Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Av tüfeği kütle spektrometrisine dayalı lipidomikler, çeşitli kemirgen dokularından tek bir ölçümde aynı anda geniş bir lipit sınıfları spektrumunun hassas bir kantitatif görüntüsünü sunar.

Özet

Lipitler, tüm prokaryotik ve ökaryotik hücrelerin temel bileşenleri olarak hayati bir rol oynamaktadır. Kütle spektrometrisindeki sürekli teknolojik gelişmeler, lipidomikleri homeostatik ve hastalık durumlarında doku lipidom bileşimlerini izlemek için güçlü bir analitik araç haline getirmiştir. Bu yazıda, farklı doku ve biyoakışkan numunelerindeki birkaç yüz moleküler lipit türünün yüksek verimde eşzamanlı tespitini ve nicelleştirilmesini destekleyen bir av tüfeği lipit analiz yöntemi için adım adım bir protokol sunulmaktadır. Bu yöntem, kromatografik ayırma olmadan etiketli iç standartlarla çivilenmiş toplam lipit ekstraktının otomatik nano-akışlı doğrudan enjeksiyonunu yüksek çözünürlüklü bir kütle spektrometri cihazına enjekte eder. Kemirgen dokusunun mikrogram altı miktarlarından başlayarak, MS analizi numune başına 10 dakika sürer ve fare akciğer dokusundaki 14 lipit sınıfından 400'e kadar lipiti kapsar. Burada sunulan yöntem, hastalık mekanizmalarını incelemek ve kemirgen dokularında erken toksisiteyi veya faydalı etkileri gösteren biyobelirteçleri tanımlamak ve ölçmek için çok uygundur.

Giriş

Sigara dumanı (CS), pulmoner karsinom, bronşit ve kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH) dahil olmak üzere akciğerin kronik enflamatuar hastalıklarının gelişimi ile ilişkili ana risk faktörü olarak kabul edilmektedir1. Akciğer etkisinin ötesinde, CS maruziyeti aterosklerotik koroner arter hastalığı ve periferik vasküler hastalık1 gibi diğer hastalıkların gelişiminde önemli bir rol oynar. Kardiyovasküler hastalıklar, KOAH ile birlikte, dünya çapında sırasıyla birinci ve üçüncü önde gelen ölüm nedenleridir. Toksikolojik risk değerlendirme yaklaşımları tarihsel olarak kemirgenler gibi hayvan modellerinin kullanımına dayanmıştır. İn vivo sadece burun veya tam vücut sıçan ve fare modelleri, CS'ye maruz kalmanın uzun vadeli etkilerini incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır.

Örneğin, genel olarak, 6 aylık dumana maruz kalma, murin akciğerlerinde, amfizem, hava yolu yeniden şekillenmesi ve pulmoner hipertansiyon dahil olmak üzere insan hastalığınınkini taklit eden histolojik ve fonksiyonel anormalliklere neden olur, ancak değişiklikler uzun süreli insan sigara içenlerde gözlenenlere kıyasla nispeten hafiftir2. Hem hayvan hem de insan dokularında, çalışmalar oksidatif stres yanıtları, inflamasyon ve yapısal doku değişiklikleri de dahil olmak üzere CS maruziyetine yanıt olarak çok çeşitli moleküler değişiklikler gözlemlemiştir 3,4. Şaşırtıcı olmayan bir şekilde, CS maruziyetinin, sürfaktan lipitler, lipit sinyal aracıları ve yapısal lipitler üzerindeki etkiler de dahil olmak üzere akciğer lipidome üzerinde geniş kapsamlı bir etkiye sahip olduğu bildirilmiştir 4,5,6.

Fare akciğerlerinin uzun süreli CS maruziyetinin neden olduğu toplu lipit değişikliklerini karakterize etmek için, hızlı ve kantitatif bir av tüfeği doğrudan infüzyon kütle spektrometresi analizi gerçekleştirdik. Av tüfeği lipidomik yönteminin 2005yılında tanıtılmasından sonra 7, bu yöntem lipid hücresel metabolizması hakkındaki bilgimizi genişletmek için etkili bir şekilde kullanılmıştır 8,9,10 maya 11, Caenorhabditis elegans12 ve Drosophila melanogaster13 gibi model sistemlerde ve ayrıca hücre hatları 14 gibi çok çeşitli memeli örnek tiplerinde, 15,16 çeşitli insan17,18 ve kemirgen dokuları19,20 ve vücut sıvıları21,22.

Son yıllarda, çalışmalar birbirine bağlı binlerce protein, lipit ve metabolit içeren çevresel değişikliklere hücresel tepkilerin karmaşıklığını ortaya koymuştur. Bu, moleküler makinelerin derinlemesine bir görünümünü elde etmek ve eksojen fizyolojik etkilerin tam büyüklüğünü ortaya çıkarmak için en son analitik teknikleri kullanmanın gerekli olduğunu açıkça ortaya koymuştur. Bu bağlamda, av tüfeği lipidomik yaklaşımları ile üretilen kapsamlı, kantitatif lipid parmak izleri, lipid hücresel metabolizması 8,9,10 hakkındaki bilgilerimize etkili bir şekilde katkıda bulunabilir.

CS maruziyetini çeşitli hastalıklar için bir risk faktörü olarak ele alan toksikolojik risk değerlendirme yaklaşımları tarihsel olarak kemirgenler gibi hayvan modellerinin kullanımına dayanmıştır. Av tüfeği lipidomics MS, çok sayıda numune tipinde lipidom pertürbasyonunu değerlendirmek için hızlı, hassas ve kantitatif bir analitik araç sağlar. Av tüfeği lipidomiklerinin benzersiz özelliği, bir elektrosprey iyonizasyon (ESI) nanospray23 üreten iletken bir nanoçip kullanarak, yüksek çözünürlüklü bir MS cihazına kromatografik ayırma olmadan, etiketli iç standartlarla çivilenmiş toplam lipit ekstraktının otomatik doğrudan enjeksiyon analizidir.

MS1 modunda eşzamanlı olarak elde edilen kütle-yük oranı bilgisi, tüm bozulmamış endojen lipitlerin toplam lipit ayak izini sağlar. İsteğe bağlı olarak, ana lipit moleküllerinin parçalandığı ve analiz edildiği MS2/MS3 modu, ek yapısal bilgiler sağlar. Veri analizi, özel bir yazılım gerektirir ve lipit tanımlamasına ve varsayılan kimyasal yapı aydınlatmasına yol açan havuzlanmış spektrumlardaki spektrumların ve tepe atamalarının dekonvolüsyonunu içerir. Ek olarak, mutlak niceleme, ilgilenilen lipit sınıfı başına en az bir lipit standardı içeren etiketli bir iç standart karışımının yükseltilmesiyle gerçekleştirilebilir. Genel olarak, mevcut teknikle, numune başına birkaç dakika süren MS analizi, kemirgen dokularında 14 lipit sınıfı24'ten 800'e kadar lipitin tanımlanmasını ve nicelleştirilmesini kapsayabilir.

Protokol

Hayvanları içeren tüm prosedürler, Uluslararası Laboratuvar Hayvanları Bakımı Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği tarafından akredite edilmiş ve Singapur Tarım-Gıda ve Veterinerlik Otoritesi tarafından lisanslanmış bir tesiste, Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nin onayıyla ve Hayvanların Bilimsel Amaçlar İçin Bakımı ve Kullanımına İlişkin Laboratuvar Hayvanları Araştırma Kılavuzları Ulusal Danışma Komitesi (NACLAR, 2004).

1. Örnek toplama

  1. ApoE−/− farelere 3 ay ve 6 ay maruz kaldıktan sonra fare akciğer diseksiyonları yapın. Dokuları maruz kaldıktan 16-24 saat sonra toplayın, sıvı azotta dondurun ve lipidomik iş akışını başlatmadan önce -80 ° C'de saklayın. Her "omik" diseksiyon grubundan toplam dokuz numunenin toplanmasını sağlayın.

2. Doku - örneklerin pulverizasyonu

  1. Manyetik çekiç ve sarf malzemelerini doku taşlama için hazırlayın. Önceden soğutulmuş doku torbaları, forsepsler, kapaklı kapaklı doku transfer tüpleri, bir "V" plastik spatula ve kuru buz üzerinde 2 mL plastik toplama tüpleri. İlgili tüp tutucuyu manyetik çekiçli bir alete takın. Manyetik çekicin kilidini açın ve darbe gücünü Yüksek olarak ayarlayın.
  2. Numuneyi bir doku torbasına yükleyin; Gerekirse numuneyi önceden soğutulmuş forseps kullanarak doku torbasının üst açıklığından yerleştirin. Numuneyi esnek poşetin ortasına, kenarlardan uzağa yerleştirin.
  3. Doku torbasını, doku torbasının üstüne önceden soğutulmuş bir toplama tüpü vidalayarak kapatın.
  4. Esnek poşeti 10 sn boyunca sıvı azota batırarak numuneyi anında dondurun.
  5. Toplama tüpünü havalandırın; Manyetik çekiç çarptığında torbanın kırılmasını önlemek için havalandırma için tüpü 1/4 tur gevşetin.
  6. Dondurulmuş doku torbasını manyetik çekiç üzerine yükleyin.
  7. Numuneyi toz haline getirmek için etkinleştirme düğmesine basarak manyetik çekici uygulayın. Toz haline getirilmemiş doku parçaları kesede kalırsa, numuneyi tekrar sıvı azot içinde dondurun ve ikinci bir etki için tekrarlayın.
  8. Toz haline getirilmiş numuneyi altta tutarak doku torbasını manyetik çekiçten çıkarın. Numunenin erimesini önlemek için, derhal tekrar dondurun.
  9. Numuneyi bir toplama tüpüne aktarın. Doku torbası üstte olacak şekilde tüpü hızla ters çevirin ve doku parçacıklarını toplama tüpünün altına aktarmak için torbaya dokunun.
    NOT: Bu adım, dokunun erimesini önlemek için hızlı bir şekilde yapılmalıdır.
  10. Daha fazla lipidomik analiz için 10 mg'lık bir doku alikotunu 2 mL'lik bir tüpe aktarın ve numuneyi sonraki adımlar atılana kadar -80 ° C'de saklayın.

3. Doku homojenizasyonu

  1. Doku lizer cihazını açın ve sallama frekansını 30 Hz'e ve sallama süresini 2 dakikaya ayarlayın. Doku homojenizasyon tampon çözeltisini hazırlayın: Suda 150 mM amonyum bikarbonat, pH ~ 8.2 ile.
  2. Numuneleri depolama dondurucusundan çıkarın, buzun üzerine yerleştirin ve doku tozunu içeren tüplere dört paslanmaz çelik boncuk ekleyin. Her numuneye 0,5 mL 150 mM amonyum bikarbonat tamponu ekleyin.
  3. Numune tüplerini doku lizörü tutucularına yerleştirin. Her iki tutucuyu da aynı sayıda tüple dengeleyin. Tutucuları doku lizir tutma koluna sabitleyin. Dokuyu bozar.
  4. Tüpleri buzun üzerine yerleştirin ve tüpte artık doku agregası bulunmadığını görsel olarak kontrol edin. Doku bozulması eksikse (agregalar görülürse), başka bir tedavi döngüsü gerçekleştirerek bozulma işlemini tekrarlayın. Örnekleri buzun üzerine yerleştirin.
  5. Protein tayini için ayrılmış 1,5 mL'lik bir tüpte numunenin 100 μL'lik bir aliquot 1'ini oluşturun. 10 ° C'de 5 dakika boyunca 18.200 × g'da santrifüjleyin.
  6. Bradford testi ile aliquot 1'in protein içeriğini belirleyin (bkz. bölüm 4). Örnekleri buz üzerinde saklayın.
  7. Lipid ekstraksiyonu için yeni bir 2 mL mikrotüpte stok homojenatın 20-100 μL'lik bir aliquot 2'sini oluşturun (bkz. bölüm 5). Numuneler hemen analiz edilmezse, ekstraksiyon yapılana kadar buz üzerinde tutun.
    NOT: Nihai ekstraksiyon hacmi, toplam protein miktarına göre tanımlanmalıdır. Toplam alikot başına 0.015-0.045 mg protein aralığında olmalıdır.

4. Bradford protein belirleme testi

NOT: Çalışma örnekleri, analizin başlangıcından önce randomize edilmelidir ve randomizasyon, numune işlemenin tüm adımları için dikkate alınmalıdır.

  1. Santrifüjlü aliquot 1 süpernatant 2x'i amonyum bikarbonat tamponu ile seyreltin.
    NOT: Seyreltme faktörü, doku homojenatının konsantrasyonuna bağlıdır. Daha konsantre çözeltiler için, belirlenen konsantrasyonun tahlilin dinamik aralığına düşmesi için daha yüksek bir faktör uygulayın.
  2. Tablo 1'e göre bir sığır serum albümini (BSA) standart eğrisi hazırlayın. Standart tüpleri vorteks. Tüpleri oda sıcaklığında 15 sn boyunca 18.200 × g'da santrifüjleyin.
  3. Daha önce hazırlanmış standart tüplerden, boşluk ve standartların her biri 6 μL'yi, Şekil 1'de gösterilen plaka düzenine göre 96 delikli düz tabanlı bir plakaya aktarın.
  4. Daha önce hazırlanan numuneleri, Şekil 1'de açıklanan plaka düzenine göre 96 delikli düz tabanlı plakaya aktarın.
  5. Çok kanallı bir pipet kullanarak her bir kuyucuğa 250 μL Bradford Reaktifi ekleyin ve karıştırın. 5 dakika boyunca inkübe edin.
  6. Bir plaka okuyucu kullanarak absorbansı 595 nm dalga boyunda ölçün.
  7. Standart eğriye dayanarak alikotlardaki protein konsantrasyonlarını hesaplayın.
    NOT: Protein konsantrasyonları hesaplanırken prosedürün başında kullanılan seyreltme faktörü dikkate alınmalıdır.

5. BUME ekstraksiyonu

NOT: Lipidomik ekstraksiyon için düşük bağlanmış plastik tüplerin kullanılmasından kaçının, çünkü güçlü organik çözücüler plastikleştiricileri serbest bırakır ve numune analizi sırasında güçlü bir arka plan oluşturur.

  1. Toplam boş (TB), dahili standart boş (ISB) ve kalite kontrol numunelerinin (QC) her bir tüpünde 100 μL amonyum bikarbonat çözeltisi ile 1,5 mL tüpler hazırlayın, 10 numuneden oluşan her bir set arasına 1 QC numune yerleştirildiğini göz önünde bulundurun. Tüm örnekleri buz üzerinde tutun.
  2. Tüm QC örneklerine 10 μL havuzlanmış insan plazması ekleyin. Tüm ISB, QC ve çalışma örneklerine (yani, TB hariç tüm numunelere) 10 μL dahili standart çözelti spike yapın.
    NOT: Kalite kontrol malzemesi için, piyasada bulunan herhangi bir havuzlanmış K2EDTA plazmasını kullanın. Alındıktan sonra söz konusu protokolü kullanarak havuzlanmış plazmadaki lipit konsantrasyonunu ölçün ve bu aralıkları QC materyalinin kullanıldığı tüm analizler için referans olarak saklayın. NIST plazmayı yalnızca daha hedefli uygulamalar veya tahlilin doğruluğunun ele alınması gereken küresel yöntem doğrulaması için kullanın.
  3. Her numuneye 300 μL −20 °C bütanol/metanol karışımı (3/1, v/v) ekleyin. Termomikserde oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 450 × g'da çalkalayın.
  4. 300 μL heptan/etil asetat karışımı (3/1, v/v) ekleyin. Termomikserde oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 450 × g'da çalkalayın.
  5. 300 μL% 1 asetik asit karışımı ekleyin. Termomikserde oda sıcaklığında 450 × g'da 5 dakika çalkalayın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 2.800 × g'da santrifüj. Üst fazın 360 μL'sini yeni bir 2 mL kendinden kilitli tüp 2'ye aktarın.
    NOT: Sıvı-sıvı ekstraksiyonu, faz sınırının pozisyonlarının numuneye bağımlı bir şekilde değişmesine neden olabilir, bu da üst faz için hafif bir hacim tutarsızlığına neden olabilir. Gerekirse üst aşama için toplama hacmini ayarlayın.
  6. Su fazı tüpü 1'e 320 μL heptan/etil asetat (3/1, v/v) ekleyin. Termomikserde oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 450 × g'da çalkalayın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 2.800 × g'da santrifüj. Üst fazın 320 μL'sini aktarın ve adım 5.11'deki fraksiyonla birleştirin.
    NOT: Gerekirse üst aşama için toplama hacmini ayarlayın.
  7. Tüp 1'deki su fazına 250 μL heptan/etil asetat (3/1, v/v) ekleyin. Termomikserde oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 450 × g'da çalkalayın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 2.800 × g'da santrifüj. Üst fazın 200 μL'sini aktarın ve tüp 2'deki adım 5.11 ve adım 5.15'teki fraksiyonlarla birleştirin.
    NOT: Gerekirse üst aşama için toplama hacmini ayarlayın.
  8. Vakum konsantratörde 35 °C'de kuruluğa buharlaşır.
    NOT: Kurutulmuş numuneler, gerekirse analize kadar -20 °C'de saklanabilir.
  9. 300 μL MS karışım çözeltisi içinde yeniden çözün (izopropanol / metanol / kloroform içinde 7.5 mM amonyum asetat, 4: 2: 1 çözelti). Her şeyin çözülmesini sağlamak için her tüpü 5 s boyunca vorteks. 18.200 × g'da 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüj.
  10. Pozitif iyonizasyon modu analizi için Şekil 2'deki plaka düzenine göre mikrolitre plakaya 50 μL'lik bir aliquot aktarın (sütun 1-6) ve 50 μL MS karışım çözeltisi ile seyreltin.
  11. Negatif iyonizasyon modu analizi için Şekil 2'deki plaka düzenine göre MTP plakasına 20 μL'lik bir aliquot aktarın (sütun 7-12) ve 80 μL MS karışımı ile seyreltin. Plakayı folyo ile sarın ve analizden önce 4 ° C'de tutun.

6. MS analizi

  1. Bir kütle spektrometresini (MS), analizden 5 gün veya daha kısa bir süre önce üreticinin talimatlarına uygun olarak hem pozitif hem de negatif modlarda kalibre edin.
  2. Doğrudan infüzyon nano kaynağını önceden takın, MS'nin transfer kılcal damarına karşı düzgün bir şekilde hizalandığından emin olun. talaş tutucuya 4,1 μm'lik bir nozul çipi takın ve yazılımda yapılandırın.
  3. Pozitif ve negatif mod yöntem kurulumu için aşağıdaki parametreleri kullanın: 1.25 psi gaz basıncı; 1,1 kV kaynak voltajı; 5 μL numune enjeksiyon hacmi; 2,5 sn için çıkış kontağı kapatma Rel1; 5 dakikalık teslim süresi; 4 °C'de plaka soğutma.
  4. Doğrudan infüzyon robotu için analiz sırası kuyruğunu pozitif modda ayarlayın.
  5. Aşağıdaki MS ayarlarını kullanarak pozitif mod için MS yöntemini ayarlayın:
    1. Kılcal sıcaklığı 250 ° C'ye ve S-lens RF seviyesini 65.0 olarak ayarlayın. 1 ×106 otomatik kazanç kontrolü ve maksimum 50 ms enjeksiyon süresi ile 140.000 çözünürlükte 550-1000 m/z aralığında 0'dan 1 dakikaya kadar tam tarama MS alımı gerçekleştirin. 680.48022 kilit kütlesini uygulayın.
    2. Veriden bağımsız MS/MS toplama yöntemini, 250 m/z'lik sabit bir ilk kütle ile 17.500 çözünürlükte 1 ila 5 dakikalık zaman aralığı arasında ayarlayın. MS2 için 1 × 105'te otomatik bir kazanç denetimi ve 64 ms'lik maksimum enjeksiyon süresi, 20 NCE çarpışma enerjisi ve 1 m/z yalıtım penceresi kullanın. 550 ila 1.000 m/z arasındaki dahil etme kütle listesini, kütle adımı 1 Da'dır.
  6. Negatif modda elde etmek için, MS ayar dosyasında kılcal sıcaklığı 250 ° C'ye ve S-Lens RF seviyesini 65.0 olarak ayarlayın.
    1. Aşağıdaki MS yöntemi ayarlarını kullanın: 400-940 m/z aralığını kapsayan 140.000 çözünürlükte 0'dan 1 dakikaya kadar tam tarama alma modu, 1 × 106'nın otomatik kazanç kontrolü; maksimum enjeksiyon süresi 50 ms; 529.46262 kilit kütlesi kullanın.
    2. DIA modunda MS2 alımını, 150 m/z'lik sabit bir ilk kütle ile 17.500 çözünürlükte çalışmanın 1 ila 5 dakikası arasında ayarlayın; 1 × 105'in otomatik kazanç kontrolü; 64 ms maksimum enjeksiyon süresi; ve çarpışma enerjisinin 35NCE'si. 400'den 940'a kadar olan dahil etme kütle listesini 1 Da'lık bir kütle adımıyla kullanın.
  7. Analiz sırası kuyruğunu MS yazılımında pozitif modda oluşturun. Numune alımının, her numune için doğrudan infüzyon robotundan gelen bir kontak kapatma sinyali tarafından tetiklenmesini bekleyin.
  8. Pozitif mod analizi tamamlandığında, negatif modda doğrudan infüzyon robotu için sıra kuyruğu oluşturun.
  9. MS yazılımında analiz sırası kuyruğunu negatif modda ayarlayın.

7. Veri işleme

  1. Veri dosyalarını pozitif ve negatif modlardan .raw biçiminden .mzML biçimine dönüştürmek için dönüştürücü yazılımını kullanın.
    NOT: Pozitif ve negatif modlardaki veri dosyaları ayrı ayrı dönüştürülmelidir (farklı alım ayarları ve farklı gürültü eşiği nedeniyle).
    1. Dosya dönüştürme gerçekleştirmek için aşağıdaki ayarları doldurun: gürültü eşik faktörü MS ve MS2 için sırasıyla 3 ve 5'tir; hem MS hem de MS2, veri sıkıştırma, ortalama MS2 taramaları ve tepe toplama için gürültü giderme işlevini etkinleştirin. Pozitif ve negatif modlar için TIC eşikleri ayarlayın (örneğin, 10.000 ve 5.000; belirli bir cihaz tarafından üretilen belirli bir numunenin gürültü seviyesine göre tanımlanacaktır). İşlemin sonunda XLC ve PDF raporları oluşturun.
  2. Lipit tanımlamasını gerçekleştirin. Aşağıdaki (örnek) dosya içe aktarma ayarları parametrelerini tanımlayın: seçim penceresi ±0,5 Da (MS yöntemindeki seçim penceresine bağlıdır); zaman aralığı 2-300 s (MS yöntemindeki tarama süresine bağlıdır); MS ve MS2 için kalibrasyon kütlesi yok; Peak by Peak yazılım meta veri dosyalarından kütle aralığını (minimum kütle [MS]) ve (min kütle [MS2]) aktarmak ve yuvarlamak; MS ve MS2 için sırasıyla 3 ppm ve 10 ppm tolerans; MS ve MS2 eşik alanını, frekans filtresini, MS1 uzaklığını ve PMO'yu boş tutun; MS ve MS2 için izotopik düzeltme seçildi; dönüştürücü meta veri dosyasından çözünürlük gradyanını (Çözünürlük doğrusal uyumu [MS]) ve (Çözünürlük doğrusal uyumu [MS2]) olarak aktarın.
    NOT: Pozitif ve negatif modlarda lipit tanımlaması, farklı edinme ayarları nedeniyle ayrı ayrı yapılmalıdır.
  3. Veriler içe aktarıldıktan sonra, Çalıştır menüsüne gidin ve lipit tanımlaması için MFQL dosyalarını yükleyin.
    NOT: MFQL'lerin yapısı hakkında ayrıntılı bilgi için, Herzog ve ark.25'in yayınına bakın. MFQL dosyalarının bazı örneklerini https://wiki.mpi-cbg.de/lipidx/MFQL_library bakın ve tartışmaya bakın. Veri işleme için kullanılan tüm MFQL'ler Ek Materyallerde sağlanmaktadır.
  4. Tanımlanan türleri, lipit özelliğinin öncü kütle yoğunluğunu, etiketli iç standardın ilgili yoğunluğuna bölerek ve daha sonra bölümü, etiketli iç standardın konsantrasyonu ile çarparak MS düzeyinde sayısallaştırın. Bradford testi ile ölçülen toplam protein miktarı başına nihai lipit konsantrasyonunu normalleştirin.

8. QC kontrol prosedürü

NOT: Kalite kontrol prosedürü, yöntemin teknik tekrarlanabilirliğini doğrulamak için önemli bir adımdır. Bu amaçla, ticari olarak havuzlanmış bir plazma, parti başına 15 özdeş alikotta (toplam beş parti) 5 gün boyunca farklı lipitlerin endojen seviyelerini belirlemek için analiz edilir. Bu durumda, R istatistiksel yazılım ortamı kullanılarak Parlak bir web uygulaması olarak bir veri değerlendirme işlem hattı oluşturulduğunu unutmayın.

  1. Referans kabul aralığını, beş partinin tümü için hesaplanan ortalama değer olarak tanımlayın ±3 standart sapma.
  2. Her analitik parti için "başarılı" kabul kurallarını uygulayın: Bir referans bileşiğinin bir lipit sınıfını temsil ettiği göz önüne alındığında, referans hedeflerin% 90'ı geçmelidir. Örneğin, QC doğrulamasına 15 referans hedefi dahil edilmişse, toplu işin kabul edilmesi için 13 hedefin geçtiğinden emin olun.
    NOT: Başka bir deyişle, referans bileşik başına QC numunelerinin% 68'i, bu lipit sınıfının verilerinin kabul edilmesi için geçmelidir.
  3. Etüt partisi QC kontrolü için kabul kriterlerini karşılamıyorsa, prosedürü tekrarlayın.

9. (Göreceli) konjuge yağ asidi miktarlarının tahmini

  1. Her lipit sınıfı için, MS2 yoğunluklarına göre konjuge yağ asitlerinin miktarlarını tahmin edin.
    NOT: Parçalanma ve iyonizasyon farklılıkları nedeniyle, türetilen değerler, örneğin, belirli bir yağ asidinin bir lipit sınıfının genel konjuge yağ asidi havuzuna göreceli katkısını tahmin etmek yerine, yalnızca numune grupları arasında göreceli bolluk karşılaştırmaları içindir.
  2. Yağ asidi parçalarının MS2 yoğunluklarını, karşılık gelen iç standardın yağ asidi parçalarının ortalama yoğunluğu ile normalleştirin. İç standardın konsantrasyonuna ve ölçülen doku ağırlığına dayanarak, konjuge yağ asitleri için "normalleştirilmiş bir konsantrasyon" elde edin. Numune başına her bir konjuge yağ asidinin toplam miktarını tahmin etmek için lipit sınıfı başına bu değerleri toplayın.

10. İstatistiksel analiz

  1. İstatistiksel analiz yapın. Her koşul ve ilgili kontrol grubu için doğrusal bir model takın ve log2 dönüştürülmüş veriler için bir t-istatistiğinden p değerlerini hesaplayın. Birden çok test etkisini düzeltmek için Benjamini-Hochberg yanlış keşif oranı yöntemini kullanın.
    NOT: P değerleri 0,05 < ayarlanmış lipitler farklı olarak bol kabul edilir. Burada R istatistik ortamında istatistiksel analiz yapılmıştır26.

Sonuçlar

Burada, temsili sonuçlar olarak, CS'nin farelerin akciğerleri üzerindeki etkilerini incelemek için av tüfeği lipidomiklerinin nasıl kullanılabileceğini gösteren veriler sunuyoruz. Av tüfeği lipid analizi protokolü, iki grup numunenin karşılaştırmalı analizi için in vivo bir çalışma için başarıyla uygulanmıştır: CS'ye maruz kalan dokuz dişi Apoe-/- fareden diseke edilen akciğer dokuları (3R4F grubu; pozitif kontrol) ve temiz hava koşullarında tutulan eşit sayıda fare (sahte grup) 3 ayda toplanan negatif kontrol olarak, 4 ay ve 6 ay maruz kalma zaman noktaları. Hayvanlar 22 °C ± 2 °C sıcaklıkta ve %55 ± %15 nemde filtrelenmiş ve şartlandırılmış temiz hava altında tutuldu ve gama ışınlı pelet diyeti ile beslendi. Işık rejimi günde 12 saatte tutuldu. Her kafes başına sekiz adede kadar fare yerleştirildi. Phillips ve ark.27'ye göre, 28 μg nikotin / L'ye eşdeğer bir hedef maruz kalma konsantrasyonu için 3R4F CS aerosolünü (600 μg toplam partikül madde TPM / L aerosolü) üretmek üzere Kentucky Üniversitesi'nden maruz kalma tedavisi için 3R4F referans sigaraları satın alındı .CS 3R4F sigaralarından elde edilen duman, 30 portlu döner sigara makineleri kullanılarak üretildi.27 . Health Canada Yoğun Sigara İçme Protokolü'ne dayanarak, yeterli maruziyeti sağlamak için 3R4F sigaralara 55 mL puf hacmi, 30 saniyede bir puf ve havalandırma deliklerinin% 100 tıkanması uygulanmıştır. Çalışma tasarımı ile ilgili tüm ek detaylar daha önce27,28 olarak bildirilmiştir.

Genel olarak, en bol bulunan 14 lipit sınıfından ~ 400 moleküler lipit türü tanımlanmış ve nicelleştirilmiştir (Şekil 3). Sınıf başına toplam normalleştirilmiş lipid konsantrasyonu PE, PEO, PC, PCO, PI ve PG lipid sınıfları için biraz yükselmiş ve SM, LPE ve PA lipitleri için bazı downregülasyon gözlenmiştir (Şekil 3A), TAG'ler ve PS için hiçbir fark görülmemiştir. . Plazmalojen lipitlerin hücre içi fonksiyonlarından biri antioksidan aktivitedir. Reaktif oksijen (ROS) ve azot türlerine (RNS) maruz kalma durumunda, diasil fosfolipitlere kıyasla plazmalojenlerin seçici oksidasyonu bildirilmiştir30. Plazmalojenlerin kimyasal yapısındaki enil-eter bağı, oksidatif strese karşı radikal saldırılara duyarlıdır31. Radikal saldırının başlıca ürünleri hidroksillenmiş eikosatetraenoik asitler, 2-monoasilgliserol fosfolipitler, pentadekanol, formik asitler, çeşitli zincir uzunluklarında α-hidroksiyaldehitler, 1-formil-2-arakidonoyl gliserofosfolipid ve lizofosfolipidlerdir.

Bu sonuçlar, toplam moleküler formüle dayanan moleküler özellikler arasında, 100-120 bileşiğin CS maruziyetinden önemli ölçüde etkilendiğini göstermektedir (Şekil 3D). MS2 parçalanma bilgisinin ayrıntılı dekonvolüsyonu ve fragman sinyal yoğunluklarının normalleştirilmesi, her lipit sınıfında temsil edilen her bir konjuge yağ asidinin (FA) toplam miktarının yaklaşık olarak tanımlanmasına (Şekil 3E) ve bu verilerin maruz kalan ve kontrol grupları arasında karşılaştırılmasına izin verdi. Hem tamamen doymuş FA'larda hem de çoğunlukla lizo-lipitler bağlamında sadece birkaç doymamış FA'da belirgin bir azalma gözlenmiştir. Buna karşılık, PC, PE ve PG fosfolipid sınıflarının bileşimindeki çoklu doymamış yağ asitleri (PUFA), CS grubunda tüm zaman noktaları için yükselmiştir. Eikosapentanoik (EPA) ve dokosaheksaenoik asit (DHA) ile konjuge edilmiş aşırı PC ve PG vakaları sadece 3R4F CS maruziyet grubunda tespit edildi (Şekil 3E, kırmızı renk).

figure-results-3881
Şekil 1: Bradford testinde numune dağılımı için plaka düzeni. Boş ve standart numuneler 1-3 numaralı sütunlarda üçlü olarak yerleştirilir; Bilinmeyen örnekler 4-11 numaralı sütunlarda çoğaltılarak yerleştirilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4463
Şekil 2: Av tüfeği kütle spektrometrisi analizi için 96 delikli mikrotitre plakasının plaka düzeni. Pozitif iyonizasyon modunda elde edilmek üzere boş, standart, bilinmeyen ve QC numunelerinin dağılımı plakanın sol tarafında haritalanır (sütun 1-6); Negatif iyonizasyon modu için tüm numuneler sağa yerleştirilir (sütun 7-12). Kısaltmalar: pos = pozitif; QC = kalite kontrol; neg = negatif; TB = toplam boş. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5241
Şekil 3: Sigara dumanına maruz kalan fare akciğerlerinin av tüfeği lipidomik analizi. Apoe − / - fareler 3R4F referans sigara veya temiz havadan (sahte) CS'ye maruz bırakıldı. (A) Lipid sınıfı konsantrasyonları ve sınıf başına düşen lipit türlerinin sayısı. Her sınıf için, nicelleştirilmiş lipit türlerinin sayısı parantez içinde verilmiştir. Her lipit sınıfı için ortalama ve% 95 güven aralıkları, her maruz kalma türü için ayrı ayrı (üç zaman noktasında toplanır). (B) 3R4F CS için nicelleştirilmiş lipit türlerinin etki boyutunu (log2 kat değişimi) ve önemini (-log10 FDR-düzeltilmiş p değeri) gösteren volkan grafikleri, üç zaman noktasında sahte karşılaştırmaya karşı. Önemli ölçüde yükselmiş lipitler sarı renkle işaretlenir; önemli ölçüde azalmış lipitler camgöbeği ile işaretlenmiştir (FDR ayarlı p değeri < 0.05). (C) En büyük mutlak ortalama kıvrım değişimine sahip 25 lipit türünün diferansiyel bolluğu. 3R4F CS ve sahte karşılaştırma için Log2 kat değişiklikleri renk kodludur ve istatistiksel anlamlılık belirtilir: *: FDR ayarlı p değeri < 0,01; X: FDR ayarlı p değeri 0,05 <. (D) Karşılaştırma grafikleri. Katlama değişimi karşılaştırmaları için korelasyon katsayıları renk kodludur ve paylaşılan diferansiyel olarak bol lipitlerin sayısı belirtilir (kenar boşluklarındaki toplam sayılar). Pasta grafikler, aynı değişim yönüne (FC işareti) sahip paylaşılan farklı şekilde bol lipitlerin yüzdesini gösterir. Yıldız işareti, farklı şekilde bol miktarda bulunan lipitlerin önemli bir örtüşmesini gösterir. (E) Lipid sınıfı başına konjuge FA'ların diferansiyel bolluğu. Her üç zaman noktasında da 3R4F ve sahte maruziyet arasında önemli bolluk farklılıkları olan konjuge yağ asitleri için panel C'deki gibi ısı haritası (FDR ayarlı p değeri < 0.05). Lipid sınıfı başına her yağ asidinin miktarı, yağ asidi fragmanlarının MS2 yoğunluklarına dayanarak tahmin edildi. Kısaltmalar: CS = sigara dumanı; FDR = yanlış keşif oranı; FC = kat değişimi; FA = yağ asitleri; PC = fosfatidilkolin; PS = fosfatidilserin; TAG = triasilgliserol; SM = sfingomiyelin; PEO = plazmalojen fosfatidiletanolamin; PE = fosfatidiletanolamin; PG = fosfatidil gliserol; PI = fosfatidilinositol; DAG = diasilgliserol; SE = sterol / kolesteril esterler; PCO = plazmalojen fosfatidilkolin; LPC = lizo fosfatidilkolin; LPE = liso fosfatidiletanolamin; PA = fosfatidik asit. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

BSA nihai konsantrasyonu (mg/mL)2 mg/mL'de (μL) BSA çözeltisiAmonyum bikarbonat tamponu (μL)
15050
0.7537.562.5
0.52575
0.2512.587.5
0.12512.5187.5
0.062550 0.125 mg/mL çözelti50
00100

Tablo 1: Bradford testi için kalibrasyon eğrisi için BSA iç standardının seyreltme şeması. Kısaltma: BSA = sığır serum albümini.

Ek Bilgiler: LipidXplorer lipid tanımlaması için kullanılan MFQL dosyaları. .zip paketi, her biri şu kalıbı izleyerek adlandırılan, gerekli MFQL dosyalarından oluşur: __MS2.mfql (örneğin, PE_neg_MS2.mfql). Etiketli dahili standart tanımlama için dosya adları, ndaki D7(D9) etiketini içerir (örneğin, PED7_neg_MS2.mfql). Bu MFQL dosyaları, dahili standarttaki döteryum miktarını doğrulamak için kullanılır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışmalar

MS'deki ilerlemeler birçok lipit türünü doğru bir şekilde izlemek için çeşitli yöntemler sunmuş olsa da, çeşitli memeli dokularının önceki lipit profillemesi tutarlı sonuçlar göstermemiştir ve sonuç olarak, lipitlerin belirli dokuya özgü fonksiyonları belirsizliğini korumaktadır. Belirli bileşiklerin ekspresyonunu ortadan kaldırmak için daha sağlam yaklaşımların mevcut olduğu protein fonksiyonel analizi ile karşılaştırıldığında, lipitlerin çoğunluğu dokularda seçici olarak kapatılamaz veya aşırı eksprese edilemez, bu da lipitlerin fonksiyonel değerlendirmesini zorlaştırır. Doku lipidom konsantrasyonlarının gelişmiş profillemesi, dolaşımdaki lipitler ve insan hastalıkları arasındaki ilişkileri tanımlamak için alternatif bir yaklaşım sağlayabilir.

Herhangi bir fare dokusunun endojen lipid profilini kalitatif ve kantitatif olarak kapsayabilen kapsamlı lipidomik yöntemleri değerlendirirken, av tüfeği lipidomik yöntemini tercih ettik. Genel olarak, iki zıt numune analizi türü mümkündür: ya numunenin toplam lipit karmaşıklığını ortaya çıkarmak için daha fazla kütle spektrometrik tespiti ile sıvı kromatografisi (LC) bazlı ayırma kullanılarak lipitlerin tamamen hedefsiz bir şekilde taranması ya da çoğunlukla ilgilenilen spesifik lipitlerin çok hassas bir şekilde ölçülmesine izin veren hedefli yaklaşımlar. Buna karşılık, sunulan av tüfeği lipidomik iş akışının güçlü özelliği, önceden tanımlanmış lipit sınıflarından yüzlerce endojen lipitin hızlı ve kapsamlı bir şekilde kapsanmasıdır ve bunlar hala sağlam bir yarı kantitatif şekilde gerçekleştirilebilir.

Farklı lipit sınıflarının iyonizasyon verimlilikleri yapıya bağlıdır ve farklı deneysel iyonizasyon koşullarına bağlı olarak büyük ölçüde değişebilir. LC bazlı ayırma yöntemlerinin aksine, av tüfeği analizi, tüm lipit ekstraktının aynı iyonizasyon koşulları altında MS cihazına doğrudan eşzamanlı infüzyonu nedeniyle bu farklılıkları en aza indirir. İzotopik olarak etiketlenmiş lipit analoglarının veya yapısal olarak benzer endojen olmayan standartların kullanılması, tüm lipit sınıflarının yarı nicelleştirilmesine izin verir. Av tüfeği lipidomikleri, MS analizi sırasında düşük inter- ve intra-run değişkenliği sağlar; Sonuç olarak, bu yöntem, yeterli niceleme için birden fazla standart gerektiren hedeflenmemiş sıvı kromatografisi tabanlı yöntemlerden daha düşük varyasyon21 katsayıları üretir. Önemli olarak, mevcut yöntemde harici kalibrasyon eğrisi kullanılmamasına rağmen, yöntem hala tamamen nicel olarak kabul edilir32.

Lipit sınıfı başına bir etiketli iç standart seviyesi (veya endojen olarak ifade edilmeyen etiketsiz standart), çoğu lipitin nicelleştirilmesi için yeterlidir. Sadece birkaç yayın, bir av tüfeği lipidomik yöntemi için kısmi bir yöntem doğrulaması bildirmiştir. Örneğin, Gryzbek ve ark.17 ve Surma ve ark.21'de, ters kalibrasyon eğrileri iç standartlar ve sabit miktarda numune matrisi kullanılarak hazırlanmıştır. Doğrusallık, log-transforme lipid miktarlarının lineer regresyonu ve yoğunlukları ile değerlendirildi ve sırasıyla R2 ve eğim olarak rapor edildi. Algılama sınırı (LOD) ve nicelleştirme sınırı (LOQ), LOD için 3 ve LOQ için 10 sinyal-gürültü oranına dayanan ağırlıklı doğrusal regresyon ile belirlendi. Çoğu lipid sınıfı için LOQ, yağ dokusu için 2-9.8 pmol ve plazmada 0.05-5μM arasında tanımlandı. Her iki durumda da, sınıftaki tüm lipitler için tahminler elde etmek için sınıf başına endojen olmayan tek iç standartlar kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu çalışmada, çeşitli endişeler nedeniyle LOD / LOQ sağlamıyoruz: endojen matris bileşik içermez ve dokular için vekil matris mevcut değildir - bununla birlikte, bilinen az miktarda standardın yükselmesi mümkün değildir. Saf standartların yokluğu ve izotopik olarak etiketlenmiş lipitlerin çok sınırlı mevcudiyeti nedeniyle aynı izotopik olarak etiketlenmiş standardı ile normalize edilmiş belirli bir bileşiğin kalibrasyon eğrisi serisinin kullanılmasıyla klasik hedefli bir niceleme yaklaşımı gerçekleştirmiyoruz. Orbitrap dedektörleri, bir Fourier dönüşümü uygulayarak geçici sinyalin dönüşümünü otomatik olarak gerçekleştirir ve bazı sinyaller zaten değiştirilmiştir - sonuç olarak, düşük konsantrasyon aralığı sadece molekülün artık tespit edilemeyeceği bir minimum sinyale kadar doğrusal olacaktır. Xcalibur yazılımı sinyal-gürültü değerleri, molekülün m/z oranına bağlıdır; Sonuç olarak, farklı yağ asitleri kombinasyonları içeren her lipit sınıfının bileşikleri farklı gürültü değerlerine sahip olacaktır. Ayrıca, LOQ / LOQ değerleri kesinlikle matris tipine bağlıdır ve lipidomun niceliği farklı kemirgen dokularında yapıldığında, her doku tipi için ayrı ayrı LOQ'ların değerlendirilmesiyle yansıtılmalıdır.

Aslında, yöntem,33 büyüklüğünde dört mertebeye kadar yüksek doğrusal dinamik niceleme aralığı ve MS edinimi32'deki teknik gelişmelerle daha da artırılabilen en önemli endojen yapısal lipitleri kapsayacak şekilde çok iyi bir hassasiyet sunar. Ortalama lipid konsantrasyonlarının varyasyon katsayıları çoğunlukla% 15'in altındaydı, yani av tüfeği lipidomiklerinin iyi laboratuvar uygulamaları (GLP) ve iyi klinik uygulama (GCLP) çalışmaları için dikkate alınması gereken bir yöntem olarak Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) gerekliliklerine uygun olduğu anlamına geliyor34.

Bununla birlikte, farklı polariteleri nedeniyle, bazı lipit sınıflarının spesifik konjuge FA'ların katkısından çok daha fazla etkilendiği belirtilmelidir. Bu, çok çeşitli konjuge FA'lar içeren eşamolar karışımlarda yoğunluk tepkisinde bozulmaya yol açar, bu da fosfolipid sınıfları için Koivusalo ve ark.35 tarafından vurgulandığı gibi nicelleştirme yanlılığına neden olur. Not olarak, bu yazarlar, muhtemelen gerçek bir biyolojik numunedeki durumu yansıtmayan 24-48 zincir uzunluğundan çok çeşitli FA'lar için veri sundular. Çoklu doymamış türler için yanıt, tamamen doymuş türlere göre% 40 daha yüksekti, ancak bu etki sadece daha yüksek konsantrasyonlar için gözlendi. Karışım aşamalı olarak seyreltildiğinde, doymamışlığın etkisi yavaş yavaş azaldı ve tür başına 0.1 pmol / μL'de neredeyse ortadan kayboldu. Ek olarak, tüm ölçümler Q-Exactive ekipmanı üzerinde değil, iyon tuzağı ve üçlü dörtlü kutup cihazları üzerinde yapıldı.

Sunulan iş akışının bir diğer avantajı, belirli proje gereksinimlerine adaptasyona izin veren teknik esnekliğidir. Örneğin, modifiye Bligh ve Dyer36, metil tert-bütil eter 37 veya bütanol-metanol38 yöntemleri gibi herhangi bir lipit ekstraksiyon protokolü, MS analizinden önce toplam lipit ekstraktı hazırlamak için kullanılabilir. Kloroform-metanol ekstraksiyonunun ana sınırlaması, alt fazın rutin işleri ve özellikle otomasyonu zorlaştıran lipit fraksiyonunu içermesidir; Ek olarak, kloroformun toksisitesi de dikkate alınmalıdır. Tert-bütil eter ekstraksiyonu, plazma örneklerinin lipit analizi için yaygın olarak kullanılmaktadır37 ve otomatik bir versiyon önerilmiştir21. Bu durumda, BUME yöntemini seçtik, çünkü çivili PG, PI, PA ve PS lipit sınıfları38 için daha iyi geri kazanımlar, daha düşük çözücü tüketimi ve otomasyon olasılığı39 sağlarken, her üç yöntemle ekstrakte edilen doku örnekleri için ölçülen genel konsantrasyonlar karşılaştırılabilirdi. Ek olarak, mevcut çalışmada numune ekstraksiyonu manuel olarak gerçekleştirilirken, 96 delikli bir formatta40,41 otomatik numune hazırlama ve lipit ekstraksiyonu ile büyük numune setlerinden tekrarlanabilir ve kesin sonuçlar elde etmek de mümkündür. Bu, büyük ölçekli klinik ve toksikolojik çalışmalarda lipidomik analizin uygulanmasına izin verir.

Mevcut çalışmada, Schuhmann ve ark.42 tarafından tanımlandığı gibi polarite değişimi olmadan pozitif ve negatif modların MS edinimini ayrı ayrı gerçekleştirdik. Nanomat sinyalinin kararlılığı, pozitif moddan biraz daha az konsantre bir çözelti için negatif modda daha iyidir. Ek olarak, LipidXplorer yazılımında belirtilecek değerleri sağlayan .raw dosyalarından mzML'ye dönüştürücü yazılımı ile tamamen izlenebilir bir prosedür geliştirdik - bununla manuel çözünürlük eğim hesaplamaları gerekli değildir. Ayrıca farklı gürültü ayarı ikameleri uyguladık, çünkü pozitif modda, spektrumların gürültü seviyeleri negatif moddan daha yüksektir. Tüm adımlar izlenebilir, yüksek verimli rutin analizler için optimize edildi.

Tanımlama için, av tüfeği lipidomik analizi, farklı polarite modlarında benzersiz addüktler oluşturan farklı lipit sınıflarının benzersiz davranışlarından yararlanabilir. Bu yöntemde, pozitif iyonizasyon modunda örtüşen aynı moleküler kütleye sahip PC ve PE türleri, PC'nin asetat veya format katkıları oluşturması ve PE'nin deprotonlanmış bir formda iyonize olması nedeniyle negatif iyonizasyon modunda tamamen ayrılabilir. Ayrıca, (kısmi) yapısal dekonvolüzyon sadece moleküler formülü değil, aynı zamanda kütle yağ asidi yapısını da kullanan yöntem için mümkündür. Örneğin, toplam karbon ve toplam doymamışlık sayısı seviyesindeki FA tanımlaması, tüm fosfolipitler, DAG'ler, TAG'ler ve lizo-fosfolipitler için çalışır. Her izomerik formun aşağıdan yukarıya nicelleştirilmesi, fosfolipid sınıfları43'ün bazıları için kısmen gerçekleştirilebilir, ancak MS2 spektrumlarındaki farklı FA'ların eşit olmayan sinyal tepkisi nedeniyle DAG'ler ve TAG'ler için çok daha karmaşıktır.

Ayrıca, bu alandaki son girişimlerle tamamen uyumlu olan uygun kalite kontrol prosedürlerinin uygulanması ihtiyacını vurgulamak da önemlidir44. Laboratuvar arasında ve içinde uygun veri izlenebilirliğini ve tekrarlanabilirliğini sağlamak istediğimiz için, analizin tüm adımları için numunelerin uygun şekilde randomize edilmesi, tedarikçi onaylı standart karışımlarla çalışma, kalite kontrol numunelerinin dahil edilmesi, parti kabulünü veya reddini doğrulama prosedürleri ve uzun vadede QC performansını izlemek için dahili bir veri tabanının oluşturulması gibi bir dizi adım atılmıştır. Bu girişimlerle tutarlı olarak, numune stabilitesini ele almak için standartlaştırılmış bir yönteme duyulan ihtiyaç da vardır. Genel olarak, yapısal lipitlerin çoğunluğu, oksilinler, oksitlenmiş lipitler ve çoklu doymamış yağ asitleri için daha uygun olan lipit oksidasyonundan etkilenmez, bu nedenle depolama ve taşıma koşullarına çok daha duyarlıdır. Bununla birlikte, numune stabilitesinin doğru değerlendirilmesi hala teknik olarak zorlu bir görevdir.

Bununla birlikte, bu protokolün, bileşiklerin submoleküler seviyelerinin belirlenmesi söz konusu olduğunda bir sınırlaması vardır. Toplam ekstraktın ayrılmadığı göz önüne alındığında, aynı moleküler kütleye ancak farklı yağ asidi bileşimlerine sahip lipitlerin tüm izoformları MS analizinde birleştirilir. Çoğu sınıf için, MS2'deki artık yağ asidi parçalarının parçalanma oranlarını kullanarak yapının kısmi dekonvolüsyonunu elde etmek mümkündür. Bununla birlikte, her izoformun bağımsız nicelleştirilmesi, farklı izoformların parçalanma davranışlarındaki büyük farklılıklar ve saf kimyasal standartların kompanzasyon değerlerini tanımlamak için yeterince geniş çeşitlilikte mevcut olmaması nedeniyle özellikle zorlu bir görev olmaya devam etmektedir. Diğer bir sınırlama, ESI sürecinin kaçınılmaz olarak artefaktlar üretmesi ve bunun sonucunda DAG'ler, Pas ve FA'lar gibi bazı lipitler için yapay zirve oluşumuna neden olması ve bu da hatalı nicelleştirmeye yol açabilmesidir.

Daha sonra, protokolün en kritik kısımlarını deneyimlerimize dayanarak özetliyoruz. Birincisi, her fare doku tipinin hem lipit miktarı hem de sınıf oranları açısından benzersiz bir lipit profiline sahip olmasıyla ilgilidir. Bununla birlikte, ekstraksiyondan önce toplam protein içeriğine dayanan dokunun başlangıç miktarları, MS sinyalini doyurmamak ve yüksek konsantrasyonlarda lipit agregasyonu nedeniyle dinamik niceleme aralığını terk etmemek için dikkatlice belirlenmelidir33 veya - karşı uçta - her lipit sınıfı için ana lipit bileşiklerini kapsayacak kadar MS sinyali sağlamak için.

İkinci kritik husus, doğrudan infüzyon nano kaynaklı çip çıkışının konumunun, kütle spektrometresinin transfer kılcal damarı ile uygun bir şekilde hizalanmasını sağlamaktır. Her iki modda da kütle spektrometresinin tam kalibrasyonunun haftalık olarak yapıldığı göz önüne alındığında, kalibrasyon kaynağı ile nano kaynaklı çip kurulumu arasında geçiş yapmak, kurulum sırasında yanlış hizalama nedeniyle sinyal yoğunluğundaki dramatik değişkenliğin nedeni olabilir.

Protokolün bir diğer kritik kısmı, dahili standart karışımın dikkatli bir şekilde kullanılmasıdır. Bu karışım önemli miktarda diklorometan içerdiğinden, açıldıktan sonra, uzun süre depolamaktan ve buharlaşmaya ve yapay konsantrasyon değişikliğine yol açan çoklu kullanımlardan kaçınmak için hızlı bir şekilde tüketilmelidir. Ayrıca, sıcaklık farklılıkları hava yastığı pipetleriyle pipetleme sırasında hacim tutarsızlıklarına yol açabileceğinden, −20 °C depolamadan çıkarıldıktan sonra standart karışımın tutarlı bir şekilde kullanılması önemlidir. Bir seçenek, standart resüspansiyon tamponundaki diklorometanın saf metanol ile değiştirilmesi olacaktır, bu da kullanım kolaylığını artırabilir, ancak bazı lipit sınıflarının çözünürlüğünü olumsuz yönde etkileyebilir ve böylece bu lipit sınıfları için niceleme doğruluğunu azaltabilir.

Son kritik kısım veri işlemedir. Veri işleme iş akışı, Peak by Peak yazılımının .raw'den .mzML biçimine dönüştürülmesini birleştirerek, MS2 tarama ortalaması ve MS1 ve MS2 gürültü filtrelemesinin yanı sıra pik toplama ve veri sıkıştırma uygular. Alternatif olarak, Proteowizard yazılımı veri dönüştürme için de kullanılabilir, ancak bu durumda, LipidXplorer'daki birkaç ayarın manuel olarak tanımlanması gerekir. Av tüfeği lipidomiklerinin tüm karmaşıklığı özellikle doğrudan enjeksiyon MS1 ve MS2 spektrumlarının dekonvolüsyon adımında yoğunlaşmıştır. Açık kaynaklı LipidXplorer yazılımı, dönüştürülen spektrumları kütle doğruluğuna, kütle çözünürlüğüne ve artan m / z ile değişiminin eğimine bağlı olarak mzML dosya formatından içe aktarır. Yazılım, bir analiz çalışmasında elde edilen birden fazla bireysel MS ve MS / MS spektrumunu birleştirir. Daha sonra, farklı örneklem çalışmalarındaki bireysel zirveleri hizalar ve hizalanmış zirvelerin her kümesinde, kütlelerini tek yoğunluk ağırlıklı ortalama kütleleriyle değiştirirken, her veri dosyasındaki bolluklarına dokunulmadan kalır. Hizalanmış tepe kümelerinin temsili kütleleri ve tek tek tepe yoğunlukları bir ana tarama veritabanında depolanır. Ana tarama veritabanı, toplu işlemdeki tüm örnekler için oluşturulan tüm MS1 ve MS2 spektrumlarını içerir ve moleküler parçalanma sorgu dilinde (MFQL) yazılmış sorgularla lipit tanımlamalarına dönüştürülebilir.

Genel olarak, yöntem pozitif moda dayalı DAG, TAG ve SE lipitlerinin ve negatif mod edinimine dayalı PC, PE, PS, PI, PA, PG, SM, LPC ve LPE lipitlerinin tanımlanmasını kapsar. Lipid tanımlaması sırasında, MS1 ve MS2 için izotopik düzeltme gerçekleştirilir ve ayarlanan yoğunluklar .xlsx çıktı dosyasında bildirilir. Alternatif olarak, av tüfeği verilerini işlemek için ALEX45 ve LipidHunter46 gibi başka birçok yazılım da mevcuttur.

Yağ asitleri - büyük nükleer ve hücresel membran bileşenleri - biyoaktif moleküllere daha fazla dönüşüm için fosfolipitler formunda depolanır. Lizofosfolipid asiltransferaz enzimleri tarafından Lands yolu47 boyunca lizofosfolipitlere dönüştürülebilirler. Örneğin LPCAT3 enziminin, AA'yı lizofosfatidilkolin ve lizofosfatidilserin ara ürünlerine dahil etmek için yüksek özgüllük gösterdiği bilinmektedir. Bu enzimlerin nispeten yüksek ekspresyonu, alveoler makrofajlar ve bronşiyal epitel hücreleri gibi enflamatuar hücrelerde bildirilmiştir47, bu hücrelerde AA içeren fosfolipitlerin daha büyük göreceli oranlarının salınmasına yol açmıştır. Bununla birlikte, fosfolipaz A2 ile membran fosfolipitlerinden kurtulmalarını takiben, PUFA'ların çeşitli lipit mediatörlerine dönüştürülmesi birçok enzim tarafından katalize edilir48. Ayrıca, bu PUFA'lar, siklooksijenaz (COX)-1 ve COX-2 enzimleri47'nin etkisiyle pro-inflamatuar ve anti-inflamatuar prostaglandinlerin üretimi için substrat haline gelebilir. Fosfolipitler, bu mediatörlerin biyolojik etkilerini göstermeleri gereken belirli yerlerde salınan lipit mediatörlerin kaynaklarından biridir.

Akciğer, her biri normal akciğer gelişimini ve fonksiyonunu kolaylaştırmada örtüşen ve niş roller oynayan çoklu hücre tiplerinden oluşan karmaşık bir organdır. Fare veya insan akciğerindeki farklı hücre tiplerini (örneğin, alveolar tip 2 hücreleri) izole etmek ve profillemek için sadece birkaç çalışma yapılmıştır49,50; Diğer majör akciğer hücresi tipleri karakterize edilmemiştir. Bir başka ilginç çalışma51, fare akciğerindeki endotelyal, epitelyal, mezenkimal ve karışık bağışıklık hücrelerinin lipit analizini izole etmek ve gerçekleştirmek için gerçekleştirildi. PCO ve PG'ye dahil edilen PUFA'ların konsantrasyonunun bağışıklık hücrelerinde zenginleştiği gözlendi. CS'nin akciğerdeki bağışıklık hücrelerinde bir artışa (4-5 kat) neden olduğu gerçeği göz önüne alındığında, bronkoalveoler lavaj (BAL)52 ile değerlendirildiği gibi, bu çalışmada gözlenen toplam lipit değişiklikleri, fare akciğerinde immün hücre alımındaki kümülatif bir artış ile açıklanabilir.

Sonuç olarak, fosfolipitlere dahil edilen tekli doymamış yağ asitlerinin ve PUFA'ların gözlenen çarpıklığı, hücre içindeki belirli FA'ların fazlalığını yansıtabilir ve / veya oksidatif stres ve enflamatuar koşullar altında aşırı üretilen oksilipin öncüllerinin hücre içi bir kaynağını oluşturabilir. Bununla birlikte, serbest EPA, DHA ve diğer oksilipinler hakkında ek veriler bu noktayı açıklığa kavuşturmak için gereklidir ve mevcut yöntem uygulamasının kapsamı dışındadır.

Açıklamalar

Tüm yazarlar Philip Morris International'ın çalışanlarıdır. Philip Morris International, bu projenin tek finansman kaynağı ve sponsorudur.

Teşekkürler

Yazarlar, çalışma ekibine teşekkür etmek ve özellikle PMI R&D, Philip Morris International Research Laboratories Pte'deki biyoaraştırma ve aerosol ekiplerinin teknik yardım ve desteğini kabul etmek istiyor. Ltd., Singapur ve PMI AR-GE, Philip Morris Products S.A., Neuchâtel, İsviçre. Yazarlar, biyobankacılığı yönettiği için Sam Ansari'ye teşekkür eder ve Sindhoora Bhargavi Gopala Reddy'nin el yazmasının taslağını düzenlediği için desteğini kabul eder.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1, 5, and 2 mL self-lock tubesEppendorf30120086, 30120094
3 mm stainless still beadsQiagen69997
4.1 µm nozzle chipAdvionHD-D-384
Acetic acidSigma Aldrich45754-100ML-F
Ammonium acetateHoneywell14267-25G
Ammonium bicarbonateSigma Aldrich09830-500G
Bovine serum albumin standard, 2 mg/mLThermo Scientific 23209
ButanolHoneywell33065-2.5L
ChloroformSigma Aldrich650498-1L
DichloromethaneHoneywell34856-1L
Ethyl acetateHoneywell33211
Greiner CELLSTAR 96 well platesSigmaM9686
HeptaneSigma Aldrich34873-2.5L
IsopropanolFisher ScientificA461
MethanolFisher ScientificA456
Mouse pooled plasmaBioIvt
Mouse SPLASH standardAvanti Polar Lipids330710XInternal standard
Nunc 96-flat bottom well transparent platesVWR62409-068
Plastic spatulaSigmaZ560049-300EA
Quick Start Bradford 1x Dye reagentBioRad5000205
Serum diluentSigma AldrichD5197
Equipment/software
CryoPrep CP02 impactor instrumentCovaris   Magnetic hammer
Centrifuge 5427REppendorf.   Centrifuge
ChipSoft 8.3Advion Biosciences.   Software to set up method and acquisition on the Triversa nanomate robot
LipidXplorer 1.2.8.1N/A.   Software to identify lipids
Peak By PeakSpectroSwiss.   Software to convert .raw data from MS to .mzml format
ProteoWizardProteoWizard.   Alternative (open source) software to convert .raw data from MS to .mzml format
Q-Exactive MSThermo Fisher.   High resolution orbitrap mass spectrometer
Qiagen Tissue Lyser IIQiagen.   Tissue lyser
SpeedVac SPD140DDAThermo Fisher.   Vacuum concentrator
Tecan Infinite M nano plusTecan.   Plate reader
ThermoMixer CEppendorf.   Thermomixer
TriVersa NanomateAdvion Biosciences.   Direct infusion nano-source
Xcalibur 4.3Thermo Scientific.   Software to set up method and acquisition on the Q-Exactive MS

Referanslar

  1. Salehi, N., Janjani, P., Tadbiri, H., Rozbahani, M., Jalilian, M. Effect of cigarette smoking on coronary arteries and pattern and severity of coronary artery disease: A review. Journal of International Medical Research. 49 (12), 3000605211059893 (2021).
  2. Churg, A., Sin, D. D., Wright, J. L. Everything prevents emphysema: Are animal models of cigarette smoke-induced chronic obstructive pulmonary disease any use. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 45 (6), 1111-1115 (2011).
  3. Lee, G., Walser, T. C., Dubinett, S. M. Chronic inflammation, chronic obstructive pulmonary disease, and lung cancer. Current Opinion in Pulmonary Medicine. 15 (4), 303-307 (2009).
  4. Titz, B., et al. Effects of cigarette smoke, cessation, and switching to two heat-not-burn tobacco products on lung lipid metabolism in C57BL/6 and Apoe-/- mice-An integrative systems toxicology analysis. Toxicological Sciences. 149 (2), 441-457 (2016).
  5. Morissette, M. C., Shen, P., Thayaparan, D., Stampfli, M. R. Disruption of pulmonary lipid homeostasis drives cigarette smoke-induced lung inflammation in mice. European Respiratory Journal. 46 (5), 1451-1460 (2015).
  6. Jubinville, E., et al. Interplay between cigarette smoking and pulmonary reverse lipid transport. European Respiratory Journal. 50 (3), 1700681 (2017).
  7. Han, X., Gross, R. W. Shotgun lipidomics: Electrospray ionization mass spectrometric analysis and quantitation of cellular lipidomes directly from crude extracts of biological samples. Mass Spectrometry Reviews. 24 (3), 367-412 (2005).
  8. Titz, B., et al. Multi-omics systems toxicology study of mouse lung assessing the effects of aerosols from two heat-not-burn tobacco products and cigarette smoke. Computational and Structural Biotechnology Journal. 18, 1056-1073 (2020).
  9. Hartung, T., et al. Systems toxicology: Real world applications and opportunities. Chemical Research in Toxicology. 30 (4), 870-882 (2017).
  10. Talikka, M., et al., Lyubimov, A., et al. Systems Toxicology. Encyclopedia of Drug Metabolism and Interactions. , (2016).
  11. Ejsing, C. S., et al. Global analysis of the yeast lipidome by quantitative shotgun mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2136-2141 (2009).
  12. Papan, C., et al. Systematic screening for novel lipids by shotgun lipidomics. Analytical Chemistry. 86 (5), 2703-2710 (2014).
  13. Carvalho, M., et al. Effects of diet and development on the Drosophila lipidome. Molecular Systems Biology. 8, 600 (2012).
  14. Strittmatter, N., et al. Shotgun lipidomic profiling of the NCI60 cell line panel using rapid evaporative ionization mass spectrometry. Analytical Chemistry. 88 (15), 7507-7514 (2016).
  15. Lydic, T. A., et al. Rapid and comprehensive 'shotgun' lipidome profiling of colorectal cancer cell derived exosomes. Methods. 87, 83-95 (2015).
  16. Sampaio, J. L., et al. Membrane lipidome of an epithelial cell line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (5), 1903-1907 (2011).
  17. Grzybek, M., et al. Comprehensive and quantitative analysis of white and brown adipose tissue by shotgun lipidomics. Molecular Metabolism. 22, 12-20 (2019).
  18. Stegemann, C., et al. Comparative lipidomics profiling of human atherosclerotic plaques. Circulation: Cardiovascular Genetics. 4 (3), 232-242 (2011).
  19. Tajima, Y., et al. Lipidomic analysis of brain tissues and plasma in a mouse model expressing mutated human amyloid precursor protein/tau for Alzheimer's disease. Lipids in Health and Disease. 12, 68 (2013).
  20. Gross, R. W., Han, X. Shotgun lipidomics of neutral lipids as an enabling technology for elucidation of lipid-related diseases. American Journal of Physiology: Endocrinology and Metabolism. 297 (2), 297-303 (2009).
  21. Surma, M. A., et al. An automated shotgun lipidomics platform for high throughput, comprehensive, and quantitative analysis of blood plasma intact lipids. European Journal of Lipid Science and Technology. 117 (10), 1540-1549 (2015).
  22. Heiskanen, L. A., Suoniemi, M., Ta, H. X., Tarasov, K., Ekroos, K. Long-term performance and stability of molecular shotgun lipidomic analysis of human plasma samples. Analytical Chemistry. 85 (18), 8757-8763 (2013).
  23. Zhang, S., Van Pelt, C. K. Chip-based nanoelectrospray mass spectrometry for protein characterization. Expert Review of Proteomics. 1 (4), 449-468 (2004).
  24. Surma, M. A., et al. Mouse lipidomics reveals inherent flexibility of a mammalian lipidome. Scientific Reports. 11 (1), 19364 (2021).
  25. Herzog, R., Schwudke, D., Shevchenko, A. LipidXplorer: Software for quantitative shotgun lipidomics compatible with multiple mass spectrometry platforms. Current Protocols in Bioinformatics. 43, 11-30 (2013).
  26. R: A language and environment for statistical computing. R: Foundation for Statistical Computing Available from: https://www.R-project.org/ (2018)
  27. Phillips, B., et al. A 7-month cigarette smoke inhalation study in C57BL/6 mice demonstrates reduced lung inflammation and emphysema following smoking cessation or aerosol exposure from a prototypic modified risk tobacco product. Food and Chemical Toxicology. 80, 328-345 (2015).
  28. Phillips, B., et al. A six-month systems toxicology inhalation/cessation study in ApoE(-/-) mice to investigate cardiovascular and respiratory exposure effects of modified risk tobacco products, CHTP 1.2 and THS 2.2, compared with conventional cigarettes. Food and Chemical Toxicology. 126, 113-141 (2019).
  29. Zemski Berry, K. A., Murphy, R. C. Electrospray ionization tandem mass spectrometry of glycerophosphoethanolamine plasmalogen phospholipids. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 15 (10), 1499-1508 (2004).
  30. Engelmann, B. Plasmalogens: Targets for oxidants and major lipophilic antioxidants. Biochemical Society Transactions. 32, 147-150 (2004).
  31. Nagan, N., Zoeller, R. A. Plasmalogens: Biosynthesis and functions. Progress in Lipid Research. 40 (3), 199-229 (2001).
  32. Southam, A. D., Weber, R. J., Engel, J., Jones, M. R., Viant, M. R. A complete workflow for high-resolution spectral-stitching nanoelectrospray direct-infusion mass-spectrometry-based metabolomics and lipidomics. Nature Protocols. 12 (2), 310-328 (2016).
  33. Yang, K., Han, X. Accurate quantification of lipid species by electrospray ionization mass spectrometry - Meet a key challenge in lipidomics. Metabolites. 1 (1), 21-40 (2011).
  34. Zullig, T., Trotzmuller, M., Kofeler, H. C. Lipidomics from sample preparation to data analysis: a primer. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (10), 2191-2209 (2020).
  35. Koivusalo, M., Haimi, P., Heikinheimo, L., Kostiainen, R., Somerharju, P. Quantitative determination of phospholipid compositions by ESI-MS: Effects of acyl chain length, unsaturation, and lipid concentration on instrument response. Journal of Lipid Research. 42 (4), 663-672 (2001).
  36. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
  37. Matyash, V., Liebisch, G., Kurzchalia, T. V., Shevchenko, A., Schwudke, D. Lipid extraction by methyl-tert-butyl ether for high-throughput lipidomics. Journal of Lipid Research. 49 (5), 1137-1146 (2008).
  38. Lofgren, L., Forsberg, G. B., Stahlman, M. The BUME method: A new rapid and simple chloroform-free method for total lipid extraction of animal tissue. Scientific Reports. 6, 27688 (2016).
  39. Lofgren, L., et al. The BUME method: A novel automated chloroform-free 96-well total lipid extraction method for blood plasma. Journal of Lipid Research. 53 (8), 1690-1700 (2012).
  40. Jung, H. R., et al. High throughput quantitative molecular lipidomics. Biochimica et Biophysica Acta. 1811 (11), 925-934 (2011).
  41. Lavrynenko, O., et al. Ceramide ratios are affected by cigarette smoke but not heat-not-burn or e-vapor aerosols across four independent mouse studies. Life Sciences. 263, 118753 (2020).
  42. Schuhmann, K., et al. Shotgun lipidomics on a LTQ Orbitrap mass spectrometer by successive switching between acquisition polarity modes. Journal of Mass Spectrometry. 47 (1), 96-104 (2012).
  43. Schuhmann, K., et al. Quantitative fragmentation model for bottom-up shotgun lipidomics. Analytical Chemistry. 91 (18), 12085-12093 (2019).
  44. Lipidomics Standards Initiative Consortium. Lipidomics needs more standardization. Nature Metabolism. 1 (8), 745-747 (2019).
  45. Husen, P., et al. Analysis of lipid experiments (ALEX): A software framework for analysis of high-resolution shotgun lipidomics data. PloS One. 8 (11), 79736 (2013).
  46. Ni, Z., Angelidou, G., Lange, M., Hoffmann, R., Fedorova, M. LipidHunter identifies phospholipids by high-throughput processing of LC-MS and shotgun lipidomics datasets. Analytical Chemistry. 89 (17), 8800-8807 (2017).
  47. Zemski Berry, K. A., Murphy, R. C., Kosmider, B., Mason, R. J. Lipidomic characterization and localization of phospholipids in the human lung. Journal of Lipid Research. 58 (5), 926-933 (2017).
  48. Ghosh, M., Tucker, D. E., Burchett, S. A., Leslie, C. C. Properties of the Group IV phospholipase A2 family. Progress in Lipid Research. 45 (6), 487-510 (2006).
  49. Besnard, V., et al. Deletion of Scap in alveolar type II cells influences lung lipid homeostasis and identifies a compensatory role for pulmonary lipofibroblasts. Journal of Biological Chemistry. 284 (6), 4018-4030 (2009).
  50. Plantier, L., et al. Activation of sterol-response element-binding proteins (SREBP) in alveolar type II cells enhances lipogenesis causing pulmonary lipotoxicity. Journal of Biological Chemistry. 287 (13), 10099-10114 (2012).
  51. Kyle, J. E., et al. Cell type-resolved human lung lipidome reveals cellular cooperation in lung function. Scientific Reports. 8 (1), 13455 (2018).
  52. Lugg, S. T., Scott, A., Parekh, D., Naidu, B., Thickett, D. R. Cigarette smoke exposure and alveolar macrophages: mechanisms for lung disease. Thorax. 77 (1), 94-101 (2022).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyokimyaSay 189

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır