Application de l’interférence ARN chez le nématode du pin, Bursaphelenchus xylophilus

Résumé

Ici, nous introduisons une méthode de trempage détaillée de l’interférence ARN chez Bursaphelenchus xylophilus pour faciliter l’étude des fonctions des gènes.

Résumé

Le nématode du pin, Bursaphelenchus xylophilus, est l’une des espèces envahissantes les plus destructrices au monde, causant le flétrissement et éventuellement la mort des pins. Malgré la reconnaissance de leur importance économique et environnementale, il a été jusqu’à présent impossible d’étudier les fonctions génétiques détaillées des nématodes parasites des plantes (NPP) à l’aide de la génétique avancée conventionnelle et des méthodes transgéniques. Cependant, en tant que technologie de génétique inverse, l’interférence ARN (ARNi) facilite l’étude des gènes fonctionnels des nématodes, y compris B. xylophilus.

Cet article décrit un nouveau protocole pour l’ARNi du gène ppm-1 chez B. xylophilus, qui joue un rôle crucial dans le développement et la reproduction d’autres nématodes pathogènes. Pour l’ARNi, le promoteur T7 a été lié au 5'-terminal du fragment cible par réaction en chaîne de la polymérase (PCR), et l’ARN double brin (ARNds) a été synthétisé par transcription in vitro . Par la suite, l’administration d’ARNds a été accomplie en trempant les nématodes dans une solution d’ARNds mélangée à des neurostimulants synthétiques. Des juvéniles synchronisés de B. xylophilus (environ 20 000 individus) ont été lavés et trempés dans de l’ARNds (0,8 μg/mL) dans le tampon de trempage pendant 24 heures dans l’obscurité à 25 °C.

La même quantité de nématodes a été placée dans un tampon de trempage sans ARNds comme témoin. Pendant ce temps, une autre quantité identique de nématodes a été placée dans un tampon de trempage avec le gène dsRNA de la protéine fluorescente verte (gfp) comme témoin. Après trempage, le niveau d’expression des transcrits cibles a été déterminé à l’aide de la PCR quantitative en temps réel. Les effets de l’ARNi ont ensuite été confirmés à l’aide d’une observation microscopique des phénotypes et d’une comparaison de la taille corporelle des adultes parmi les groupes. Le protocole actuel peut aider à faire progresser la recherche pour mieux comprendre les fonctions des gènes de B. xylophilus et d’autres nématodes parasites vers l’élaboration de stratégies de contrôle par génie génétique.

Introduction

Les nématodes phytoparasites (NPP) constituent une menace permanente pour la sécurité alimentaire et les écosystèmes forestiers. Ils causent environ 100 milliards USD de pertes économiques chaque année¹, dont les plus problématiques sont principalement les nématodes à galles, les nématodes à kystes et les nématodes du pin. Le nématode du pin, Bursaphelenchus xylophilus, est un nématode endoparasite migrateur, qui est l’agent pathogène causal de la maladie du flétrissement du pin². Il a causé de grands dommages aux forêts de pins dans le monde^{entier 3}. En utilisant la terminologie de Van Megen et ^al.4, B. xylophilus est un membre des Parasitaphelenchidae et appartient au clade 10, alors que la plupart des autres parasites végétaux majeurs appartiennent au clade 12.

En tant que parasite végétal indépendant et récemment évolué, B. xylophilus est un modèle attrayant pour les études comparatives. À ce jour, il y a eu des recherches substantielles sur les nématodes à galles et les nématodes à kystes appartenant au clade 12, qui sont des endoparasites sédentaires obligatoires et qui sont parmi les nématodes les plus étudiés. Cependant, mener d’autres recherches dans ce domaine important s’accompagne d’un défi majeur: la fonction des gènes du parasitisme est un goulot d’étranglement de la recherche. Les études fonctionnelles comprennent généralement des expériences d’expression ectopique et de knockdown/out, mais reposent sur des protocoles de transformation génétique efficaces pour le nématode. En conséquence, la génétique inverse dans les NPP repose presque exclusivement sur le silençage génique par l’ARNi.

L’ARNi, un mécanisme largement présent dans les cellules eucaryotes, réduit au silence l’expression des gènes en introduisant de l’ARN double brin (ARNds)⁵. À ce jour, le mécanisme de silençage génique post-transcriptionnel induit par l’ARNds a été trouvé chez tous les eucaryotes étudiés, et la technologie ARNi, en tant qu’outil de recherche en génomique fonctionnelle et d’autres applications, s’est développée rapidement dans de nombreux organismes. Depuis la découverte de la machinerie ARNi chez Caenorhabditis elegans en 1998⁶, les techniques ARNi sont devenues des méthodes efficaces pour identifier la fonction génique des nématodes et sont proposées comme une nouvelle façon de lutter efficacement contre les nématodes pathogènes⁷.

L’ARNi est techniquement facile - tremper les juvéniles dans l’ARNds peut suffire; Cependant, l’efficacité et la reproductibilité de cette approche varient considérablement selon l’espèce de nématode et le gène cible⁸. Le silençage de 20 gènes impliqués dans les voies ARNi du nématode à galles, Meloidogyne incognita, a été étudié en utilisant de longs ARNd comme déclencheurs, entraînant diverses réponses, y compris une augmentation et aucun changement dans l’expression de certains gènes⁹. Ces résultats montrent que les gènes cibles peuvent réagir différemment à l’ARNi knockdown, ce qui nécessite une évaluation exhaustive de leur aptitude en tant que cibles pour la lutte contre les nématodes via l’ARNi. Cependant, il y a actuellement peu de recherches sur la biologie du développement et de la reproduction de B. xylophilus.

Dans la continuité des travaux précédents^10,11,12,13, nous décrivons ici un protocole d’application de l’ARNi pour étudier la fonction du gène ppm-1 de B. xylophilus, y compris la synthèse de l’ARNds^, le trempage des neurostimulants synthétiques et la détection de la réaction en chaîne de la polymérase quantitative (qPCR). Les connaissances acquises grâce à cette approche expérimentale contribueront probablement de façon marquée à la compréhension des systèmes biologiques de base et à la prévention de la maladie du flétrissement du pin.

Protocole

L’étude a été approuvée par le conseil pour l’expérimentation animale de l’Université agricole et forestière du Zhejiang. L’isolat NXY61 de B. xylophilus a été extrait à l’origine d’un Pinus massoniana malade dans la région de Ningbo de la province du Zhejiang, en Chine¹¹.

1. Clonage génétique

REMARQUE : Consultez le tableau des matériaux pour plus de détails sur les amorces utilisées dans ce protocole.

1. Collectez des nématodes.
   1. Culture de la souche de B. xylophilus sur le mycélium de Botrytis cinerea sur des plaques de gélose au dextrose de pomme de terre (PDA) à 25 °C pendant 3 à 5 jours.
   2. Recueillir les nématodes en utilisant la méthode de l’entonnoir de Bellman¹⁴.
      1. Placez un tube en caoutchouc serré sous un entonnoir et placez deux couches de papier filtre dans l’embouchure de l’entonnoir. Transférez les cultures fongiques dans l’entonnoir et ajoutez de l’eau pour immerger le tapis fongique. Attendez 2 h, puis ramassez les nématodes.
2. Extraire l’ARN total des nématodes à l’aide d’un réactif d’extraction d’ARN total (voir le tableau des matériaux)¹¹ selon les étapes suivantes.
   1. Ajouter 500 μL de réactif d’extraction et 100 μL de billes magnétiques à un tube centrifuge de 2 mL. Aspirer 20 μL des nématodes et transférer l’échantillon dans un broyeur pour le broyer à 9 000 × g pendant 30 s. Incuber pendant 5 min puis centrifuger pendant 10 min à 12 000 × g et 4 °C.
   2. Transférer le surnageant dans un nouveau tube à centrifuger. Ajouter 100 μL de chloroforme, boucher le tube et mélanger en retournant le tube plusieurs fois. Incuber pendant 3 min puis centrifuger pendant 10 min à 12 000 × g à 4 °C.
   3. Transférer le surnageant dans un nouveau tube à centrifuger. Ajouter 250 μL d’alcool isopropylique et vortex vigoureusement. Centrifuger à 12 000 × g pendant 10 min.
   4. Jetez le surnageant. Ajouter 500 μL d’éthanol à 75% pour laver l’ARN, puis vortex l’échantillon. Centrifuger pendant 5 min à 12 000 × g et 4 °C.
   5. Sécher à l’air libre la pastille d’ARN pendant 5 min.
   6. Remettez la pastille en suspension dans 30 μL d’eau sans RNase.
   7. Calculer la concentration d’ARN à l’aide de la formule : A260 × dilution × 40 = μg ARN/mL. Calculez le ratio A260/A280.
      REMARQUE: Un rapport de ~2 est considéré comme pur.
3. Effectuer une transcription inverse d’ARN de bonne qualité pour obtenir le modèle d’ADNc.
   1. Concevoir et utiliser une paire d’amorces spécifiques, ppm-1-F/R (voir le tableau des matériaux), pour amplifier la séquence codante partielle du gène Bx-ppm-1 chez B. xylophilus (numéro d’acquisition GenBank QTZ96795).
   2. Cloner les séquences du gène ppm-1 dans le vecteur pGEM-Teasy contenant le promoteur T7 en suivant un protocole de clonage standard¹¹.
      1. Configurez les réactions PCR comme suit : 2 μL d’ADNc, 25 μL de 2x Prémélange de polymérase Ex Taq, 2 μL de chaque apprêt (10 pmol / l) et eau distillée stérile jusqu’à un volume final de 50 μL.
      2. Effectuer la procédure d’amplification comme suit: 5 min à 94 °C; suivi de 35 cycles de 30 s à 94 °C, 30 s à 55 °C et 1 min à 72 °C; et une dernière étape d’extension à 72 °C pendant 5 min.
      3. Cloner les produits amplifiés dans un vecteur pGEM-T Easy pour le séquençage.

2. Synthèse de l’ARNds

1. Préparer le modèle d’ADN pour la synthèse de l’ARNds en utilisant la PCR avec des amorces conçues pour ajouter des sites promoteurs T7 aux deux extrémités. Ajouter la séquence promotrice T7 à l’extrémité 5' des amorces.
2. Utiliser le plasmide contenant le fragment du gène ppm-1 (894 pb) comme matrice pour la PCR et récupérer le fragment contenant le promoteur T7¹¹. Utilisez la procédure et le système de PCR décrits ci-dessus.
3. Utilisez un kit de transcription in vitro pour synthétiser dsRNA¹¹.
   1. Décongeler les réactifs congelés sur la glace.
   2. Ajouter 2 μL de tampon de réaction 10x, 2 μL de mélange d’enzymes et 1 μg d’ADN dans un tube centrifugeur. Ajouter de l’eau sans nucléase pour produire une réaction standard de 4 μL. Ensuite, mélanger des volumes égaux des quatre solutions de ribonucléotides (ATP, CTP, GTP et UTP) ensemble et ajouter 8 μL du mélange dans le tube. Bien mélanger et incuber à 37 °C pendant 4 h.
   3. Ajouter 1 μL de DNase, bien mélanger et incuber pendant 15 min à 37 °C.
   4. Arrêter la réaction et ajouter 30 μL d’eau sans nucléase et 30 μL de solution de précipitation LiCl pour précipiter l’ARN. Mélanger. Incuber à -20 °C pendant une nuit.
   5. Centrifuger pendant 15 min à 12 000 × g et 4 °C. Jetez le surnageant.
   6. Ajouter 1 mL d’éthanol à 75% pour laver l’ARN. Tourbillonner l’échantillon et le centrifuger pendant 10 min à 12 000 × g et 4 °C.
   7. Sécher à l’air la pastille d’ARN pendant 3 min.
   8. Remettez la pastille en suspension dans 30 μL d’eau sans RNase.
   9. Analyser la qualité de l’ARNds à l’aide d’un spectrophotomètre. Pipeter 1 μL de l’échantillon dsRNA sur le piédestal de mesure et régler la longueur d’onde à 340 nm. Visualisez les produits sur un gel d’agarose à 1,0 %.

3. ARNi par trempage

1. Mélanger 4 μL de tampon de trempage 5x (gélatine à 0,05 %, 5,5 mM KH 2 PO 4, NaCl_2,1mM,_4,7 mM_NH4Cl, 3 mM de spermidine) avec l’ARNds et le ddH2O pour obtenir un volume total de 20 μL etune concentration finale d’ARN de 0,8 μg/mL.
2. Acquérir des larves J2.
   1. Recueillir les nématodes des cultures fongiques et les transférer dans une boîte de Petri en verre de 6 cm de diamètre. Ajouter 10 ml d’eau dans le plat pour que les nématodes puissent nager librement. Gardez les nématodes dans le plat pendant 30 minutes et attendez que les œufs adhèrent au fond.
   2. Retirez soigneusement l’eau et les nématodes, en veillant à ne pas déranger les œufs. Répétez les étapes jusqu’à ce que toutes les larves et les adultes soient enlevés, ne laissant que les œufs dans le plat.
   3. Faire éclore les œufs collectés pendant 24 h dans l’obscurité à 25 °C pour obtenir des larves J2. Recueillir les larves J2, les placer dans un tube et les laver trois fois avec ddH₂O pour l’expérience ARNi¹⁵.
   4. Transférer les larves J2 dans le tube de 2 mL contenant la solution d’ARNds et ajouter la solution de résorcinol (enveloppée dans du papier d’aluminium et dissoute dans l’eau) pour obtenir une concentration finale de 1,0%. Incuber les larves par centrifugation à 15 × g sur une table à agiter pendant 24 h à 25 °C pour s’assurer que les larves absorbent efficacement l’ARNds.
   5. Trempez la même quantité de nématodes dans le tampon de trempage sans la sonde dsRNA ou avec une sonde dsRNA GFP comme témoin. Utiliser le gène GFP (gfp, M62653.1) comme témoin non endogène et synthétiser l’ARNds du gfp à l’aide d’amorces spécifiques au gène T7-GFP-F/R.

4. Détection qPCR

1. Nettoyez les larves J2 avec ddH₂O, y compris celles présentant une interférence du gène cible, une interférence du gène GFP et le groupe témoin non perturbé. Extraire les ARN totaux de chaque groupe en utilisant la méthode décrite ci-dessus.
2. Démarrez la qPCR.
   1. Concevez les amorces q-ppm-1-F/R à l’aide du logiciel souhaité (voir le tableau des matériaux).
   2. Mettre en place la réaction qPCR dans 12 μL contenant 1 μL d’ADNc, 6 μL de prémélange fluorescent, 0,4 μL de chaque apprêt (10 pmol / l) et de l’eau distillée stérile.
   3. Effectuer la qPCR comme suit : 2 min à 95 °C ; suivi de 40 cycles de 10 s à 95 °C, 30 s à 55 °C et 1 min à 72 °C.
   4. Utiliser le gène actb (numéro d’acquisition GenBank EU100952) et le gène tbb-2 (numéro d’accession GenBank MT769316), ou d’autres gènes, comme gènes de référence internes pour évaluer les changements dans le niveau d’expression génique après ARNi¹⁵.
3. Selon la valeur du seuil de cycle (Ct) et la courbe de dissolution, utilisez la méthode ^2-ΔΔCt pour estimer le niveau d’expression relative du gène cible et vérifier l’efficacité d’interférence.
   1. Soustrayez la valeur Ct du gène de référence interne de chaque échantillon de la valeur Ct du gène cible pour obtenir la valeur ΔCt. Ensuite, soustrayez la valeur ΔCt du groupe d’interférence de la valeur ΔCt du groupe témoin pour obtenir la valeur ΔΔCt.
      REMARQUE : Une valeur ΔΔCt supérieure à 0 indique que l’interférence est effective.

5. Évaluer la longueur corporelle des nématodes adultes après l’ARNi

1. Après ARNi, cultiver les larves J2 jusqu’à l’âge adulte sur des pelouses de B. cinerea dans des plaques PDA pendant 60 h à 25 °C¹⁵.
2. Recueillir les adultes à l’aide de la méthode de l’entonnoir de Bellman (voir étape 1.1.2.1)¹⁴.
3. Obtenez des images des nématodes adultes au microscope et utilisez le logiciel ImageJ (ou un autre logiciel de mesure) pour mesurer la longueur du corps.
   1. Mesurez la longueur à l’aide d’ImageJ en sélectionnant Analyser | Définir l’échelle. Si la distance est connue, entrez la valeur de longueur de la ligne droite tracée. Entrez l’unité de longueur.
   2. Cochez la case Global (utilisez cette norme pour toutes les images), puis cliquez sur OK pour sélectionner la longueur à mesurer avec une ligne droite sur l’image à mesurer.
   3. Utilisez la commande Ctrl+M (mesure) pour afficher les résultats et les enregistrer dans la fenêtre de résultats .
4. Prendre des mesures de 50 nématodes mâles et de 50 nématodes femelles pour analyse statistique¹².
5. Analysez les données en calculant la moyenne et l’écart-type pour chaque échantillon. Comparez les moyennes des échantillons des différents groupes à l’aide du test t de Student.

Résultats

Analyse de l’expression ppm-1 de B. xylophilus après ARNi
Le niveau d’expression relative du gène ppm-1 de B. xylophilus imbibé d’ARNds GFP et celui imbibé du gène cible dsRNA était respectivement de 0,92 et 0,52 (le niveau d’expression génique ppm-1 du groupe témoin traité par ddH₂O a été fixé à 1) (Figure 1). Ainsi, l’ARNds e...

Discussion

Bien que le cycle biologique et l’environnement parasitaire de B. xylophilus soient différents de ceux d’autres nématodes, il y a eu peu de recherches sur la pathogenèse moléculaire de ce phytopathogène. Malgré de grands progrès réalisés dans l’application de la technologie d’édition du génome CRISPR/Cas9 chez C. elegans et d’autres nématodes, seule la technologie ARNi appliquée à B. xylophilus a été publiée à ce jour¹⁷. L’ARNi est l’un de...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Baermann funnel	n/a	n/a	to isolate nematodes
Beacon Designer 7.9	Shanghai kangyusheng information technology co.	n/a	to design qPCR primers
Botrytis cinerea	n/a	n/a	as food for nematodes
Bursaphelenchus xylophilus	n/a	n/a	its number was NXY61 and was it was originally extracted from diseased Pinus massoniana in Ningbo, Zhejiang province, China.
constant temperature incubator	Shanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co.	H1703544	to cultur nematodes
Electrophoresis apparatus	Bio-Rad Laboratories	1704466	to achieve electrophoretic analysis
Ethanol, 75%	Sinopharm Chemical Reagent Co.	80176961	to extract RNA
Ex Taq Polymerase Premix	Takara Bio Inc.	RR030A	for PCR
Ex Taq Polymerase Premix	Takara Bio Inc.	RR390A	for PCR
Gel imager	LongGene Scientific Instruments Co.	LG2020	to make nucleic acid bands visible
GraphPad Prism 8	GraphPad Prism	n/a	to analyze the data and make figurs
High Speed Centrifuge	Hangzhou Allsheng Instruments Co.	AS0813000	centrifug
High-flux tissue grinder	Bertin		to extract RNA
ImageJ software	National Institutes of Health	n/a	to measure the body lengths
isopropyl alcohol	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.	L1909022	to extract RNA
Leica DM4B microscope	Leica Microsystems Inc.		to observe nematodes
magnetic beads	Aoran science technology co.	150010C	to extract RNA
MEGAscript T7 High Yield Transcription Kit	Thermo Fisher Scientific Inc.	AM1333	to synthesize dsRNA in vitro
NanoDrop ND-2000 spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific Inc.	NanoDrop 2000/2000C	to analyze the quality of the dsRNA
PCR Amplifier	Bio-Rad Life Medical Products Co.	1851148	to amplify nucleic acid sequence
Petri dishes	n/a	n/a	to cultur nematodes
pGEM-T Easy vector	Promega Corporation	A1360	for cloning
Potato Dextrose Agar (Medium)	n/a	n/a	to cultur Botrytis cinerea
Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser	Takara Bio Inc.	RR047B	to synthetic cDNA
Primer Premier 5.0	PREMIER Biosoft	n/a	to design PCR primers
primers:ppm-1-F/R	Tsingke Biotechnology Co.	n/a	F: 5'-GATGCGAAGTTGCCAATCATTCT -3'; R: 5'- CCAGATCCAGTCCACCATACACC -3
q-ppm-1-F/R	Tsingke Biotechnology Co.	n/a	F: 5'-CATCCGAATGGCAATACAG-3'; R: 5'-ACTATCCTCAGCGTTAGC-3'
Real-time thermal cycler qTOWER 2.2	Analytique Jena Instruments (Beijing) Co.		for qPCR
shaking table	Shanghai Zhicheng analytical instrument manufacturing co.		to soak nematodes
stereoscopic microscope	Chongqing Optec Instrument Co.	1814120	to observe nematodes
T7-GFP-F/R	Tsingke Biotechnology Co.	n/a	F: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAAA GGAGAAGAACTTTTCAC-3'; R: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGCTG TTACAAACTCAAGAAGG-3'
T7 promoter	Tsingke Biotechnology Co.	n/a	TAATACGACTCACTATAGGG
Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit	Takara Bio Inc.	9762	to recover DNA
TaKaRa TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)	Takara Bio Inc.	RR820A	for qPCR
trichloroethane	Shanghai LingFeng Chemical Reagent Co.		to extract RNA
TRIzol Reagent	Thermo Fisher Scientific Inc.	15596026	total RNA extraction reagent,to extract RNA