RNA干扰在松林线虫、木犀牛线虫中的应用

摘要

在这里，我们介绍了一种详细的RNA干扰在 嗜木杆菌 中浸染的方法，以促进基因功能的研究。

摘要

松林线虫， 伯萨菲伦丘斯嗜木杆菌，是全球最具破坏性的入侵物种之一，导致松树枯萎并最终死亡。尽管人们认识到它们的经济和环境意义，但迄今为止还不可能使用传统的正向遗传学和转基因方法研究植物寄生线虫（PPN）的详细基因功能。然而，作为一种反向遗传学技术，RNA干扰（RNAi）有助于研究线虫的功能基因，包括 嗜木杆菌。

本文概述了一种针对嗜木杆菌ppm-1基因的RNAi的新方案，据报道，该方案在其他致病性线虫的发育和繁殖中起着至关重要的作用。对于RNAi，T7启动子通过聚合酶链反应（PCR）与靶片段的5′末端连接，并通过体外转录合成双链RNA（dsRNA）。随后，通过将线虫浸泡在与合成神经刺激剂混合的dsRNA溶液中来完成dsRNA递送。将嗜木杆菌的同步幼体（约20，000个个体）洗涤并在浸泡缓冲液中的dsRNA（0.8μg/ mL）中浸泡24小时，在25°C的黑暗中。

将相同数量的线虫置于没有dsRNA的浸泡缓冲液中作为对照。同时，将另一个相同数量的线虫置于以绿色荧光蛋白（gfp）基因dsRNA作为对照的浸泡缓冲液中。浸泡后，使用实时定量PCR测定靶标转录本的表达水平。然后通过对表型的微观观察和比较各组之间成人的体型来确认RNAi的效果。目前的方案可以帮助推进研究，以更好地了解 嗜木杆菌 和其他寄生线虫基因的功能，从而通过基因工程制定控制策略。

引言

植物寄生线虫（PPNs）对粮食安全和森林生态系统构成持续威胁。据估计，它们每年造成1000亿美元的经济损失¹，其中最成问题的主要是根结线虫、囊肿线虫和松木线虫。松木线虫， 伯萨菲伦丘斯嗜木虫，是一种迁徙的内寄生虫线虫，是松枯萎病²的致病病原体。它对全世界的松树林造成了极大的伤害³.使用Van Megen等人^的术语4， 嗜木杆菌 是副杆菌科的成员，属于进化枝10，而大多数其他主要植物寄生虫属于进化枝12。

作为一种独立且最近进化的植物寄生虫， 嗜木杆菌 是比较研究的有吸引力的模型。迄今为止，已经对属于分支12的根结线虫和囊肿线虫进行了大量研究，它们是专性，久坐不动的内寄生虫，是一些研究最深入的线虫。然而，在这一重要领域进行进一步研究带来了一个重大挑战:寄生基因的功能是研究的瓶颈。功能研究通常包括异位表达和敲除/切除实验，但依赖于线虫的有效遗传转化方案。因此，PPN中的反向遗传学几乎完全依赖于RNAi的基因沉默。

RNAi是一种广泛存在于真核细胞中的机制，通过引入双链RNA（dsRNA）⁵来沉默基因表达。迄今为止，dsRNA诱导的转录后基因沉默机制已在所有研究的真核生物中被发现，RNAi技术作为功能基因组学研究和其他应用的工具，在许多生物体中得到了迅速发展。自1998年在 秀丽隐杆线虫 中发现RNAi机制⁶以来，RNAi技术已成为鉴定线虫基因功能的有效方法，并被提出作为有效控制致病性线虫的新方法⁷。

从技术上讲，RNAi很容易将幼体浸泡在dsRNA中就足够了;然而，这种方法的有效性和可重复性随线虫物种和靶基因⁸而有很大差异。使用长dsRNA作为触发因素，研究了根结线虫 Meloidoyne隐性RNAi途径中涉及的20个基因的沉默，导致不同的反应，包括一些基因表达的增加和无变化⁹。这些结果表明，靶基因可能对RNAi敲低的反应不同，因此有必要对它们作为通过RNAi控制线虫的靶标的适用性进行详尽的评估。然而，目前缺乏对 嗜木杆菌的发育和生殖生物学的研究。

作为先前工作^{10，11，12，13}的延续，我们在这里描述了应用RNAi研究嗜木杆菌ppm-1基因功能的方案，包括dsRNA的合成，合成神经兴奋剂浸泡和定量聚合酶链反应（qPCR）检测。从这种实验方法中获得的知识可能会显着有助于了解基本的生物系统和预防松树枯萎病。

研究方案

该研究获得浙江农林大学动物实验委员会批准。 嗜木杆菌 分离株NXY61最初是从中国浙江省宁波地区的一种患病 的马尾松 中提取的¹¹。

1. 基因克隆

注意:有关本实验方案中使用的引物的详细信息，请参阅 材料表 。

1. 收集线虫。
   1. 在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）平板上的灰霉病菌丝体上培养木霉菌菌株，在25°C下培养3-5天。
   2. 使用贝尔曼漏斗方法¹⁴收集线虫。
      1. 将夹紧的橡胶管放在漏斗下方，并将两层滤纸放在漏斗的口中。将真菌培养物转移到漏斗中，并加水以浸入真菌垫中。等待2小时，然后收集线虫。
2. 根据以下步骤，使用总RNA提取试剂从线虫中提取总RNA（参见 材料表）¹¹ 。
   1. 将500μL提取试剂和100μL磁珠加入2 mL离心管中。吸出20μL线虫并将样品转移到研磨机中，以9，000× g 研磨30秒。孵育5分钟，然后在12，000× g 和4°C下离心10分钟。
   2. 将上清液转移到新的离心管中。加入100μL氯仿，盖上管盖，并通过倒置管几次来混合。孵育3分钟，然后在4°C下以12，000× g 离心10分钟。
   3. 将上清液转移到新的离心管中。加入250μL异丙醇并剧烈涡旋。以12，000× g 离心10分钟。
   4. 弃去上清液。加入500μL75%乙醇洗涤RNA，然后涡旋样品。在12，000× g 和4°C下离心5分钟。
   5. 将RNA沉淀风干5分钟。
   6. 将沉淀重悬于30μL无RN酶的水中。
   7. 使用以下公式计算RNA浓度:A260×稀释×40 = μg RNA / mL。计算 A260/A280 比率。
      注意:~2的比率被认为是纯的。
3. 对优质RNA进行逆转录以获得cDNA模板。
   1. 设计并使用一对特定的引物ppm-1-F/R（参见材料表），以扩增嗜木杆菌（GenBank种质编号QTZ96795）中Bx-ppm-1基因的部分编码序列。
   2. 按照标准^克隆方案11将ppm-1基因序列克隆到含有T7启动子的pGEM-Teasy载体中。
      1. 按如下方式设置PCR反应:2μLcDNA，25μL2x Ex Taq聚合酶预混料，2μL每个引物（10 pmol / l）和无菌蒸馏水至最终体积为50μL。
      2. 按如下方式进行扩增程序:在94°C下5分钟;随后在94°C下进行35次循环，在30 s，在55°C下为30s，在72°C下为1分钟;并在72°C下进行最后一次扩展步骤5分钟。
      3. 将扩增产物克隆到pGEM-T简易载体中进行测序。

2. 双链氨基酸的合成

1. 使用PCR制备用于dsRNA合成的DNA模板，引物旨在两端添加T7启动子位点。将T7启动子序列添加到引物的5'末端。
2. 使用含有 ppm-1 基因片段（894 bp）的质粒作为PCR的模板，并回收含有T7启动子¹¹的片段。使用上述PCR程序和系统。
3. 使用 体外 转录试剂盒合成dsRNA¹¹。
   1. 将冷冻试剂解冻在冰上。
   2. 向离心管中加入2μL10x反应缓冲液，2μL酶混合物和1μgDNA。加入不含核酸酶的水以产生标准的4μL反应。然后，将等体积的四种核糖核苷酸溶液（ATP，CTP，GTP和UTP）混合在一起，并向管中加入8μL混合物。充分混合并在37°C下孵育4小时。
   3. 加入1μLDNase，充分混合，并在37°C下孵育15分钟。
   4. 停止反应并加入30μL无核酸酶水和30μLLiCl沉淀溶液以沉淀RNA。彻底混合。在-20°C孵育过夜。
   5. 在12，000× g 和4°C下离心15分钟。 弃去上清液。
   6. 加入1毫升75%乙醇洗涤RNA。涡旋样品并在12，000× g 和4°C下离心10分钟。
   7. 风干RNA沉淀3分钟。
   8. 将沉淀重悬于30μL无RN酶的水中。
   9. 使用分光光度计分析dsRNA的质量。将1μLdsRNA样品移液到测量基座上，并将波长设置为340nm。在1.0%琼脂糖凝胶上可视化产品。

3. 浸泡

1. 将4μL5x浸泡缓冲液（0.05%明胶，5.5mM KH₂PO₄，2.1mM NaCl，4.7mM NH₄Cl，3mM亚精胺）与dsRNA和ddH₂O混合，产生总体积为20μL，最终RNA浓度为0.8μg/ mL。
2. 获取J2幼虫。
   1. 从真菌培养物中收集线虫并将其转移到直径为6厘米的玻璃培养皿中。在培养皿中加入10毫升水，以确保线虫可以自由游泳。将线虫放在盘子里30分钟，等待鸡蛋粘附在底部。
   2. 小心地清除水和线虫，确保不要打扰鸡蛋。重复这些步骤，直到所有的幼虫和成虫都被移除，只留下盘子里的鸡蛋。
   3. 在25°C的黑暗中孵化收集的卵24小时，以获得J2幼虫。收集J2幼虫，将它们放入管中，并用ddH₂O洗涤它们三次，用于RNAi实验¹⁵。
   4. 将J2幼虫转移到含有dsRNA溶液的2mL管中，并加入间苯二酚溶液（包裹在锡箔中并溶解在水中）以产生1.0%的最终浓度。在25°C的摇床上以15×g 离心孵育幼虫24小时，以确保幼虫有效吸收dsRNA。
   5. 在没有dsRNA探针或GFP dsRNA探针作为对照的情况下，将相同数量的线虫浸泡在浸泡缓冲液中。使用GFP基因（gfp， M62653.1）作为非内源性对照，并使用基因特异性引物T7-GFP-F / R合成 gfp 的dsRNA。

4. 二聚氯乙烯检测

1. 用ddH 2 O清洁_J2幼虫，包括具有靶基因干扰，GFP基因干扰和未受干扰的对照组的幼虫。使用上述方法从每组中提取总RNA。
2. 启动二聚氯乙烯。
   1. 使用所需的软件设计 q-ppm-1-F/R 引物（参见 材料表）。
   2. 在含有1 μL cDNA，6 μL荧光预混料，0.4 μL每个引物（10 pmol / l）和无菌蒸馏水的12 μL中设置qPCR反应。
   3. 按如下方式进行qPCR:在95°C下2分钟;随后在95°C下循环40次，每次10秒，在55°C下30秒，在72°C下1分钟。
   4. 使用 actb 基因（基因库加入号EU100952）和 tbb-2 基因（基因库加入号MT769316）或其他基因作为内部参考基因，评估RNAi¹⁵后基因表达水平的变化。
3. 根据周期阈值（Ct）值和溶解曲线，采用^2-ΔΔCt 方法估算靶基因的相对表达水平，验证干扰效率。
   1. 从靶基因的Ct值中减去每个样品的内部参考基因的Ct值，得到ΔCt值。然后，从对照组的ΔCt值中减去干扰组的ΔCt值，得到ΔΔCt值。
      注:ΔΔCt 值大于 0 表示干扰有效。

5. 评估RNAi后线虫成虫的体长

1. 在RNAi之后，在PDA板的双 歧杆菌 草坪上培养J2幼虫直到成年期，在25°C¹⁵下培养60小时。
2. 使用贝尔曼漏斗方法收集成虫（见步骤1.1.2.1）¹⁴。
3. 在显微镜下获取成年线虫的图像，并使用ImageJ软件（或其他测量软件）测量体长。
   1. 使用 ImageJ 测量长度，方法是选择" 分析|设置比例。如果距离已知，请输入绘制的直线的长度值。输入长度单位。
   2. 选中全局复选框（对所有图片使用此标准），然后单击确定以选择要测量的长度，并在要测量的图像上使用直线进行测量。
   3. 使用命令 Ctrl+M （测量）显示结果并将其记录在 结果 窗口中。
4. 测量50条雄性和50条雌性线虫进行统计分析¹²。
5. 通过计算每个样本的平均值和标准偏差来分析数据。使用学生 t 检验比较来自不同组的样本均值。

结果

RNAi后嗜木杆菌ppm-1表达分析
用GFP dsRNA浸泡的嗜木杆菌ppm-1基因和用靶基因dsRNA浸泡的ppm-1基因的相对表达水平分别为0.92和0.52（ddH₂O处理的对照组的ppm-1基因表达水平设置为1）（图1）。因此，外源性dsRNA对嗜木杆菌的ppm-1表达没有影响;然而，ppm-1 dsRN...

讨论

虽然嗜木杆菌的生活史和寄生环境与其他线虫不同，但对这种植物病原体的分子发病机制的研究有限。尽管CRISPR/Cas9基因组编辑技术在秀丽隐杆线虫和其他线虫中的应用取得了巨大进展^{，但迄今为止}，只有应用于嗜木杆菌的RNAi技术已经发表。RNAi是研究线虫基因功能的最强大的工具之一，已被广泛用于阐明嗜木杆菌基因功能，信号转导途径和基因治疗的...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Baermann funnel	n/a	n/a	to isolate nematodes
Beacon Designer 7.9	Shanghai kangyusheng information technology co.	n/a	to design qPCR primers
Botrytis cinerea	n/a	n/a	as food for nematodes
Bursaphelenchus xylophilus	n/a	n/a	its number was NXY61 and was it was originally extracted from diseased Pinus massoniana in Ningbo, Zhejiang province, China.
constant temperature incubator	Shanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co.	H1703544	to cultur nematodes
Electrophoresis apparatus	Bio-Rad Laboratories	1704466	to achieve electrophoretic analysis
Ethanol, 75%	Sinopharm Chemical Reagent Co.	80176961	to extract RNA
Ex Taq Polymerase Premix	Takara Bio Inc.	RR030A	for PCR
Ex Taq Polymerase Premix	Takara Bio Inc.	RR390A	for PCR
Gel imager	LongGene Scientific Instruments Co.	LG2020	to make nucleic acid bands visible
GraphPad Prism 8	GraphPad Prism	n/a	to analyze the data and make figurs
High Speed Centrifuge	Hangzhou Allsheng Instruments Co.	AS0813000	centrifug
High-flux tissue grinder	Bertin		to extract RNA
ImageJ software	National Institutes of Health	n/a	to measure the body lengths
isopropyl alcohol	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.	L1909022	to extract RNA
Leica DM4B microscope	Leica Microsystems Inc.		to observe nematodes
magnetic beads	Aoran science technology co.	150010C	to extract RNA
MEGAscript T7 High Yield Transcription Kit	Thermo Fisher Scientific Inc.	AM1333	to synthesize dsRNA in vitro
NanoDrop ND-2000 spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific Inc.	NanoDrop 2000/2000C	to analyze the quality of the dsRNA
PCR Amplifier	Bio-Rad Life Medical Products Co.	1851148	to amplify nucleic acid sequence
Petri dishes	n/a	n/a	to cultur nematodes
pGEM-T Easy vector	Promega Corporation	A1360	for cloning
Potato Dextrose Agar (Medium)	n/a	n/a	to cultur Botrytis cinerea
Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser	Takara Bio Inc.	RR047B	to synthetic cDNA
Primer Premier 5.0	PREMIER Biosoft	n/a	to design PCR primers
primers:ppm-1-F/R	Tsingke Biotechnology Co.	n/a	F: 5'-GATGCGAAGTTGCCAATCATTCT -3'; R: 5'- CCAGATCCAGTCCACCATACACC -3
q-ppm-1-F/R	Tsingke Biotechnology Co.	n/a	F: 5'-CATCCGAATGGCAATACAG-3'; R: 5'-ACTATCCTCAGCGTTAGC-3'
Real-time thermal cycler qTOWER 2.2	Analytique Jena Instruments (Beijing) Co.		for qPCR
shaking table	Shanghai Zhicheng analytical instrument manufacturing co.		to soak nematodes
stereoscopic microscope	Chongqing Optec Instrument Co.	1814120	to observe nematodes
T7-GFP-F/R	Tsingke Biotechnology Co.	n/a	F: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAAA GGAGAAGAACTTTTCAC-3'; R: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGCTG TTACAAACTCAAGAAGG-3'
T7 promoter	Tsingke Biotechnology Co.	n/a	TAATACGACTCACTATAGGG
Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit	Takara Bio Inc.	9762	to recover DNA
TaKaRa TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)	Takara Bio Inc.	RR820A	for qPCR
trichloroethane	Shanghai LingFeng Chemical Reagent Co.		to extract RNA
TRIzol Reagent	Thermo Fisher Scientific Inc.	15596026	total RNA extraction reagent,to extract RNA