Aplicação de interferência de RNA no Nematode pinewood, Bursaphelenchus xylophilus

Resumo

Aqui, introduzimos um método de imersão detalhado da interferência de RNA em Bursaphelenchus xylophilus para facilitar o estudo das funções genéticas.

Resumo

O nematode de pinheiro, Bursaphelenchus xylophilus, é uma das espécies invasoras mais destrutivas do mundo, causando a murcha e eventual morte de pinheiros. Apesar do reconhecimento de sua significância econômica e ambiental, até agora tem sido impossível estudar as funções genéticas detalhadas dos nematoides parasiticos vegetais (PPNs) utilizando genética convencional para a frente e métodos transgênicos. No entanto, como uma tecnologia genética reversa, a interferência de RNA (RNAi) facilita o estudo dos genes funcionais de nematoides, incluindo B. xylophilus.

Este artigo descreve um novo protocolo para RNAi do gene ppm-1 em B. xylophilus, que tem sido relatado para desempenhar papéis cruciais no desenvolvimento e reprodução de outros nematoides patogênicos. Para o RNAi, o promotor T7 foi ligado ao 5′-terminal do fragmento alvo por reação em cadeia de polimerase (PCR), e o RNA de dupla cadeia (dsRNA) foi sintetizado por transcrição in vitro . Posteriormente, a entrega de dsRNA foi realizada absorvendo os nematoides em uma solução dsRNA misturada com neuroestimulantes sintéticos. Os jovens sincronizados de B. xylophilus (aproximadamente 20.000 indivíduos) foram lavados e encharcados em dsRNA (0,8 μg/mL) no tampão de imersão por 24 h no escuro a 25 °C.

A mesma quantidade de nematoides foi colocada em um tampão de imersão sem dsRNA como controle. Enquanto isso, outra quantidade idêntica de nematoides foi colocada em um tampão de imersão com proteína fluorescente verde (gfp) gene dsRNA como controle. Após a imersão, o nível de expressão das transcrições de destino foi determinado por meio de PCR quantitativo em tempo real. Os efeitos da RNAi foram então confirmados utilizando-se observação microscópica dos fenótipos e comparação do tamanho do corpo dos adultos entre os grupos. O protocolo atual pode ajudar a avançar a pesquisa para entender melhor as funções dos genes de B. xilophilus e outros nematoides parasitas para o desenvolvimento de estratégias de controle através da engenharia genética.

Introdução

Os nematoides parasiticos vegetais (PPNs) são uma ameaça contínua à segurança alimentar e aos ecossistemas florestais. Eles causam cerca de 100 bilhões de USD em perdas econômicas a cada^{ano 1}, dos quais os mais problemáticos são principalmente nematoides de nó raiz, nematoides de cisto e nematoides de pinheiros. O nematoide de pinheiro, Bursaphelenchus xylophilus, é um nematoide migratório e endoparasitário, que é o patógeno causal da doença^de murchar pinheiro 2. Causou grandes danos às florestas de pinheiros em todo o mundo³. Usando a terminologia de Van Megen et ^al.4, B. xylophilus é um membro do Parasitaphelenchidae e pertence ao clade 10, enquanto a maioria dos outros grandes parasitas vegetais pertencem ao clade 12.

Como um parasita vegetal independente e recentemente evoluído, B. xylophilus é um modelo atraente para estudos comparativos. Até o momento, tem havido pesquisas substanciais sobre nematoides de nó radicular e nematoides de cisto pertencentes ao clade 12, que são endoparasitas obrigatórias e sedentárias e são alguns dos nematoides mais intensamente estudados. No entanto, a realização de novas pesquisas nessa importante área vem com um grande desafio: a função dos genes do parasitismo é um gargalo de pesquisa. Estudos funcionais geralmente incluem expressões ectópicas e experimentos de knockdown/out, mas dependem de protocolos eficazes de transformação genética para o nematoide. Como resultado, a genética reversa em PPNs depende quase exclusivamente do silenciamento genético pela RNAi.

RNAi, um mecanismo amplamente presente em células eucarióticas, silencia a expressão genética introduzindo RNA de dupla cadeia (dsRNA)⁵. Até o momento, o mecanismo de silenciamento de genes pós-transcrição induzido pelo dsRNA foi encontrado em todos os eucariotes estudados, e a tecnologia RNAi, como uma ferramenta de pesquisa de genômica funcional e outras aplicações, desenvolveu-se rapidamente em muitos organismos. Desde a descoberta do maquinário RNAi em Caenorhabditis elegans em 1998⁶, as técnicas RNAi tornaram-se métodos eficazes para identificar a função genética dos nematoides e são propostas como uma nova maneira de controlar efetivamente os nematoides patogênicos⁷.

RNAi é tecnicamente fácil de absorver os jovens no dsRNA pode ser suficiente; no entanto, a eficácia e a reprodutibilidade dessa abordagem variam amplamente com a espécie nematoide e o gene alvo⁸. O silenciamento de 20 genes envolvidos nas vias RNAi do nematode do nó radicular, Meloidogyne incognita, foi investigado usando dsRNAs longas como gatilhos, resultando em respostas diversas, incluindo um aumento e nenhuma mudança na expressão de alguns genes⁹. Esses resultados mostram que os genes-alvo podem responder ao knockdown da RNAi de forma diferente, exigindo uma avaliação exaustiva de sua adequação como alvos para o controle de nematoide via RNAi. No entanto, há atualmente uma escassez de pesquisas sobre a biologia do desenvolvimento e reprodutiva de B. xilophilus.

Como continuação do trabalho anterior 10,11,12,13, descrevemos aqui um protocolo para a aplicação da RNAi para estudar a função do gene ppm-1 de B. xylophilus, incluindo a síntese de dsRNA, imersão neuroestimulante sintética e detecção quantitativa de reação em cadeia polimerase (qPCR). O conhecimento adquirido com essa abordagem experimental provavelmente contribuirá significativamente para a compreensão dos sistemas biológicos básicos e a prevenção da doença do verrinho.

Protocolo

O estudo foi aprovado pelo conselho para experimentação animal da Zhejiang Agricultural & Forestry University. O b . xylophilus isolante NXY61 foi originalmente extraído de uma massoniana pinus doente na área de Ningbo da província de Zhejiang, China¹¹.

1. Clonagem de genes

NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre os primers utilizados neste protocolo.

1. Colecionar nematoides.
   1. Cultura a cepa B. xylophilus na micelia de Botrytis cinerea em pratos de Dextrose Agar de Batata (PDA) a 25 °C por 3-5 dias.
   2. Colete os nematoides usando o método do funil Bellman¹⁴.
      1. Coloque um tubo de borracha preso abaixo de um funil e coloque duas camadas de papel filtro na boca do funil. Transfira as culturas fúngicas para o funil e adicione água para imergir o tapete fúngico. Espere por 2h, depois pegue os nematoides.
2. Extrair o RNA total dos nematoides utilizando um reagente de extração total de RNA (ver a Tabela de Materiais)¹¹ de acordo com as etapas seguintes.
   1. Adicione 500 μL de reagente de extração e 100 μL de contas magnéticas a um tubo de centrífuga de 2 mL. Aspire 20 μL dos nematoides e transfira a amostra para um moedor para moagem a 9.000 × g para 30 s. Incubar por 5 min e depois centrífuga por 10 min a 12.000 × g e 4 °C.
   2. Transfira o supernatante para um novo tubo de centrífuga. Adicione 100 μL de clorofórmio, tampa o tubo e misture invertendo o tubo várias vezes. Incubar por 3 min e depois centrífuga por 10 min a 12.000 × g a 4 °C.
   3. Transfira o supernatante para um novo tubo de centrífuga. Adicione 250 μL de álcool isopropílico e vórtice vigorosamente. Centrifugar a 12.000 × g por 10 min.
   4. Descarte o supernatante. Adicione 500 μL de 75% de etanol para lavar o RNA e, em seguida, vórtice da amostra. Centrifuá-lo por 5 min a 12.000 × g e 4 °C.
   5. Seque a pelota de RNA por 5 minutos.
   6. Resuspenque a pelota em 30 μL de água sem RNase.
   7. Calcule a concentração de RNA utilizando a fórmula: Diluição de × A260 × 40 = Μg RNA/mL. Calcule a razão A260/A280.
      NOTA: Uma razão de ~2 é considerada pura.
3. Realize a transcrição reversa do RNA de boa qualidade para obter o modelo cDNA.
   1. Projete e use um par de primers específicos, ppm-1-F/R (ver a Tabela de Materiais), para amplificar a sequência de codificação parcial do gene Bx-ppm-1 em B. xylophilus (número de adesão do GenBank QTZ96795).
   2. Clone as sequências genéticas ppm-1 no vetor pGEM-Teasy contendo o promotor T7 seguindo um protocolo de clonagem padrão¹¹.
      1. Configure as reações pcr da seguinte forma: 2 μL de cDNA, 25 μL de 2x Ex Taq Polymerase Premix, 2 μL de cada primer (10 pmol/l) e água destilada estéril a um volume final de 50 μL.
      2. Realizar o procedimento de amplificação da seguinte forma: 5 min a 94 °C; seguido por 35 ciclos de 30 s a 94 °C, 30 s a 55 °C e 1 min a 72 °C; e uma etapa final de extensão a 72 °C por 5 min.
      3. Clone os produtos amplificados em um vetor pGEM-T Easy para sequenciamento.

2. Síntese de dsRNA

1. Prepare o modelo de DNA para síntese de dsRNA usando PCR com primers projetados para adicionar sites de promotores T7 em ambas as extremidades. Adicione a sequência de promotores T7 ao final de 5' dos primers.
2. Use o plasmid contendo o fragmento genético ppm-1 (894 bp) como modelo para PCR e recupere o fragmento contendo o promotor T7¹¹. Use o procedimento PCR e o sistema descrito acima.
3. Use um kit de transcrição in vitro para sintetizar o dsRNA¹¹.
   1. Descongele os reagentes congelados no gelo.
   2. Adicione 2 μL de tampão de reação de 10x, 2 μL de mistura de enzimas e 1 μg de DNA a um tubo de centrífuga. Adicione água sem nuclease para produzir uma reação padrão de 4 μL. Em seguida, misture os volumes iguais das quatro soluções de ribonucleotídeos (ATP, CTP, GTP e UTP) juntos e adicione 8 μL da mistura ao tubo. Misture bem e incubar a 37 °C por 4h.
   3. Adicione 1 μL de DNase, misture bem e incubar por 15 min a 37 °C.
   4. Pare a reação e adicione 30 μL de água sem nuclease e 30 μL de solução de precipitação licl para precipitar o RNA. Homogeneizar. Incubar a -20 °C durante a noite.
   5. Centrifugar por 15 min a 12.000 × g e 4 °C. Descarte o supernatante.
   6. Adicione 1 mL de 75% de etanol para lavar o RNA. Vórtice a amostra e centrífuga por 10 min a 12.000 × g e 4 °C.
   7. Seque a pelota de RNA por 3 minutos.
   8. Resuspenque a pelota em 30 μL de água sem RNase.
   9. Analise a qualidade do dsRNA usando um espectrômetro. Pipeta 1 μL da amostra dsRNA no pedestal de medição e definir o comprimento de onda para 340 nm. Visualize os produtos em um gel de 1,0% agarose.

3. RNAi por imersão

1. Misture 4 μL de tampão de imersão de 5x (0,05% de gelatina, 5,5 mM KH₂PO₄, 2,1 mM NaCl, 4,7 mM NH₄Cl, 3 mM de espermatozoide) com o dsRNA e ddH₂O para produzir um volume total de 20 μL e uma concentração final de RNA de 0,8 μg/mL.
2. Adquira larvas J2.
   1. Recolhe os nematoides das culturas fúngicas e transfere-os para uma placa de vidro Petri de 6 cm de diâmetro. Adicione 10 mL de água ao prato para garantir que os nematoides possam nadar livremente. Mantenha os nematoides no prato por 30 minutos e espere os ovos aderirem ao fundo.
   2. Retire a água e os nematoides cuidadosamente, certificando-se de não perturbar os ovos. Repita os passos até que todas as larvas e adultos sejam removidos, deixando apenas os ovos no prato.
   3. Eclode os ovos coletados por 24 h no escuro a 25 °C para obter larvas J2. Recolher as larvas J2, colocá-las em um tubo e lavá-las três vezes com ddH₂O para o experimento RNAi¹⁵.
   4. Transfira as larvas J2 para o tubo de 2 mL contendo a solução dsRNA e adicione solução resorcinol (embrulhada em papel alumínio e dissolvida em água) para produzir uma concentração final de 1,0%. Incubar as larvas com centrifugação a 15 × g em uma mesa de agitação por 24 h a 25 °C para garantir que as larvas absorvam efetivamente o dsRNA.
   5. Mergulhe a mesma quantidade de nematoides no tampão de imersão sem a sonda dsRNA ou com uma sonda DSRNA GFP como controle. Use o gene GFP (gfp, M62653.1) como um controle não endógeno e sintetize o dsRNA de gfp usando primers específicos de genes T7-GFP-F/R.

4. detecção qPCR

1. Limpe as larvas J2 com ddH₂O, incluindo aquelas com interferência genética alvo, interferência genética GFP e o grupo de controle não perturbado. Extrair o total de RNAs de cada grupo utilizando o método descrito acima.
2. Inicie o qPCR.
   1. Projete os primers q-ppm-1-F/R usando o software desejado (veja a Tabela de Materiais).
   2. Configure a reação qPCR em 12 μL contendo 1 μL de cDNA, 6 μL de precário fluorescente, 0,4 μL de cada primer (10 pmol/l) e água destilada estéril.
   3. Realizar qPCR da seguinte forma: 2 min a 95 °C; seguido por 40 ciclos de 10 s a 95 °C, 30 s a 55 °C e 1 min a 72 °C.
   4. Use o gene actb (número de adesão do GenBank EU100952) e o gene tbb-2 (número de adesão do GenBank MT769316), ou outros genes, como genes de referência interna para avaliar as mudanças no nível de expressão genética após o RNAi¹⁵.
3. De acordo com o valor do limiar de ciclo (TC) e a curva de dissolução, use o método ^2-ΔΔCt para estimar o nível de expressão relativa do gene alvo e verificar a eficiência da interferência.
   1. Subtraia o valor ct do gene de referência interna de cada amostra a partir do valor ct do gene alvo para obter o valor ΔCt. Em seguida, subtraia o valor ΔCt do grupo de interferência do valor ΔCt do grupo de controle para obter o valor ΔΔCt.
      NOTA: Um valor ΔΔT maior que 0 indica que a interferência é eficaz.

5. Avalie o comprimento do corpo dos adultos nematoides seguindo rnai

1. Depois da RNAi, cultura as larvas J2 até a idade adulta em gramados B. cinerea em placas PDA por 60 h a 25 °C¹⁵.
2. Colete os adultos usando o método do funil Bellman (ver passo 1.1.2.1)¹⁴.
3. Adquira imagens dos nematoides adultos sob um microscópio e use o software ImageJ (ou outro software de medição) para medir os comprimentos do corpo.
   1. Meça o comprimento usando ImageJ selecionando Analisar | Definir escala. Se a distância for conhecida, digite o valor de comprimento da linha reta desenhada. Digite a unidade de comprimento.
   2. Verifique a caixa de seleção Global (use este padrão para todas as imagens) e clique em OK para selecionar o comprimento a ser medido com uma linha reta na imagem a ser medida.
   3. Use o comando Ctrl+M (medição) para exibir os resultados e gravá-los na janela de resultados .
4. Faça medições de 50 nematoides masculinos e 50 femininos para análise estatística¹².
5. Analise os dados calculando a média e o desvio padrão de cada amostra. Compare os meios das amostras dos diferentes grupos que utilizam o teste t do Aluno.

Resultados

Análise da expressão ppm-1 de B. xylophilus após RNAi
O nível de expressão relativa do gene ppm-1 de B. xylophilus encharcado com DSRNA GFP e que encharcado com gene alvo dsRNA foi de 0,92 e 0,52, respectivamente (o nível de expressão genética ppm-1 do grupo de controle tratado ddH₂O foi definido para 1) (Figura 1). Assim, o dsRNA exógeno n...

Discussão

Embora a história de vida e o ambiente parasitítico de B. xilophilus sejam diferentes dos de outros nematoides, tem havido pesquisas limitadas sobre a patogênese molecular deste patógeno vegetal. Apesar dos grandes avanços na aplicação da tecnologia de edição de genomas CRISPR/Cas9 em C. elegans e outros nematoides, apenas a tecnologia RNAi aplicada à B. xylophilus foi publicada até^{o momento 17}. A RNAi é uma das ferramentas mais poderosas disponíveis para es...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Baermann funnel	n/a	n/a	to isolate nematodes
Beacon Designer 7.9	Shanghai kangyusheng information technology co.	n/a	to design qPCR primers
Botrytis cinerea	n/a	n/a	as food for nematodes
Bursaphelenchus xylophilus	n/a	n/a	its number was NXY61 and was it was originally extracted from diseased Pinus massoniana in Ningbo, Zhejiang province, China.
constant temperature incubator	Shanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co.	H1703544	to cultur nematodes
Electrophoresis apparatus	Bio-Rad Laboratories	1704466	to achieve electrophoretic analysis
Ethanol, 75%	Sinopharm Chemical Reagent Co.	80176961	to extract RNA
Ex Taq Polymerase Premix	Takara Bio Inc.	RR030A	for PCR
Ex Taq Polymerase Premix	Takara Bio Inc.	RR390A	for PCR
Gel imager	LongGene Scientific Instruments Co.	LG2020	to make nucleic acid bands visible
GraphPad Prism 8	GraphPad Prism	n/a	to analyze the data and make figurs
High Speed Centrifuge	Hangzhou Allsheng Instruments Co.	AS0813000	centrifug
High-flux tissue grinder	Bertin		to extract RNA
ImageJ software	National Institutes of Health	n/a	to measure the body lengths
isopropyl alcohol	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.	L1909022	to extract RNA
Leica DM4B microscope	Leica Microsystems Inc.		to observe nematodes
magnetic beads	Aoran science technology co.	150010C	to extract RNA
MEGAscript T7 High Yield Transcription Kit	Thermo Fisher Scientific Inc.	AM1333	to synthesize dsRNA in vitro
NanoDrop ND-2000 spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific Inc.	NanoDrop 2000/2000C	to analyze the quality of the dsRNA
PCR Amplifier	Bio-Rad Life Medical Products Co.	1851148	to amplify nucleic acid sequence
Petri dishes	n/a	n/a	to cultur nematodes
pGEM-T Easy vector	Promega Corporation	A1360	for cloning
Potato Dextrose Agar (Medium)	n/a	n/a	to cultur Botrytis cinerea
Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser	Takara Bio Inc.	RR047B	to synthetic cDNA
Primer Premier 5.0	PREMIER Biosoft	n/a	to design PCR primers
primers:ppm-1-F/R	Tsingke Biotechnology Co.	n/a	F: 5'-GATGCGAAGTTGCCAATCATTCT -3'; R: 5'- CCAGATCCAGTCCACCATACACC -3
q-ppm-1-F/R	Tsingke Biotechnology Co.	n/a	F: 5'-CATCCGAATGGCAATACAG-3'; R: 5'-ACTATCCTCAGCGTTAGC-3'
Real-time thermal cycler qTOWER 2.2	Analytique Jena Instruments (Beijing) Co.		for qPCR
shaking table	Shanghai Zhicheng analytical instrument manufacturing co.		to soak nematodes
stereoscopic microscope	Chongqing Optec Instrument Co.	1814120	to observe nematodes
T7-GFP-F/R	Tsingke Biotechnology Co.	n/a	F: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAAA GGAGAAGAACTTTTCAC-3'; R: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGCTG TTACAAACTCAAGAAGG-3'
T7 promoter	Tsingke Biotechnology Co.	n/a	TAATACGACTCACTATAGGG
Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit	Takara Bio Inc.	9762	to recover DNA
TaKaRa TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)	Takara Bio Inc.	RR820A	for qPCR
trichloroethane	Shanghai LingFeng Chemical Reagent Co.		to extract RNA
TRIzol Reagent	Thermo Fisher Scientific Inc.	15596026	total RNA extraction reagent,to extract RNA