Drosophila Oogenezi Sırasında Polarize Hücre İçi Kaçakçılığın ve Bazalton Membran Proteinlerinin Sekresyonunun Konfokal ve Süper Rezolüsyonlu Görüntülenmesi

Özet

Bodrum zarı, gelişim sırasında doku ve organ morfogenezi için gereklidir. Bu yapının uygun şekilde yerleştirilmesine yol açan mekanizmaları daha iyi anlamak için, sunulan protokol, konfokal ve süper çözünürlüklü mikroskopi kullanarak epitel hücrelerinde bazal membran proteinlerinin hücre içi kaçakçılığını ve sekresyonunu görselleştirmek ve karakterize etmek için yöntemleri açıklamaktadır.

Özet

Epitel hücrelerinin bazal tarafında bulunan özel bir hücre dışı matriks tabakası olan bazal membran (BM), epitel dokusu morfolojisinin ve organ morfogenezinin kurulması ve sürdürülmesi için kritik öneme sahiptir. Dahası, BM doku modellemesi için gereklidir, bir sinyal platformu görevi görür ve dokuları ve organları şekillendirmek için dış kuvvetler sağlar. BM'nin normal gelişim ve patolojik durumlar sırasında oynadığı birçok önemli role rağmen, BM içeren veziküllerin hücre içi kaçakçılığını kontrol eden biyolojik yollar ve bazal sekresyonun BM proteinlerinin polarize birikimine nasıl yol açtığı tam olarak anlaşılamamıştır. Drosophila yumurtalıklarının foliküler epiteli, BM membran proteinlerinin bazal birikimini incelemek için mükemmel bir model sistemidir, çünkü BM'nin tüm ana bileşenlerini üretir ve salgılar. sabit dokularda görüntü işleme ile birleştirilen konfokal ve süper çözünürlüklü görüntüleme, özellikle BM proteinlerinin hücre içi kaçakçılığı ve birikiminde rol oynayan hücresel faktörlerin tanımlanmasına ve karakterizasyonuna izin verir. Bu makalede, Drosophila yumurtalıklarının foliküler epitelindeki endojen olarak etiketlenmiş proteinler kullanılarak BM içeren veziküllerin ve biriken BM'nin boyanması ve görüntülenmesi için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Bu protokol hem kalitatif hem de nicel soruları ele almak için uygulanabilir ve epitel dokusu gelişimi sırasında polarize hücre içi kaçakçılık ve veziküllerin salgılanmasında rol oynayan faktörlerin hızlı ve verimli bir şekilde tanımlanmasına olanak tanıyan yüksek verimli taramaya uyum sağlamak için geliştirilmiştir.

Giriş

Bodrum membranı (BM), epitel yapısı ve morfogenez¹ için kritik olan katmanlı hücre yapışık hücre dışı matriksin (ECM) ince bir tabakasıdır. ~ 50 proteinden oluşur ve epitel ve endotel hücrelerinin altında her yerde bulunur ve iskelet, pürüzsüz ve kalp kası hücrelerini ve adipositleri ^1,2,3 ile örter. BM'nin epitel hücrelerinin bazal tarafındaki üç ana bileşeni Kollajen IV, Perlekan ve Lamininlerdir. BM, epitel hücrelerinin temelini oluşturur ve doku ayrılması ve bariyeri, büyüme ve destek ve hücre polarizasyonu 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 dahil olmak üzere birçok ^fonksiyondan sorumludur. . Bir sinyal platformu olarak rolü, gelişim sırasında epitel hücrelerinin ve dokularının morfolojisini ve farklılaşmasını düzenler 3,13,14. Ayrıca, BM'nin yanlış düzenlenmesi ve / veya bütünlüğünün ihlali, tümör metastazı^2,15,16 dahil olmak üzere birçok patolojik durumun birincil nedenleridir. BM tarafından doku ve organ morfogenezi sırasında gerçekleştirilen temel fonksiyonlara rağmen, BM proteinlerinin polarize hücre içi kaçakçılığına ve sekresyonuna adanmış biyolojik yolakların bileşenleri belirsiz olarak bilinmektedir.

BM içeren veziküllerin hücre içi kaçakçılığını ve BM proteinlerinin epitel hücreleri tarafından salgılanmasını incelemek için, Drosophila yumurtalıklarının foliküler epiteli (FE) güçlü bir model sistemdir (Şekil 1). Bir Drosophila yumurtalık, ovaroller adı verilen 16-20 uzun, tüp benzeri yapıdan oluşur (Şekil 1A, B)^17,18,19. Her ovarol, ön uçta başlayan ve olgun yumurta kanalından çıkana kadar arkadan hareket eden yumurta odalarının (her biri bir yumurtaya yol açan) yaş ilerlemesiyle bir yumurta montaj hattı olarak düşünülebilir. Her yumurta odası, merkezi germline hücrelerini (GC'ler) çevreleyen somatik folikül hücrelerinin (FC'ler) tek katmanlı bir tabakası olan FE tarafından kapsüllenir. FE, apikal alanın germ hattına baktığı ve BM proteinlerinin bazal olarak^18,19 salgılandığı belirgin bir apikal-bazal polarite ile oldukça polarize edilir. FC'ler, Kollajen IV, Perlecan ve Lamininler^20,21 dahil olmak üzere ^BM'nin tüm ana bileşenlerini aktif olarak salgılar. FC'ler gibi epitel hücrelerinde, BM bileşenleri üretilir ve hücre dışı birikimleri için özel bir polarize sekresyon yolu gerektirir. Örneğin, BM'nin en bol bileşeni olan Kollajen IV (Coll IV) söz konusu olduğunda, polarize hücre içi kaçakçılığını ve sekresyonunu çevreleyen detaylar, üretimi ve birikimi birçok çalışmanın odak noktası olmasına rağmen belirsizdir. Coll IV, endoplazmik retikulumda (ER) çevrilir, bu da her fibrilin - üç polipeptitten (iki α1 zinciri ve bir α2 zinciri) oluşan - üçlü bir sarmal^22'ye monte edildiği yerdir. Uygun Coll IV katlama ve fonksiyonu, Plod ve PH4αEFB ^{20,22,23,24,25,26} gibi lizil ve prolil-hidroksilazlar dahil olmak üzere ER şaperonları ve enzimleri gerektirir. Bu posttranslasyonel enzimler, Coll IV'ün ER sıralamasını düzenler, çünkü her birinin kaybı, Coll IV'ün bazal ER^{20,23,24,25,26'da} sıkışmasına neden olur. Daha sonra, yeni sentezlenen Coll IV, COPII kaplı veziküllerde Golgi için ER'den çıkar. Kargo reseptörü Tango1, kollajenlerin büyük multimerik proteinleri barındırabilen büyük Golgi'ye bağlı veziküllere paketlenmesine yardımcı olur^20,27. Coll IV, hücre içi ekzositik veziküllere paketlendikten sonra, özellikle epitel hücrelerinden bazal olarak salgılanır. BM birikimini bazal tarafa yönlendirmek için, epitel hücreleri özellikle polarize BM sekresyonuna adanmış başka bir dizi faktöre ihtiyaç duyar. Drosophila yumurtalıklarının FE'sini kullanarak, nükleotid değişim faktörleri (GEF'ler) Crag ve Stratum, GTPazlar Rab8 ve Rab10'un yanı sıra fosfoinositid PI (4,5) P2 seviyeleri ve Kinesin 1 ve 3 motor proteinleri 20,28,29,30,31 dahil olmak üzere bu yeni hücresel sürecin birkaç bileşeni karakterize edilmiştir. . Bu bileşenler, BM proteinlerinin polarize dağılımını sağlamada kritik öneme sahiptir.

FE'deki BM proteinlerinin hücre içi lokalizasyonunu izlemek için, Viking-GFP (Vkg-GFP veya α2 Coll IV-GFP) ve Perlecan-GFP (Pcan-GFP) gibi endojen olarak etiketlenmiş bazal membran proteinleri (protein tuzakları)^32,33 kullanılabilir. Bu protein tuzak hatlarının BM proteinlerinin endojen dağılımını doğru bir şekilde yansıttığı ve veziküler kaçakçılığın daha hassas bir şekilde tespit edilmesini sağladığı gösterilmiştir ^28,30. FE'de BM'nin polarize birikiminde rol oynayan bileşenler ilk olarak Vkg-GFP ve Pcan-GFP^20,28,29,30 için protein tuzak hatları kullanılarak karakterize edildi. Protein tuzakları, mutantlar ve Gal4 hatları³⁴ dahil olmak üzere farklı genetik arka planlarda kullanılabilir. Ayrıca, protein tuzakları floresan boyalar ve / veya floresan immünoboyama ile kombinasyon halinde kullanılabilir, bu da vahşi tip ve mutant koşulları karşılaştırırken BM proteinlerinin lokalizasyonunun kesin karakterizasyonuna izin verir³⁵.

BM proteini içeren veziküllerin dağılımını ve lokalizasyonunu doğru ve verimli bir şekilde değerlendirmek için, konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) ve süper çözünürlüklü görüntüleme teknikleri diğer görüntüleme yaklaşımlarına önemli bir avantaj sağlamaktadır. Bu yaklaşımlar, yüksek çözünürlüklü görüntülemeyi göreceli kullanım kolaylığı ile birleştirir. CLSM, galvanometreler kullanarak numuneyi bir lazerle raster tarama tarzında tarayarak gelişmiş bir optik çözünürlüğe izin veren bir mikroskopi tekniğidir. İğne deliği açıklığı, konfokal mikroskopun temel bir bileşenidir. İğne deliği diyafram açıklığı, odak düzleminin üstünden veya altından gelen odak dışı sinyalleri engelleyerek, z ekseni^36'da oldukça üstün bir çözünürlük sağlar. Bu aynı zamanda z-düzleminde, bir dizi optik bölüme karşılık gelen z-yığını adı verilen bir dizi görüntü elde etmeyi mümkün kılar. z-yığınları daha sonra görüntüleme yazılımı yardımıyla 3D rekonstrüksiyon yoluyla numunenin 3D görüntüsünü oluşturur. Geleneksel epifloresan (geniş alan) mikroskoplar, konfokal mikroskopların aksine, odak dışı ışığın görüntü kalitesine katkıda bulunmasına izin vererek görüntü çözünürlüğünü ve kontrastı^{azaltır 36,37}. Bu, epifloresan mikroskopisini protein lokalizasyonu veya kolokalizasyonu üzerinde çalışırken daha az çekici bir aday haline getirir.

CLSM, BM proteinlerinin hücre içi trafiğinin görüntülenmesi ve karakterizasyonu da dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar için uygun bir yaklaşım olmasına rağmen, Abbe'nin ışık kırınım sınırının (200-250 nm) altındaki örnekleri görüntülerken hala bir sorun teşkil etmektedir. Bu tür örnekleri görüntülerken, konfokal mikroskopi, özellikle bir yağ hedefi kullanırken, yüksek çözünürlükle sonuçlanabilir. Bununla birlikte, süper çözünürlük teknikleri konfokal mikroskopinin sınırını aşmaktadır. Süper çözünürlüklü mikroskopi elde etmek için, her biri belirli çözünürlük sınırlarına sahip ve her biri farklı analizler için uygun olan çeşitli yaklaşımlar vardır. Bu yaklaşımlar arasında fotoaktif lokalizasyon mikroskobu (PALM) veya stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskobu (STORM), uyarılmış emisyon tükenme mikroskobu (STED), yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM) ve Airyscan (süper çözünürlük) mikroskobu 38,39,40,41,42,43,44,45,46 bulunmaktadır. . Airyscan, PALM / STORM, STED ve SIM'den daha kaba bir çözünürlüğe sahip olmasına rağmen, yine de ~ 120 nm'ye kadar bir çözünürlüğe ulaşabilir (CLSM'nin çözünürlüğünün yaklaşık iki katı). Ayrıca, bu süper çözünürlüklü mikroskopi yaklaşımının, kalın numuneleri ve düşük sinyal-gürültü oranına sahip numuneleri görüntülerken SIM ve diğer süper çözünürlüklü tekniklere göre bir avantajı olduğu gösterilmiştir^47,48.

Airyscan nispeten yeni bir süper çözünürlüklü konfokal mikroskopi teknolojisidir⁴⁶. Odak dışı ışığı reddetmek için iğne deliği ve tek nokta dedektörlerini kullanan geleneksel CLSM'lerin aksine, bu süper çözünürlüklü yaklaşım, her tarama konumunda tüm ışığı toplayan 32 kanallı galyum arsenit fosfit (GaAsP) fotoçarpan tüp alanı dedektörü kullanır⁴⁵. 32 dedektörün her biri küçük bir iğne deliği olarak çalışarak iğne deliği boyutunu geleneksel 1,0 Havadar Üniteden (A.U.) gelişmiş 0,2 A.U.'ya düşürerek 1,25 A.U. çapı^45'in verimliliğini korurken daha da yüksek bir çözünürlük ve sinyal-gürültü oranı sağlar. Ayrıca, Airyscan tarafından kullanılan doğrusal dekonvolüsyon,⁴⁵ çözünürlüğünde 2 kata kadar artışa neden olur. Bunu göz önünde bulundurarak, CLSM ve özellikle süper çözünürlüklü mikroskopi, BM proteinlerinin bazal birikimini düzenleyen BM proteinlerini ve proteinlerini incelemek için çok uygundur, çünkü lokalizasyon ve kolokalizasyon çalışmaları için çok yüksek çözünürlüklü görüntüler üretebilirler, böylece bu süreçleri kontrol eden mekansal, zamansal ve moleküler olaylarda yeni bilgiler sağlayabilirler.

Lokalizasyon deneyleri yapmak için kullanılabilecek konfokal mikroskopiye alternatif bir yaklaşım, görüntü dekonvolüsyonudur. Geniş alan mikroskobu, odak dışı ışığın dedektörlere ulaşmasına izin verdiğinden, geniş alan mikroskobu ile elde edilen görüntülerden odak dışı ışığı çıkarmak veya yeniden atamak için matematiksel ve hesaplamalı dekonvolüsyon algoritmaları uygulanabilir, böylece görüntünün çözünürlüğünü ve kontrastını artırabilir⁴⁹. Dekonvolüsyon algoritmaları, çözünürlüğü ve kontrastı daha da artırmak için konfokal görüntülere de uygulanabilir ve neredeyse süper çözünürlüklü mikroskopi⁵⁰ ile karşılaştırılabilir nihai görüntüler üretir. Airyscan, Sheppard'ın piksel yeniden atamasıyla birlikte Weiner filtre tabanlı dekonvolüsyondan yararlanır ve bu da oldukça gelişmiş bir uzamsal çözünürlük ve sinyal-gürültü oranı sağlar. Konfokal mikroskopi ile karşılaştırıldığında, bu süper çözünürlüklü mikroskopi tekniği ^45,51 kullanıldığında, her üç uzamsal boyutta (x ve y'de 120 nm ve z'de³⁵⁰ nm) çözünürlükte 2 kat artış gözlenmiştir^.

Bu makale, konfokal ve süper çözünürlüklü mikroskopi ile birleştirilmiş bir model sistem olarak Drosophila yumurtalık FE'sini kullanarak BM proteinlerinin hücre içi kaçakçılığını ve birikimini boyamak, elde etmek ve görselleştirmek için ayrıntılı ve optimize edilmiş protokoller sunmaktadır. Vkg-GFP ve Pcan-GFP gibi endojen olarak etiketlenmiş bazal membran proteinlerini ifade eden Drosophila çizgileri, BM protein kaçakçılığını ve sekresyonunu görselleştirmek için etkili ve doğru araçlardır. Ek olarak, mutant ve Gal4 / UAS hatları³⁴ dahil olmak üzere farklı genetik arka planlarda kolayca kullanılabilirler. Endojen olarak etiketlenmiş bazal membran proteinleri önerilmekle birlikte, spesifik BM proteinlerine karşı antikorların kullanımı da tarif edilen protokollerle uyumludur. Bu protokoller, konfokal ve süper çözünürlüklü görüntüleme kullanarak hücre içi kaçakçılığı ve bozulmamış epitel dokusunda BM proteinlerinin salgılanmasını incelemek isteyen bilim adamları için özellikle yararlıdır. Dahası, epitel doku analizini Drosophila genetiğinin geniş araçlarıyla birleştirme yeteneği, bu yaklaşımı özellikle güçlü kılmaktadır. Son olarak, bu protokoller veziküler kaçakçılığı ve ilgilenilen diğer proteinlerin sıralanmasını incelemek için kolayca uyarlanabilir.

Protokol

1. Yumurtalık diseksiyonları için sinek hazırlığı

1. İstenilen genotipten 10-15 Drosophila melanogaster dişi sineğini (1-2 günlük), 25 ° C'de diseksiyondan 2-3 gün önce az miktarda granül fırıncı mayası serpilmiş ~ 8 mL Drosophila sinek ortamı içeren dar bir şişeye koyun. Şişeye birkaç erkek eklemek yumurta odası verimini artırabilir. Bununla birlikte, toplam sinek sayısının 20'yi geçmediğinden emin olun, çünkü bu yumurtalık gelişimini olumsuz yönde etkileyebilir.
   NOT: Drosophila erkek ve kadınlarının tanımı ve daha önce Drosophila deneyimi olmayan bilim adamları için yararlı ipuçları ve tavsiyeler alıntılanan^34,52. makalelerde bulunabilir. Maya eklenmesi yumurta üretimini uyaracak ve temsil edilen farklı aşamalara sahip yumurtalıklar üretecektir. Ayrıca, yumurtalıkları yağlayacak ve eksize edilmesini kolaylaştıracaktır. Granül maya yerine ıslak maya da kullanılabilir, ancak daha zayıf stoklar için sinekler sıkışabilir ve ölebilir.

2. Yumurtalık diseksiyonu ve fiksasyonu

NOT: Yumurtalık diseksiyonu ve boyama ile ilgili ek kaynaklar için, okuyucular belirtilen^{protokoller 53,54,55'e} yönlendirilir.

1. Diseksiyon gününde, PFA stok çözeltisini 1x fosfat tampon salin (PBS) içinde seyrelterek% 4'lük bir paraformaldehit (PFA) nihai konsantrasyonu ile taze fiksasyon çözeltisi hazırlayın.
2. CO 2 kullanarak sinekleri anestezi altına_alın ve bir sinek pedine yerleştirin. Diseksiyona kadar sinekleri anestezi altında tutun. Hareketleri durduktan sonra uygun şekilde uyuşturulmuş sinekleri düşünün, bu genellikle 10-20 s sürer.
   NOT: CO₂ kullanımı daha güvenli ve daha hızlı bir seçenek olarak önerilse de, sinekler buz kullanılarak uyuşturulabilir.
3. Diseksiyon mikroskobu altında sığ çöküntü kuyucukları olan bir cam içbükey slayt veya boyama kabı yerleştirin ve kuyucukları 1x PBS ile doldurun.
4. Bir çift forseps kullanarak alt toraksta bir dişi sineği kavrayın. Sineklerin cinsiyetini, karnın arka ucunda erkek cinsel organlarının yokluğu ve ön ayaklarında seks taraklarının yokluğu ile ikincil bir özellik olarak sağlayın⁵². Başka bir çift forseps (adım 2.5) kullanarak sinekleri ayrı ayrı parçalara ayırırken, diseksiyon mikroskobu altında 1x PBS ile doldurulmuş kuyucuklara batırın (20x büyütme önerilir).
5. Diseksiyon mikroskobuna bakarken, sinek karnının arka kısmını çekmek için başka bir çift forseps kullanın ve iç organları (örneğin, yumurtalıklar, bağırsak) görünür hale getirin.
6. Yumurtalıkları karından çıkmaya zorlamak için sinek karnının ön kısmını (bir diş macunu tüpünde olduğu gibi) hafifçe sıkın. Bu yöntem yumurtalıkları sağlam tutmalıdır. Diğer organları ayırın ve dikkatlice çıkarın ve kalıntıları uçurun.
7. Forseps veya diseksiyon iğneleri kullanarak, genel yumurtalık yapısını sağlam tutarken yumurtalıkların yumurtalıklarını ayırın. Bu adımın amacı, yumurtalıkları kaplayan kas kılıfını kırmak ve daha verimli ve homojen bir lekelenmeye izin vermektir.
8. Yumurtalıkları hızlı bir şekilde 1x PBS içeren 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve tüm sinekler disseke edilene kadar tüpü buz üzerinde tutun. Mikrotübüller veya mikrofilamentler (veya bu sitoiskelet bileşenleri tarafından trafiğe maruz kalan veziküller) görselleştirilecekse, tüpü buz üzerinde tutmayın, çünkü bu depolimerizasyona neden olabilir.
9. Tüm yumurtalıklar disseke edildikten ve bir mikrosantrifüj tüpüne aktarıldıktan sonra, tüpün dibine batmalarına ve PBS'nin ~ 50 μL dışındaki tüm miktarlarını çıkarmalarına izin verin. 1 mL% 4 PFA ekleyin ve 15 dakika boyunca bir somun platformu rocker'ına yerleştirin. Önemli olarak, eksik fiksasyon lekelenme ve görüntüleme sorunlarına yol açabileceğinden, uygun fiksasyona izin vermek için yumurtalıkların fiksasyon çözeltisinde ileri geri hareket edip etmediğini kontrol edin.
   NOT: Nutatörün hızı çok önemli değildir. Bazı nutatörler hız kontrolüne sahipken, diğerleri önceden ayarlanmış bir hıza sahiptir. Önceden ayarlanmış hız yeterlidir ve ayarlanabilirse, 40-50 rpm'ye ayarlayın.
10. Fiksasyon çözeltisini çıkarın (adım 2.9'da olduğu gibi) ve daha sonra mikrofüj tüplerini 5-6 kez hafifçe ters çevirerek% 0.1 Triton-X 100 (1x PBST) içeren 1 mL 1x PBS ile iki hızlı yıkama gerçekleştirin. Ardından, 1 mL 1x PBST (toplam 40-60 dakika) ile dört adet 10-15 dakikalık yıkama (uzun yıkama) ile devam edin.
    NOT: Deterjan yüzdesinin arttırılması GFP denatürasyonuna neden olabileceğinden, yıkamalar için 1x PBS +% 0.1 Triton-X 100 kullanılması tavsiye edilir, bu da floresanın azalmasına ve GFP etiketli BM proteinlerinin tespit edilmesine neden olabilir.
11. DNA ve F-aktin boyama gibi boya boyaması için, adım 3'e geçin. İmmün boyama için, adım 4'e geçin. Yumurtalıklar, devam etmeden önce 4 ° C'de 1x PBST'de 24 saate kadar saklanabilir.

3. Standart DNA / F-Aktin boyama

1. Fiksasyon ve yıkamadan sonra PBST'yi çıkarın. 500 μL DNA ve F-Aktin boyama çözeltisi ekleyin. DNA / F-Aktin çözeltisini hazırlamak için, Hoechst (DNA boyası; 1 mg / mL stok çözeltisinin 1:1000 seyreltilmesi) ve florofor etiketli falloidin (F-aktin boyası; Alexa Fluor 546 için 1:500 seyreltme veya Alexa Fluor 647 için 1:100 seyreltme, her biri 66 μM stok çözeltisi) 500 μL PBST içinde karıştırın.
2. Etkili görüntüleme için floresanı korumak üzere yumurtalıkları ve boyaları karanlıkta tutmak için tüpleri alüminyum folyo ile örtün ve 15 dakika boyunca bir somun platformu rocker üzerinde inkübe edin.
3. Kuluçkadan sonra, DNA / F-Aktin çözeltisini çıkarın (adım 2.9'da olduğu gibi). Adım 2.10'da açıklandığı gibi 1x PBST'de iki hızlı yıkama ve üç uzun (10-15 dakika) yıkama gerçekleştirin. Adım 5'te açıklandığı gibi montaja geçin.

4. Floresan immün boyama

NOT: Bu, floresan görüntüleme için standart bir immün boyama protokolüdür ve çoğu primer antikor ile uyumludur.

1. Bloke etme ve primer antikor immünoboyaması (1. Gün)
   1. Fiksasyon ve yıkamadan sonra, adım 2.9'da açıklandığı gibi PBST'yi çıkarın. 1 mL blokaj çözeltisi (PBS +% 5 BSA) ekleyin ve yumurtalıkları en az 1 saat boyunca bir somun platform rocker üzerinde bloke edin.
      NOT: BSA'ya ek olarak, blokaj çözeltisine fetal sığır serumu (FBS) veya normal keçi serumu (NGS) eklenebilir. Alternatif olarak, yumurtalıklar 4 ° C'de bir somun platformu rocker üzerinde gece boyunca bloke edilebilir.
   2. Adım 2.9'daki gibi bloke edici çözeltiyi çıkarın ve bloke edici çözeltiye uygun konsantrasyonlarında (kullanılan antikora özgü) seyreltilmiş birincil antikorlar içeren 300 μL birincil antikor çözeltisi ekleyin. 4 ° C'de bir nutating platform rocker üzerinde gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, birincil antikor çözeltisini çıkarın ve ikincil antikor immünoboyamasına devam edin.
      NOT: Bazı birincil antikorlar kaydedilebilir ve tekrar kullanılabilir. Bazı durumlarda, yeniden kullanılan birincil antikorlar arka plan boyamasını azaltabilir ve bu da daha iyi görüntüleme ile sonuçlanabilir. Bununla birlikte, verimliliği sağlamak için her antikor için yeniden kullanım test edilmelidir.
2. Sekonder antikor immünoboyaması (2. Gün)
   1. Birincil antikor solüsyonunu çıkardıktan sonra, adım 2.10'da olduğu gibi iki hızlı yıkama ve dört uzun (10-15 dakika) yıkama yapın. Taze 1x PBST kullanılarak dikkatlice yapılan tekrarlayan yıkamalar, spesifik olmayan arka planı azaltacak ve optimum görüntülemeye yol açacaktır.
   2. Adım 2.9'daki gibi PBST'yi çıkarın ve kullanılan birincil antikorları tespit edecek floresan sekonder antikorlar içeren 500 μL sekonder antikor çözeltisi ekleyin. Görüntü yakalama ve analiz için kritik olan floresanın optimum şekilde korunması için tüpü bu noktadan itibaren alüminyum folyo ile kaplayarak ışıktan koruyun.
      NOT: İkincil antikor çözeltisi, endojen olarak etiketlenmiş proteinlerle örtüşmeyen floroforlarla konjuge edilmiş ikincil antikorlar içermelidir. Örneğin, GFP etiketli proteinler kullanılıyorsa, Alexa Fluor ikincil antikorlarının kırmızı veya uzak kırmızı dalga boylarında kullanılması önerilir (örneğin, 546, 568 veya 647 nm). Hoechst ve Alexa Fluor 546 veya 647 konjuge falloidin gibi floresan boyalar ikincil çözeltiye eklenebilir. Bu lekeler genel hücre yapısını (yani çekirdekler ve F-Aktin) işaretlemek için yararlı olabilir. Konsantrasyonlar için adım 3.1'e bakın.
   3. Yumurtalıkları, oda sıcaklığında 2 saat boyunca bir nutating platform rocker üzerindeki ikincil antikor çözeltisinde inkübe edin. Adım 2.10'da olduğu gibi 1x PBST'de iki hızlı yıkama ve dört uzun (10-15 dakika) yıkama gerçekleştirin. Adım 5'teki gibi montaja devam edin.

5. Lekeli yumurtalıkların montajı

NOT: Bu yöntem, yumurtalıklar iyi gelişmiş ve bol miktarda bulunuyorsa çok iyi çalışır. Yumurtalıkların slayta dikkatli bir şekilde monte edilmesi, optimum görüntüleme için kritik öneme sahiptir.

1. Son yıkamadan sonra, yumurta odalarını ayırmak için yumurtalıkları tüpte yukarı ve aşağı doğru hafifçe pipetlemek için bir p1000 pipet kullanın. Tüpü 5-10 dakika dik konumda tutarak yumurta odalarının dibe batmasına izin verin. Tek tek yumurta odalarının dikkatli bir şekilde ayrılması, optimum görüntü elde etmek için kritik öneme sahiptir.
2. PBST'yi bir Pasteur pipet kullanarak çıkarın ve ~50 μL bırakın. kalan PBST'nin mümkün olduğunca çoğunu bir p200 pipet kullanarak çıkarın. 22 mm x 22 mm'lik bir kapak kayması üzerine eşit şekilde yayılacak kadar iki damla montaj ortamı ekleyin. Yumurtalıklar, montajdan önce 1 aya kadar 4 °C'de mikrosantrifüj tüplerinde montaj ortamında saklanabilir.
   NOT: Ticari olarak birkaç farklı montaj ortamı mevcuttur; optimum görüntüleme koşulları elde etmek için Aqua-Poly/Mount veya ProLong Glass Antifade Mountant gibi sert ayarlı montajcıların kullanılması önerilir. Gliserolün bir montaj ortamı olarak kullanılması, kötü görüntüleme koşullarına (örneğin, florofor instabilitesi) yol açabileceğinden önerilmez. Polimerize olmayan montaj ortamları için, yerine sabitlemek için bir kapak kayma sızdırmazlık maddesi/oje kullanarak kapak kapağını kapatın.
3. Bir cam sürgüyü etiketleyin ve tozu ve parmak izlerini temizlemek için yumuşak, tozsuz kağıtla silin. Viskoz montaj ortamının mikrosantrifüj tüpünden kızağa kolayca aktarılmasını sağlamak için p200 pipet ucunun ucunu kesin. Daha sonra, montaj ortamındaki tüm yumurta odalarını yavaşça cam slayta aktarın ve kabarcıklar oluşturmadığınızdan emin olun.
4. Diseksiyon mikroskobu altında, montaj ortamını ve ayrılmış yumurta odalarını, yaklaşık olarak kapak kaymasının büyüklüğündeki bir alanı kaplamak için yeni bir p200 ucu veya forseps kullanarak yavaşça yayın.
5. Forseps kullanarak, kabarcıkları önlemek için kapak kapağını (tozsuz kağıtla temizlenmiş) yumurta odalarına dikkatlice bir açıyla yerleştirin.
6. Polimerize etmek için slaytı oda sıcaklığında karanlıkta düz bir yüzeyde 2 gün saklayın. Montaj ortamı sertleştikten sonra, slayt görüntüleme için birkaç hafta boyunca karanlıkta 4 ° C'de saklanabilir.
   NOT: Görüntülemeden önce sert ayarlı montaj ortamının polimerize olması önemlidir. Ortam henüz polimerize olmamışsa, yumurtalıklar örtü kapağının altında yüzer ve görüntü alımını etkiler. Ayrıca, montaj ortamının optimum yansıtıcı indeksi ancak tamamen ayarlandıktan sonra elde edilir (ayrıntılar için üreticinin bilgilerine bakın).
7. Alternatif montaj yöntemi: Yumurtalıkların bol olmaması durumunda doku kaybını azaltmak için bu yöntem önerilir. Bu yöntemde (aşağıda açıklanmıştır), ovarolleri ve kızak üzerindeki yumurta odalarını, adım 5.1'de açıklandığı gibi pipetle bir mikrosantrifüj tüpünde ayırmak yerine, montaj sırasında ayırın.
   1. Son yıkamadan sonra, yıkama çözeltisinin ~ 100 μL dışındaki tümünü çıkarın. Bir Pasteur pipet veya p1000 pipet kullanarak PBS'deki bozulmamış yumurtalıkları slayda aktarın. Bir p200 pipet kullanarak, slayttan mümkün olduğunca fazla PBST'yi dikkatlice çıkarın. Gerekirse PBST'yi silmek için tozsuz bir kağıt kullanın. Yumurtalıklara dokunmayın.
   2. İki damla montaj ortamı ekleyin. Forseps veya diseksiyon iğneleri kullanarak yumurtalıkları ve yumurta odalarını dikkatlice ayırın. Yabancı dokuyu çıkarın ve atın ve ardından yumurta odalarını ve yumurtalıkları montaj ortamına yayın. 5.5-5.6 arasındaki adımlara geçin.

6. Konfokal görüntü alımı

NOT: Bu bölüm, herhangi bir konfokal mikroskop kullanılarak optimum görüntü elde etmek için anahtar parametreler sağlar (Şekil 2).

1. Mikroskopu kurun ve örneği aşağıda açıklandığı gibi bulun.
   1. Görüntülemeden önce, floresan mikroskobun göz merceğini kullanarak ilgilenilen bölgeyi (ROI) bulmak çok önemlidir. Düşük büyütme hedefi (20x) veya görüntü yakalama için kullanılacak hedefi (ör. 40x veya 63x) kullanın. Görüntülemek için bir yumurta odası seçin.
      NOT: Görüntü alma için 40x veya 63x gibi yüksek büyütme hedeflerinin kullanılması önerilir (bkz. 6.2.1).
   2. Yatırım getirisi seçildikten sonra, görüntü alma işlemine devam edin; konfokal görüntüleme için adım 6.2'ye ve süper çözünürlüklü görüntüleme için adım 7'ye geçin.
2. Aşağıda açıklandığı gibi optimum görüntü alımı için anahtar parametreleri seçin (temsili görüntüler için anahtar parametrelere örnekler Tablo 1'de verilmiştir).
   1. Bir hedef seçme: FE'deki BM proteinlerinin hücre içi kaçakçılığının ve sekresyonunun konfokal görüntü elde edilmesi için, 40x veya 63x hedefi kullanın.
      NOT: Mümkün olan en iyi çözünürlüğü elde etmek için, en yüksek akromatik düzeltmeyi sağlayan yüksek sayısal diyafram açıklığına (NA) sahip Plan-Apochromat hedeflerinin kullanılması şiddetle tavsiye edilir.
   2. Her kanal/parça için lazer seçme: GFP için lazer 488 nm kullanın; DAPI veya Hoechst için lazer 405 nm kullanın; Alexa Fluor 546 veya 568 için lazer 561 nm kullanın; Alexa Fluor 647 için lazer 640 nm kullanın.
      NOT: Her lazer seçimi farklı bir kanal/iz oluşumu ile sonuçlanacaktır. Burada, kanal terimi, her kanalın belirli dalga boyunda seçilen ROI için uyarılmış floroforlar için kaydedilen yoğunluk dağılımı tarafından oluşturulan görüntüyü ifade eder.
   3. İğne deliği ayarı: Görüntü yakalama sırasında odak dışı ışığı azaltmak için her kanalın iğne deliğini 1 AU olarak ayarlayın.
   4. Lazer yoğunluğu ve dedektör kazancı ayarları: Görüntü hassasiyetine ince ayar yapmak için hem dedektör ana kazancını hem de lazer gücünü kullanın. Görüntü hassasiyetini doğru şekilde ayarlamak için bir aralık göstergesi önerilir. Hem ana kazancı hem de lazer gücünü, dedektör doygunluğundan kaçınırken ilgilenilen yapıların (örneğin, BM içeren veziküller) açıkça görülebildiği uygun bir hassasiyete sahip olacak şekilde ayarlayın.
      NOT: Fotobeyazlatmayı önlemek için, gereken minimum lazer gücünü kullanın. Mümkün olan en düşük lazer gücünü kullanırken önce dedektör kazancının arttırılması önerilir. Dedektör kazancının artması istenen yoğunluğa ulaşamazsa, lazer gücünü artırın. Lazer güç yoğunluğu %0,5-%1,2 arasında olması önerilir.
   5. Çerçeve boyutu: Edinme yazılımı tarafından belirlenen en uygun görüntü boyutunun kullanılması önerilir. Çoğu uygulama için maksimum 1024 x 1024 çözünürlük kullanın. Daha yüksek çözünürlük, satın alma süresini önemli ölçüde artıracaktır.
   6. Tarama hızı: Çoğu örnek için güvenli olan 6-9 arasında bir tarama hızı kullanın. Örnek gürültülüyse, sinyal-gürültü oranlarını iyileştirmek için daha yavaş bir tarama hızı kullanın. Bununla birlikte, düşük tarama hızları fotobeyazlatma ve elde etme süresini arttırır.
   7. Ortalama yoğunluk ortalaması: Görüntü kalitesini artırmak için, aynı ayarlara sahip ardışık taramalar yoluyla ortalama yoğunluk ortalamasını kullanın. Çoğu durumda, numuneyi fotobeyazlatmadan sinyal-gürültü oranlarını iyileştirmek için ortalama iki kullanın.
   8. Yakınlaştırma: Yakınlaştırma işlevini kullanarak tarama alanını ayarlayın. FE'deki BM içeren vezikülleri net bir şekilde görselleştirmek için en etkili değer olarak hem 40x hem de 63x hedefleriyle 2x-4x arasında bir yakınlaştırma kullanın. Satın alma süresini azaltmak için minimum yatırım getirisini dikkatlice seçin.
3. Zeiss Zen yazılımını kullanarak bir z-yığını elde etmek için aşağıdaki Z-kesitleme parametrelerini kullanın ve bunları aşağıda açıklandığı gibi ayarlayın.
   NOT: Veziküller ve BM proteinleri içeren diğer hücre içi yapılar 3 boyutlu (3B) yapılardır. FE aracılığıyla bir z-yığını elde etmek, görüntü kalitesini ve çözünürlüğünü önemli ölçüde artıracaktır. Genellikle, dokunun kalınlığını / derinliğini kapsayan bir aralık, hücre içi lokalizasyonu etkili bir şekilde görselleştirmek için yeterlidir. Optimum 3D rekonstrüksiyon için, yazılım tarafından belirlenen en uygun aralığın kullanılması önerilir. 40x ve 63x hedefler için, optimum 3D rekonstrüksiyona izin vermek için her bir z bölümü arasında 0,5 μm'den daha yüksek aralıklardan kaçının.
   1. Edinme sekmesinin altındaki ana alanda bulunan z-Stack onay kutusuna tıklayın. Z-yığını için Dilim Başına Tüm İzler tarama modunu seçin. Bu, her z konumu dilimi için kanal izlerinde bir değişikliğe neden olur.
   2. Örneği gözlemlemek için istediğiniz kanalı seçin ve canlı bir tarama başlatmak için Canlı'ya tıklayın. GFP etiketli BM proteinini tespit etmek için gereken kanalın kullanılması önerilir.
   3. Z-yığını için açıklandığı gibi bir aralık ayarlayın. Mikroskop üzerindeki ince ayar düğmesini kullanarak, numunenin bir ucu için z-konumunu bulun ve İlk Önce Ayarla'ya tıklayın. Benzer şekilde, numunenin diğer ucu için z konumunu bulun ve Son Ayarla'ya tıklayın.
   4. Z-yığınındaki her konum için, aralık göstergesi seçiliyken her bir kanala ayrı ayrı tıklayın ve adım 6.2.4'te açıklandığı gibi lazerin yoğunluğunu ve ana kazancı gerektiği gibi ayarlayın.
   5. Adım boyutunu adım 6.3'ün altındaki NOT'ta önerildiği gibi atamak için z yığınının aralığını ayarlayın. z-stack alımına başlamak için Denemeyi Başlat'a tıklayın.

7. Süper çözünürlüklü görüntü alma

1. Airyscan uyumlu bir reklam verme amacı seçin. BM proteininin hücre içi lokalizasyonunu görselleştirmek için, 63x yağ hedefinin kullanımı en uygunudur (Şekil 3). Hedefi 63x olarak ayarlayın ve yavaşça lensine bir damla daldırma yağı yerleştirin. Slaytı, numuneyi bulmak için hedefe bakan kapak kayması olacak şekilde objektif üzerine yerleştirin.
2. Floroforun aşağıda açıklandığı gibi görüntülenmesi için uygun ayarlara sahip bir konfigürasyon seçin.
   1. Yeni bir deneme yapılandırmak için Edinme sekmesindeki Akıllı Kurulum düğmesini tıklayın. Airyscan (süper çözünürlük) öğesini seçin; bu seçildiğinde, Çözünürlük (Airyscan SR), SNR / hassasiyet (Airyscan Confocal) ve Speed (Multiplex SR-2Y) arasında daha fazla seçim yapılması gerekecektir. Sabit doku için, en iyi alımla sonuçlanacak şekilde Çözünürlük'ü seçin.
   2. İzler/kanallar eklemek için Denemenizi Yapılandırın kutusundaki + işaretini tıklayın. Boya Veritabanından belirli boyalar için parçaları seçin. Çok kanallı bir deneme için, uygun boyaları seçerek her parçayı gerektiği gibi ekleyin.
   3. Tüm parçalar eklendikten sonra, yazılım tarafından sağlanan deneme tekliflerinden birini seçin. Bu deney için, En Akıllı (Hat) teklifine kıyasla hız biraz daha yavaş olacağından, her boya için en iyi donanım ayarlarını oluşturacağı ve maksimum sinyal kazancı ve minimum emisyon çapraz konuşması ile sonuçlanacağı için En İyi Sinyal'i kullanın. Deneme ayarlandıktan ve yüklendikten sonra, Edinme sekmesindeki Görüntüleme Ayarları penceresinde görünür.
   4. Akıllı bir kurulum seçildikten sonra, dedektör GaAsP-PMT için dalga boyları aralığı otomatik olarak seçilecektir. Aralığı artırmak veya azaltmak için alttaki kaydırma çubuğunu hareket ettirerek aralığı ayarlayın ya da aralığı gerektiği gibi tamamen başka bir bölgeye taşıyın. Çapraz konuşmayı önlemek için iki farklı kanalın aralıklarının çakışmadığından emin olmak için bunu kullanın. Yapılandırmayı gelecekte yeniden kullanmak üzere kaydedin.
3. Yapılandırma ayarlandıktan sonra, yakınlaştırma ve tarama alanını adım 6.2.8'deki gibi ayarlamaya devam edin. Tarama süresini ve depolama alanını azaltmak için ilgili bölgeye odaklanmak üzere tarama alanını optimize edin. Görüntüleri almaya devam edin.
4. Her bir kanal için, Kanal altında bir parça seçin ve Canlı'yı tıklayın. Adım 6.2.4'te açıklandığı gibi aralık göstergesi aracını kullanarak ana kazancı ve lazer gücünü ayarlayın ve doygun pikselleri önlemek için açıklanan tüm yönergeleri izleyin. Airyscan Dedektörü Görünümü düğmesine tıklayarak altıgen dedektör görünümünün ortalandığını ve hizalandığını onaylayın. Çoğu durumda, altıgen dedektör görünümü otomatik olarak ortalanır ve hizalanır. Ek kanallar için bu işlemi tekrarlayın.
5. Edinme modu geçiş penceresinde, Görüntü Boyutu altında, dedektörün yeteneklerini en üst düzeye çıkarmak için SR (süper çözünürlükle sınırlı piksel sayısı) üzerine tıklayın. Bu, çerçeve boyutunu otomatik olarak ayarlayacaktır.
6. Genellikle gerekli olmadığı için ortalamayı Hiçbiri olarak tutun ve bu tarama süresini azaltacaktır. Bazı durumlarda, ortalama 2x'lik bir değer, sinyal-gürültü oranını iyileştirebilir.
7. 8 bit veri derinlikleriyle ham veri toplayın. Bir görüntü elde etmek için Tuttur'a tıklayın. Bir z-yığını edinmek için adım 6.3'ü izleyin.
8. Aşağıda açıklandığı gibi görüntü işleme gerçekleştirin. Bu, 16 bitlik bir görüntü üretecektir.
   1. Görüntü veya z-yığını elde edildikten sonra, İşleme > Yöntemi'ne tıklayın ve Airyscan İşleme'yi seçin.
   2. Başlamak için otomatik filtre uygulayın ve numune için en iyi sonuçları elde etmek üzere SR değerini değiştirerek daha fazla el ile işleme gerçekleştirin. En uygun SR değeri belirlendikten sonra, işlenmiş bir görüntü oluşturmak için Uygula'ya tıklayın. Z-stack görüntüleri söz konusu olduğunda, 3D İşleme kutusuna tıklayarak bir z-dilimi (Geçerli Görüntü [2D]) veya tüm z-stack olarak işleyin .

8. Görüntü işleme ve veri analizi (ortogonal projeksiyon, 3D rekonstrüksiyon ve yoğunluk profili)

NOT: Bu yöntem için, ortogonal projeksiyonlar, 3B rekonstrüksiyonlar ve yoğunluk profilleri oluşturmak için kullanılan adımlar Zen yazılımı için açıklanmıştır (bkz. Benzer veri analizleri ImageJ yazılımı⁵⁶ ile de yapılabilir.

1. Aşağıda açıklandığı gibi ortogonal projeksiyon yapın (Şekil 4).
   1. Konfokal veya süper çözünürlüklü mikroskopi kullanılarak bir z-yığını elde edildikten sonra, hücrenin z eksenindeki vezikülleri 2B görünümde görüntülemek için ortogonal bir projeksiyon oluşturun (3B rekonstrüksiyona kıyasla). Bunu yapmak için, İşleme > Yöntemi'ne tıklayın ve Ortogonal Projeksiyon'u seçin.
   2. Parametreler altında, gerekli projeksiyon düzlemini seçin. Z ekseninin (z-yığını) projeksiyonu için Ön (XY) düzlemini seçin. Yöntem altında, en yüksek kalitede projeksiyonla sonuçlanmak için Maksimum'u seçin.
   3. Ardından, başlangıç konumunu (başlangıç z-dilimi) seçerek projeksiyonun kalınlığını belirleyin ve projeksiyondaki kalınlığı (toplam z-dilimi sayısı) belirleyin. Z eksenindeki bir hücreninkine eşit kalınlığı seçmek idealdir.
   4. Parametreler ayarlandıktan sonra, z-yığınının projeksiyonunu XY düzlemi tarzında oluşturmak için Uygula'ya tıklayın.
      NOT: Belirli bir ilgili nesnenin miktarını karşılaştırmak için birden fazla z-yığınının ortogonal projeksiyonlarını oluştururken, veri doğruluğu için projeksiyonun kalınlığını aynı (veya mümkün olduğunca yakın) tutmak zorunludur.
2. Aşağıda açıklandığı gibi 3B rekonstrüksiyon gerçekleştirin (Şekil 5).
   1. Yapıların lokalizasyonunu ve şeklini gözlemlemek için z-yığınlarının 3B rekonstrüksiyonlarını oluşturun. Bunu, konfokal ve süper çözünürlüklü yaklaşımlar kullanılarak elde edilen z-yığınları için yapın. Süper çözünürlüklü z-yığınlarını ilk olarak 3B yeniden yapılandırma için adım 7.8'de olduğu gibi 3B işlemeyi kullanarak işleyin.
   2. Bir 3B görüntü oluşturmak için, önizleme penceresindeki 3B simgesine tıklayın. Tıklandığında, ekranın alt yarısındaki ekran kontrolü bölümünde bir 3B sekmesi görünecektir. Saydamlık, Hacim, Maksimum, Yüzey ve Karışık gibi 3B görünümler görünür olacaktır. Veziküllerin yapısını görüntülerken Yüzey veya Karışık görünümler kullanın (tercih edilir).
   3. En yüksek kaliteli görüntü için Hassas ayarını seçin, çünkü en hızlı ayar daha az doğru olur ve zayıf 3B işlemeye neden olur.
   4. Görüntü oluşturulduktan sonra, ilgilenilen nesneleri görüntülemek üzere tercih edilen bir konuma odaklanmak için döndürüp yakınlaştırarak görüntüyü değiştirin. Görünüm sekmesi altındaki 3B görüntüyü değiştirin.
   5. Tatmin edici bir görünüm elde edildikten sonra, 3B sekmesinin altında Görüntülenen Çözünürlük'ü seçin ve ardından Görüntü Oluştur'a tıklayın. Bu, görüntünün görüntülendiği yönde bir anlık görüntüsünü oluşturur ve çeşitli dosya biçimlerinde kaydedilip dışa aktarılabilir.
3. Aşağıda açıklandığı gibi bir yoğunluk profili oluşturun (Şekil 7).
   NOT: Farklı floresan sinyallerle ilişkili piksellerin dağılım ve yoğunluk profilleri, birlikte lokalizasyonlarını belirlemek için bir bindirme görüntüsü olarak görüntülenebilir.
   1. Konfokal veya süper çözünürlüklü görüntüleme yoluyla en uygun görüntü elde edildikten sonra, Önizleme penceresinin Görünüm panelinde Profil'e tıklayın. Önizleme penceresinde, yoğunluk profilini mesafenin bir fonksiyonu olarak görüntüleyen bir histogramın yanı sıra mesafeleri ve yoğunluk değerlerini gösteren bir tablo görünecektir.
   2. Ekranın altındaki görüntü kontrolleri alanında, Profil Tanımı sekmesindeki Ok Aracı'na tıklayın. Farklı piksellerin yoğunluk profilinin değerlendirilmesi gereken nesnenin uzunluğu boyunca bir ok çizin. Oku çizmek için görüntüyü yakınlaştırın.
   3. Yoğunluk profili, okun yolu boyunca mesafenin ve karşılık gelen tepe noktalarının görüntüleneceği görüntü önizlemesinin solunda görünecektir. Görüntünün kendisinde görüntülenen histogramı kaldırmak için, Profili Grafiklerde Göster kutusunun işaretini kaldırın.
   4. Görüntü kontrol alanındaki Boyutlar sekmesinde, yoğunluk profiline dahil edilmemesi gereken kanalların seçimini kaldırın.
   5. Grafikler sekmesinde, Grafik Öğelerini Biçimlendir açılır kutusunu açmak için Ek Açıklamalar/Ölçümler kutusunun altında gösterilen Profil'e çift tıklayın. Okun rengini, stilini ve kontur kalınlığını değiştirmek için bunu kullanın. İstediğiniz ayarları seçtikten sonra kutuyu kapatın.
   6. Profil Görünümü sekmesine tıklayın. Yeni görüntü bölümünde, dosyayı kaydetmek için Geçerli Görünüm'e ve ardından Farklı Kaydet'e tıklayın. Veri sıkıştırmasını ve kaybını önlemek için dosyayı .tif dosyası olarak kaydetmeniz önerilir.

Sonuçlar

Burada açıklanan yöntemler, Drosophila yumurtalıklarının FE'si gibi polarize epitel hücrelerinde BM proteinlerinin hücre içi kaçakçılığını ve sekresyonunu verimli ve doğru bir şekilde görüntülemek ve karakterize etmek için kullanılabilir. Daha sonra, açıklanan yöntemler kullanılarak elde edilen beklenen sonuçların yanı sıra yararlı tavsiyeler ve potansiyel tuzaklar sunuyoruz. Bunu yapmak için, endojen olarak etiketlenmiş bir Vkg (Drosophila Col IV) olan Vkg-GFP kullanı...

Tartışmalar

BM, embriyonik ve organ morfogenezi ve yetişkin fizyolojik fonksiyonları için kritik öneme sahiptir. Ayrıca, BM, epitel polaritesinin kurulması ve sürdürülmesi için bir sinyal platformu görevi görür ve dokulara destek² sağlar. Bununla birlikte, BM proteinlerinin uygun şekilde yerleştirilmesini düzenleyen mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. BM proteinlerinin hücre içi kaçakçılığına ve polarize sekresyonuna adanmış biyolojik yolakların daha iyi anlaşılması, ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 546 phalloidin	Invitrogen	A22283	F-Actin Stain (1/500 of 66µM)
Alexa Fluor 647 phalloidin	Invitrogen	A22287	F-Actin Stain (1/100 of 66µM))
Anti-GM130 Antibody	abcam	ab30637	For Golgi Stain (colocalization); use as concentration of 7µg/uL
Aqua-Polymount	Polysciences, Inc.	1860620	Mounting Medium
Bakers Yeast (Active Dry Yeast)	Genesee Scientific	62-103	To fatten the overies for dissection
Bovine Serum Albumin (30% solution)	Sigma-Aldrich	A7284	For blocking solution
Depression wells	Electron Microscopy Sciences	7156101	For dissection (glass concavity slide can be used instead)
Dissecting needle	Fisher scientifc	13-820-024
Drosophila Incubator	Genesee Scientific/Invictus
Fly Stock: Perlecan-GFP Drosophila line (ZCL1700)			Morin et al., 2001
Fly Stock: UAS-Crag RNAi line (TRIP line HMS00241)	Bloomington Drosophila Stock Center	33594	RNAi against Crag
Fly Stock: Viking-GFP Drosophila line (CC00791)			Buszczak et al., 2007
Fly Stock: Vkg-GFP, tj-Gal4			Devergne et al., 2017. Drive the expression of Crag RNAi in the FE
Forceps (Dumont 5)	Fine Science Tools	11251-30	For dissection
Glass Concavity Slide	Electron Microscopy Sciences	7187804	For dissection (depression wells can be used instead)
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568	Invitrogen	A11036	Secondary antibody (GM130 antibody) (5 µg/mL)
Hoechst (Hoechst 33342)	Invitrogen	H3570	DNA Stain (1 ug/mL)
Kimwipes	Kimtech	Fisher Scientific: 06-666	Delicate task wipers
Leica Fluorescent Stereo Microscope  M165 FC	Leica		For ovary imaging
Microscope Slides	Corning	294875X25	Microscope Slides
Nutating platform rocker	Corning Life Sciences	6720	For ovary fixation and staining
Nutri-Fly BF	Genesee Scientific	66-121	Fly Food
Paraformaldehyde 20% Solution	Electron Microscopy Sciences	Fisher Scientific: 15713	For PFA 4%
Phosphate Buffered Saline Tablets	Fisher scientific	BP2944100	For PBS solution
ProLong Glass Antifade Mountant	Invitrogen	P36980	Mounting Medium
Square Cover Glass	Corning	285022	Cover glass for microscope slides
Triton x-100	Sigma-Aldrich	9036-19-5	For PBST
Zeiss LSM 900 with Airyscan 2	Zeiss		Confocal and super-resolution Microscope
Zeiss Stemi 305 Stereo Microscope	Zeiss		Dissecting microscope
Zeiss Zen Software version 3.3 (Blue Edition)	Zeiss		Image acquisition and processing