasını bekleyin.
   2. Yumurtaları rahatsız etmediğinizden emin olarak suyu ve nematodları dikkatlice çıkarın. Tüm larvalar ve yetişkinler çıkarılana kadar adımları tekrarlayın, sadece yumurtaları tabakta bırakın.
   3. J2 larvalarını elde etmek için toplanan yumurtaları karanlıkta 25 ° C'de 24 saat boyunca yumurtadan çıkarın. J2 larvalarını toplayın, bir tüpe yerleştirin ve RNAi deneyi¹⁵ için ddH₂O ile üç kez yıkayın.
   4. J2 larvalarını dsRNA çözeltisini içeren 2 mL tüpe aktarın ve% 1.0'lık bir nihai konsantrasyon üretmek için resorsinol çözeltisi (infoil içine sarılmış ve suda çözülmüş) ekleyin. Larvaların dsRNA'yı etkili bir şekilde emmesini sağlamak için larvaları 25 ° C'de 24 saat boyunca sallanan bir masada 15 × g'de santrifüjleme ile inkübe edin.
   5. Aynı miktarda nematodları, dsRNA probu olmadan veya kontrol olarak bir GFP dsRNA probu ile ıslatma tamponuna batırın. GFP genini (gfp, M62653.1) endojen olmayan bir kontrol olarak kullanın ve gen-spesifik primerler T7-GFP-F / R kullanarak gfp'nin dsRNA'sını sentezleyin.

4. qPCR algılama

1. J2 larvalarını, hedef gen girişimi, GFP gen girişimi ve bozulmamış kontrol grubu olanlar da dahil olmak üzere ddH₂O ile temizleyin. Yukarıda açıklanan yöntemi kullanarak her gruptan toplam RNA'ları çıkarın.
2. qPCR'yi başlatın.
   1. İstenilen yazılımı kullanarak q-ppm-1-F/R astarlarını tasarlayın (bkz.
   2. qPCR reaksiyonunu 1 μL cDNA, 6 μL floresan premiks, her astarın 0,4 μL'si (10 pmol/l) ve steril damıtılmış su içeren 12 μL'de ayarlayın.
   3. qPCR'yi aşağıdaki gibi gerçekleştirin: 95 °C'de 2 dakika; bunu 95 °C'de 10 sn, 55 °C'de 30 sn ve 72 °C'de 1 dk'lık 40 döngü izledi.
   4. RNAi^15'ten sonra gen ekspresyon seviyesindeki değişiklikleri değerlendirmek için actb genini (GenBank katılım numarası EU100952) ve tbb-2 genini (GenBank katılım numarası MT769316) veya diğer genleri dahili referans genleri olarak kullanın.
3. Döngü eşiği (Ct) değerine ve çözünme eğrisine göre, hedef genin göreceli ekspresyon seviyesini tahmin etmek ve girişim verimliliğini doğrulamak için ^2-ΔΔCt yöntemini kullanın.
   1. ΔCt değerini elde etmek için her numunenin iç referans geninin Ct değerini hedef genin Ct değerinden çıkarın. Ardından, ΔΔCt değerini elde etmek için girişim grubunun ΔCt değerini kontrol grubunun ΔCt değerinden çıkarın.
      NOT: 0'dan büyük bir ΔΔCt değeri, girişimin etkili olduğunu gösterir.

5. RNAi'yi takip eden nematod yetişkinlerinin vücut uzunluğunu değerlendirin

1. RNAi'den sonra, J2 larvalarını yetişkinliğe kadar PDA plakalarındaki B. cinerea çimlerinde 25 ° C^15'te 60 saat boyunca kültürleyin.
2. Bellman huni yöntemini kullanarak yetişkinleri toplayın (bkz. adım 1.1.2.1)¹⁴.
3. Yetişkin nematodların görüntülerini mikroskop altında elde edin ve vücut uzunluklarını ölçmek için ImageJ yazılımını (veya başka bir ölçüm yazılımını) kullanın.
   1. Analiz Et'i seçerek ImageJ'yi kullanarak uzunluğu ölçün | Ölçeği ayarlayın. Mesafe biliniyorsa, çizilen düz çizginin uzunluk değerini girin. Uzunluk birimini girin.
   2. Genel onay kutusunu işaretleyin (tüm resimler için bu standardı kullanın) ve ölçülecek görüntü üzerinde düz bir çizgiyle ölçülecek uzunluğu seçmek için Tamam'ı tıklatın.
   3. Sonuçları görüntülemek ve sonuçlar penceresine kaydetmek için Ctrl+M (ölçüm) komutunu kullanın.
4. İstatistiksel analiz için 50 erkek ve 50 dişi nematodun ölçümlerini alın¹².
5. Her numune için ortalama ve standart sapmayı hesaplayarak verileri analiz edin. Öğrencinin t-testini kullanarak farklı gruplardan örneklerin araçlarını karşılaştırın.

Sonuçlar

RNAi sonrası B. xylophilus'un ppm-1 ekspresyonunun analizi
GFP dsRNA ile ıslatılmış ve hedef gen dsRNA ile ıslatılmış olan B. xylophilus'un ppm-1 geninin göreceli ekspresyon seviyesi sırasıyla 0.92 ve 0.52 idi (ddH₂O ile tedavi edilen kontrol grubunun ppm-1 gen ekspresyon seviyesi 1 olarak ayarlandı) (Şekil 1). Bu nedenle, eksojen dsRN...

Tartışmalar

B. xylophilus'un yaşam öyküsü ve paraziter ortamı diğer nematodlarınkinden farklı olmasına rağmen, bu bitki patojeninin moleküler patogenezi hakkında sınırlı araştırma yapılmıştır. C. elegans ve diğer nematodlarda CRISPR / Cas9 genom düzenleme teknolojisinin uygulanmasında büyük ilerleme kaydedilmesine rağmen, bugüne kadar sadece B. xylophilus'a uygulanan RNAi teknolojisi^{yayınlanmıştır 17}. RNAi, nematodların gen fonksiyonunu incelemek i?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Baermann funnel	n/a	n/a	to isolate nematodes
Beacon Designer 7.9	Shanghai kangyusheng information technology co.	n/a	to design qPCR primers
Botrytis cinerea	n/a	n/a	as food for nematodes
Bursaphelenchus xylophilus	n/a	n/a	its number was NXY61 and was it was originally extracted from diseased Pinus massoniana in Ningbo, Zhejiang province, China.
constant temperature incubator	Shanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co.	H1703544	to cultur nematodes
Electrophoresis apparatus	Bio-Rad Laboratories	1704466	to achieve electrophoretic analysis
Ethanol, 75%	Sinopharm Chemical Reagent Co.	80176961	to extract RNA
Ex Taq Polymerase Premix	Takara Bio Inc.	RR030A	for PCR
Ex Taq Polymerase Premix	Takara Bio Inc.	RR390A	for PCR
Gel imager	LongGene Scientific Instruments Co.	LG2020	to make nucleic acid bands visible
GraphPad Prism 8	GraphPad Prism	n/a	to analyze the data and make figurs
High Speed Centrifuge	Hangzhou Allsheng Instruments Co.	AS0813000	centrifug
High-flux tissue grinder	Bertin		to extract RNA
ImageJ software	National Institutes of Health	n/a	to measure the body lengths
isopropyl alcohol	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.	L1909022	to extract RNA
Leica DM4B microscope	Leica Microsystems Inc.		to observe nematodes
magnetic beads	Aoran science technology co.	150010C	to extract RNA
MEGAscript T7 High Yield Transcription Kit	Thermo Fisher Scientific Inc.	AM1333	to synthesize dsRNA in vitro
NanoDrop ND-2000 spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific Inc.	NanoDrop 2000/2000C	to analyze the quality of the dsRNA
PCR Amplifier	Bio-Rad Life Medical Products Co.	1851148	to amplify nucleic acid sequence
Petri dishes	n/a	n/a	to cultur nematodes
pGEM-T Easy vector	Promega Corporation	A1360	for cloning
Potato Dextrose Agar (Medium)	n/a	n/a	to cultur Botrytis cinerea
Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser	Takara Bio Inc.	RR047B	to synthetic cDNA
Primer Premier 5.0	PREMIER Biosoft	n/a	to design PCR primers
primers:ppm-1-F/R	Tsingke Biotechnology Co.	n/a	F: 5'-GATGCGAAGTTGCCAATCATTCT -3'; R: 5'- CCAGATCCAGTCCACCATACACC -3
q-ppm-1-F/R	Tsingke Biotechnology Co.	n/a	F: 5'-CATCCGAATGGCAATACAG-3'; R: 5'-ACTATCCTCAGCGTTAGC-3'
Real-time thermal cycler qTOWER 2.2	Analytique Jena Instruments (Beijing) Co.		for qPCR
shaking table	Shanghai Zhicheng analytical instrument manufacturing co.		to soak nematodes
stereoscopic microscope	Chongqing Optec Instrument Co.	1814120	to observe nematodes
T7-GFP-F/R	Tsingke Biotechnology Co.	n/a	F: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAAA GGAGAAGAACTTTTCAC-3'; R: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGCTG TTACAAACTCAAGAAGG-3'
T7 promoter	Tsingke Biotechnology Co.	n/a	TAATACGACTCACTATAGGG
Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit	Takara Bio Inc.	9762	to recover DNA
TaKaRa TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)	Takara Bio Inc.	RR820A	for qPCR
trichloroethane	Shanghai LingFeng Chemical Reagent Co.		to extract RNA
TRIzol Reagent	Thermo Fisher Scientific Inc.	15596026	total RNA extraction reagent,to extract RNA