Application de l’interférence ARN chez le nématode du pin, Bursaphelenchus xylophilus

Résumé

Ici, nous introduisons une méthode de trempage détaillée de l’interférence ARN chez Bursaphelenchus xylophilus pour faciliter l’étude des fonctions des gènes.

Résumé

Le nématode du pin, Bursaphelenchus xylophilus, est l’une des espèces envahissantes les plus destructrices au monde, causant le flétrissement et éventuellement la mort des pins. Malgré la reconnaissance de leur importance économique et environnementale, il a été jusqu’à présent impossible d’étudier les fonctions génétiques détaillées des nématodes parasites des plantes (NPP) à l’aide de la génétique avancée conventionnelle et des méthodes transgéniques. Cependant, en tant que technologie de génétique inverse, l’interférence ARN (ARNi) facilite l’étude des gènes fonctionnels des nématodes, y compris B. xylophilus.

Cet article décrit un nouveau protocole pour l’ARNi du gène ppm-1 chez B. xylophilus, qui joue un rôle crucial dans le développement et la reproduction d’autres nématodes pathogènes. Pour l’ARNi, le promoteur T7 a été lié au 5'-terminal du fragment cible par réaction en chaîne de la polymérase (PCR), et l’ARN double brin (ARNds) a été synthétisé par transcription in vitro . Par la suite, l’administration d’ARNds a été accomplie en trempant les nématodes dans une solution d’ARNds mélangée à des neurostimulants synthétiques. Des juvéniles synchronisés de B. xylophilus (environ 20 000 individus) ont été lavés et trempés dans de l’ARNds (0,8 μg/mL) dans le tampon de trempage pendant 24 heures dans l’obscurité à 25 °C.

La même quantité de nématodes a été placée dans un tampon de trempage sans ARNds comme témoin. Pendant ce temps, une autre quantité identique de nématodes a été placée dans un tampon de trempage avec le gène dsRNA de la protéine fluorescente verte (gfp) comme témoin. Après trempage, le niveau d’expression des transcrits cibles a été déterminé à l’aide de la PCR quantitative en temps réel. Les effets de l’ARNi ont ensuite été confirmés à l’aide d’une observation microscopique des phénotypes et d’une comparaison de la taille corporelle des adultes parmi les groupes. Le protocole actuel peut aider à faire progresser la recherche pour mieux comprendre les fonctions des gènes de B. xylophilus et d’autres nématodes parasites vers l’élaboration de stratégies de contrôle par génie génétique.

Introduction

Les nématodes phytoparasites (NPP) constituent une menace permanente pour la sécurité alimentaire et les écosystèmes forestiers. Ils causent environ 100 milliards USD de pertes économiques chaque année¹, dont les plus problématiques sont principalement les nématodes à galles, les nématodes à kystes et les nématodes du pin. Le nématode du pin, Bursaphelenchus xylophilus, est un nématode endoparasite migrateur, qui est l’agent pathogène causal de la maladie du flétrissement du pin². Il a causé de grands dommages aux forêts de pins dans le monde^{entier 3}. En utilisant la terminologie de Van M....

Protocole

L’étude a été approuvée par le conseil pour l’expérimentation animale de l’Université agricole et forestière du Zhejiang. L’isolat NXY61 de B. xylophilus a été extrait à l’origine d’un Pinus massoniana malade dans la région de Ningbo de la province du Zhejiang, en Chine¹¹.

1. Clonage génétique

REMARQUE : Consultez le tableau des matériaux pour plus de détails sur les amorces utilisées dans ce protocole.

1. Collectez des nématodes.
   1. Culture de la souche de B. xylophilus sur le mycélium de Botrytis cinerea sur....

Résultats

Analyse de l’expression ppm-1 de B. xylophilus après ARNi
Le niveau d’expression relative du gène ppm-1 de B. xylophilus imbibé d’ARNds GFP et celui imbibé du gène cible dsRNA était respectivement de 0,92 et 0,52 (le niveau d’expression génique ppm-1 du groupe témoin traité par ddH₂O a été fixé à 1) (Figure 1). Ainsi, l’ARNds e.......

Discussion

Bien que le cycle biologique et l’environnement parasitaire de B. xylophilus soient différents de ceux d’autres nématodes, il y a eu peu de recherches sur la pathogenèse moléculaire de ce phytopathogène. Malgré de grands progrès réalisés dans l’application de la technologie d’édition du génome CRISPR/Cas9 chez C. elegans et d’autres nématodes, seule la technologie ARNi appliquée à B. xylophilus a été publiée à ce jour¹⁷. L’ARNi est l’un de.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Baermann funnel	n/a	n/a	to isolate nematodes
Beacon Designer 7.9	Shanghai kangyusheng information technology co.	n/a	to design qPCR primers
Botrytis cinerea	n/a	n/a	as food for nematodes
Bursaphelenchus xylophilus	n/a	n/a	its number was NXY61 and was it was originally extracted from diseased Pinus massoniana in Ningbo, Zhejiang province, China.
constant temperature incubator	Shanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co.	H1703544	to cultur nematodes
Electrophoresis apparatus	Bio-Rad Laboratories	1704466	to achieve electrophoretic analysis
Ethanol, 75%	Sinopharm Chemical Reagent Co.	80176961	to extract RNA
Ex Taq Polymerase Premix	Takara Bio Inc.	RR030A	for PCR
Ex Taq Polymerase Premix	Takara Bio Inc.	RR390A	for PCR
Gel imager	LongGene Scientific Instruments Co.	LG2020	to make nucleic acid bands visible
GraphPad Prism 8	GraphPad Prism	n/a	to analyze the data and make figurs
High Speed Centrifuge	Hangzhou Allsheng Instruments Co.	AS0813000	centrifug
High-flux tissue grinder	Bertin		to extract RNA
ImageJ software	National Institutes of Health	n/a	to measure the body lengths
isopropyl alcohol	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.	L1909022	to extract RNA
Leica DM4B microscope	Leica Microsystems Inc.		to observe nematodes
magnetic beads	Aoran science technology co.	150010C	to extract RNA
MEGAscript T7 High Yield Transcription Kit	Thermo Fisher Scientific Inc.	AM1333	to synthesize dsRNA in vitro
NanoDrop ND-2000 spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific Inc.	NanoDrop 2000/2000C	to analyze the quality of the dsRNA
PCR Amplifier	Bio-Rad Life Medical Products Co.	1851148	to amplify nucleic acid sequence
Petri dishes	n/a	n/a	to cultur nematodes
pGEM-T Easy vector	Promega Corporation	A1360	for cloning
Potato Dextrose Agar (Medium)	n/a	n/a	to cultur Botrytis cinerea
Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser	Takara Bio Inc.	RR047B	to synthetic cDNA
Primer Premier 5.0	PREMIER Biosoft	n/a	to design PCR primers
primers:ppm-1-F/R	Tsingke Biotechnology Co.	n/a	F: 5'-GATGCGAAGTTGCCAATCATTCT -3'; R: 5'- CCAGATCCAGTCCACCATACACC -3
q-ppm-1-F/R	Tsingke Biotechnology Co.	n/a	F: 5'-CATCCGAATGGCAATACAG-3'; R: 5'-ACTATCCTCAGCGTTAGC-3'
Real-time thermal cycler qTOWER 2.2	Analytique Jena Instruments (Beijing) Co.		for qPCR
shaking table	Shanghai Zhicheng analytical instrument manufacturing co.		to soak nematodes
stereoscopic microscope	Chongqing Optec Instrument Co.	1814120	to observe nematodes
T7-GFP-F/R	Tsingke Biotechnology Co.	n/a	F: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAAA GGAGAAGAACTTTTCAC-3'; R: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGCTG TTACAAACTCAAGAAGG-3'
T7 promoter	Tsingke Biotechnology Co.	n/a	TAATACGACTCACTATAGGG
Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit	Takara Bio Inc.	9762	to recover DNA
TaKaRa TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)	Takara Bio Inc.	RR820A	for qPCR
trichloroethane	Shanghai LingFeng Chemical Reagent Co.		to extract RNA
TRIzol Reagent	Thermo Fisher Scientific Inc.	15596026	total RNA extraction reagent,to extract RNA