Konfokale und hochauflösende Bildgebung des polarisierten intrazellulären Transports und der Sekretion von Basalmembranproteinen während der Drosophila-Oogenese

Zusammenfassung

Die Basalmembran ist essentiell für die Gewebe- und Organmorphogenese während der Entwicklung. Um die Mechanismen, die zur richtigen Platzierung dieser Struktur führen, besser zu verstehen, beschreibt das vorgestellte Protokoll Methoden zur Visualisierung und Charakterisierung des intrazellulären Transports und der Sekretion von Basalmembranproteinen in Epithelzellen mittels konfokaler und hochauflösender Mikroskopie.

Zusammenfassung

Die Basalmembran (BM) - ein spezialisiertes Blatt extrazellulärer Matrix, das auf der Basalseite von Epithelzellen vorhanden ist - ist entscheidend für die Etablierung und Aufrechterhaltung der Epithelgewebemorphologie und Organmorphogenese. Darüber hinaus ist das BM für die Gewebemodellierung unerlässlich, dient als Signalplattform und liefert externe Kräfte, um Gewebe und Organe zu formen. Trotz der vielen wichtigen Rollen, die die BM während der normalen Entwicklung und der pathologischen Zustände spielt, sind die biologischen Wege, die den intrazellulären Transport von BM-haltigen Vesikeln kontrollieren und wie die basale Sekretion zur polarisierten Ablagerung von BM-Proteinen führt, kaum verstanden. Das follikuläre Epithel des Drosophila-Eierstocks ist ein hervorragendes Modellsystem, um die basale Ablagerung von BM-Membranproteinen zu untersuchen, da es alle wichtigen Komponenten des BM produziert und absondert. Konfokale und hochauflösende Bildgebung in Kombination mit Bildverarbeitung in festsitzenden Geweben ermöglicht die Identifizierung und Charakterisierung zellulärer Faktoren, die spezifisch am intrazellulären Transport und der Ablagerung von BM-Proteinen beteiligt sind. Dieser Artikel stellt ein detailliertes Protokoll für die Färbung und Bildgebung von BM-haltigen Vesikeln und abgelagerten BM unter Verwendung von endogen markierten Proteinen im Follikeliphel des Drosophila-Eierstocks vor. Dieses Protokoll kann angewendet werden, um sowohl qualitative als auch quantitative Fragen zu beantworten, und es wurde entwickelt, um Hochdurchsatz-Screening zu ermöglichen, was die schnelle und effiziente Identifizierung von Faktoren ermöglicht, die am polarisierten intrazellulären Transport und der Sekretion von Vesikeln während der Entwicklung des Epithelgewebes beteiligt sind.

Einleitung

Die Basalmembran (BM) ist eine dünne Schicht aus geschichteter zelladhärenter extrazellulärer Matrix (ECM), die für die Epithelstruktur und Morphogenese 1 entscheidend^ist. Es besteht aus ~ 50 Proteinen und wird ubiquitär unter den Epithel- und Endothelzellen gefunden und umhüllt Skelett-, Glatt- und Herzmuskelzellen^und Adipozyten ^1,2,3. Die drei Hauptkomponenten des BM an der Basalseite der Epithelzellen sind Kollagen IV, Perlecan und Laminine. Das BM liegt den Epithelzellen zugrunde und ist für viele Funktionen verantwortlich, einschließlich Gewebetre....

Protokoll

1. Fliegenvorbereitung für Eierstockdissektionen

1. Geben Sie 10-15 Drosophila melanogaster weibliche Fliegen (1-2 Tage alt) des gewünschten Genotyps in eine schmale Durchstechflasche mit ~ 8 ml Drosophila-Fliegenmedium , die 2-3 Tage vor der Dissektion bei 25 ° C mit einer kleinen Menge granulierter Bäckerhefe bestreut wurde. Das Hinzufügen einiger Männchen zur Durchstechflasche kann den Eizellenertrag steigern. Stellen Sie jedoch sicher, dass die Gesamtzahl der Fliegen 20 nicht überschreitet, da dies die Entwicklung der Eierstöcke negativ beeinflussen kann.
   HINWEIS: Eine Beschreibung der Drosophila-Männer und -Frauen sow....

Ergebnisse

Die hierin beschriebenen Methoden können verwendet werden, um den intrazellulären Transport und die Sekretion von BM-Proteinen in polarisierten Epithelzellen, wie der FE des Drosophila-Eierstocks , effizient und genau abzubilden und zu charakterisieren. Als nächstes liefern wir erwartete Ergebnisse, die mit den beschriebenen Methoden erzielt wurden, sowie hilfreiche Ratschläge und mögliche Fallstricke. Dazu wird Vkg-GFP, ein endogen getaggtes Vkg (Drosophila Col IV), verwendet. Die gleichen Ergebni.......

Diskussion

Die BM ist entscheidend für die embryonale und Organmorphogenese sowie die physiologischen Funktionen von Erwachsenen. Darüber hinaus fungiert das BM als Signalisierungsplattform für die Etablierung und Aufrechterhaltung der epithelialen Polarität und versorgt Gewebe mit Unterstützung². Die Mechanismen, die die richtige Platzierung von BM-Proteinen regulieren, sind jedoch kaum verstanden. Ein besseres Verständnis der biologischen Signalwege, die dem intrazellulären Transport und der polaris.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 546 phalloidin	Invitrogen	A22283	F-Actin Stain (1/500 of 66µM)
Alexa Fluor 647 phalloidin	Invitrogen	A22287	F-Actin Stain (1/100 of 66µM))
Anti-GM130 Antibody	abcam	ab30637	For Golgi Stain (colocalization); use as concentration of 7µg/uL
Aqua-Polymount	Polysciences, Inc.	1860620	Mounting Medium
Bakers Yeast (Active Dry Yeast)	Genesee Scientific	62-103	To fatten the overies for dissection
Bovine Serum Albumin (30% solution)	Sigma-Aldrich	A7284	For blocking solution
Depression wells	Electron Microscopy Sciences	7156101	For dissection (glass concavity slide can be used instead)
Dissecting needle	Fisher scientifc	13-820-024
Drosophila Incubator	Genesee Scientific/Invictus
Fly Stock: Perlecan-GFP Drosophila line (ZCL1700)			Morin et al., 2001
Fly Stock: UAS-Crag RNAi line (TRIP line HMS00241)	Bloomington Drosophila Stock Center	33594	RNAi against Crag
Fly Stock: Viking-GFP Drosophila line (CC00791)			Buszczak et al., 2007
Fly Stock: Vkg-GFP, tj-Gal4			Devergne et al., 2017. Drive the expression of Crag RNAi in the FE
Forceps (Dumont 5)	Fine Science Tools	11251-30	For dissection
Glass Concavity Slide	Electron Microscopy Sciences	7187804	For dissection (depression wells can be used instead)
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568	Invitrogen	A11036	Secondary antibody (GM130 antibody) (5 µg/mL)
Hoechst (Hoechst 33342)	Invitrogen	H3570	DNA Stain (1 ug/mL)
Kimwipes	Kimtech	Fisher Scientific: 06-666	Delicate task wipers
Leica Fluorescent Stereo Microscope  M165 FC	Leica		For ovary imaging
Microscope Slides	Corning	294875X25	Microscope Slides
Nutating platform rocker	Corning Life Sciences	6720	For ovary fixation and staining
Nutri-Fly BF	Genesee Scientific	66-121	Fly Food
Paraformaldehyde 20% Solution	Electron Microscopy Sciences	Fisher Scientific: 15713	For PFA 4%
Phosphate Buffered Saline Tablets	Fisher scientific	BP2944100	For PBS solution
ProLong Glass Antifade Mountant	Invitrogen	P36980	Mounting Medium
Square Cover Glass	Corning	285022	Cover glass for microscope slides
Triton x-100	Sigma-Aldrich	9036-19-5	For PBST
Zeiss LSM 900 with Airyscan 2	Zeiss		Confocal and super-resolution Microscope
Zeiss Stemi 305 Stereo Microscope	Zeiss		Dissecting microscope
Zeiss Zen Software version 3.3 (Blue Edition)	Zeiss		Image acquisition and processing