Конфокальная визуализация и визуализация сверхвысокого разрешения поляризованного внутриклеточного трафика и секреции белков базальной мембраны во время оогенеза дрозофилы

Резюме

Базальная мембрана необходима для морфогенеза тканей и органов во время развития. Чтобы лучше понять механизмы, ведущие к правильному размещению этой структуры, представленный протокол описывает методы визуализации и характеристики внутриклеточного трафика и секреции белков базальной мембраны в эпителиальных клетках с использованием конфокальной микроскопии и микроскопии сверхвысокального разрешения.

Аннотация

Базальная мембрана (БМ) - специализированный лист внеклеточного матрикса, присутствующий на базальной стороне эпителиальных клеток - имеет решающее значение для установления и поддержания морфологии эпителиальной ткани и морфогенеза органов. Кроме того, БМ необходим для моделирования тканей, выступая в качестве сигнальной платформы и обеспечивая внешние силы для формирования тканей и органов. Несмотря на многие важные роли, которые БМ играет во время нормального развития и патологических состояний, биологические пути, контролирующие внутриклеточный трафик БМ-содержащих везикул и то, как базальная секреция приводит к поляризованному отложению белков БМ, плохо изучены. Фолликулярный эпителий яичника Drosophila является отличной модельной системой для изучения базального осаждения мембранных белков BM, поскольку он производит и секретирует все основные компоненты BM. Конфокальная и сверхвысокая визуализация в сочетании с обработкой изображений в фиксированных тканях позволяет идентифицировать и характеризовать клеточные факторы, специфически участвующие во внутриклеточном трафике и отложении белков BM. В этой статье представлен подробный протокол окрашивания и визуализации BM-содержащих везикул и депонированных BM с использованием эндогенно меченых белков в фолликулярном эпителии яичника Drosophila . Этот протокол может быть применен для решения как качественных, так и количественных вопросов, и он был разработан для обеспечения высокопроизводительного скрининга, позволяющего быстро и эффективно идентифицировать факторы, участвующие в поляризованном внутриклеточном трафике и секреции везикул во время развития эпителиальной ткани.

Введение

Базальная мембрана (BM) представляет собой тонкий лист слоистого клеточного адгезивного внеклеточного матрикса (ECM), критического для эпителиальной структуры и морфогенеза¹. Он содержит ~ 50 белков и находится повсеместно лежащим в основе эпителиальных и эндотелиальных клеток, а также обволакивает скелетные, гладкие и сердечные мышечные клетки и адипоциты ^1,2,3. Тремя основными компонентами БМ на базальной стороне эпителиальных клеток являются коллаген IV, перлекан и ламинины. BM лежит в основе эпителиальных клеток и отвечает за многие функции, включа....

протокол

1. Подготовка мухи к рассечению яичников

1. Поместите 10-15 самок мух Drosophila melanogaster (1-2 дня) нужного генотипа в узкий флакон, содержащий ~8 мл среды Drosophila fly, посыпанный небольшим количеством гранулированных пекарских дрожжей за 2-3 дня до рассечения при 25 °C. Добавление нескольких самцов во флакон может повысить урожайность яйцеклетки. Однако следите за тем, чтобы общее количество мух не превышало 20, так как это может негативно сказаться на развитии яичников.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Описание дрозофилы мужчин и женщин, а также полезные советы и рекомендации для ученых, не имеющих предварительного опыта ....

Результаты

Способы, описанные в настоящем описании, могут быть использованы для эффективного и точного изображения и характеристики внутриклеточного трафика и секреции белков BM в поляризованных эпителиальных клетках, таких как FE яичника Drosophila . Далее мы предоставляем ожидаемые результаты, .......

Обсуждение

БМ имеет решающее значение для эмбрионального и органного морфогенеза, а также физиологических функций взрослых. Кроме того, БМ выступает в качестве сигнальной платформы для установления и поддержания эпителиальной полярности и обеспечивает тканям поддержку². Тем не мен?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 546 phalloidin	Invitrogen	A22283	F-Actin Stain (1/500 of 66µM)
Alexa Fluor 647 phalloidin	Invitrogen	A22287	F-Actin Stain (1/100 of 66µM))
Anti-GM130 Antibody	abcam	ab30637	For Golgi Stain (colocalization); use as concentration of 7µg/uL
Aqua-Polymount	Polysciences, Inc.	1860620	Mounting Medium
Bakers Yeast (Active Dry Yeast)	Genesee Scientific	62-103	To fatten the overies for dissection
Bovine Serum Albumin (30% solution)	Sigma-Aldrich	A7284	For blocking solution
Depression wells	Electron Microscopy Sciences	7156101	For dissection (glass concavity slide can be used instead)
Dissecting needle	Fisher scientifc	13-820-024
Drosophila Incubator	Genesee Scientific/Invictus
Fly Stock: Perlecan-GFP Drosophila line (ZCL1700)			Morin et al., 2001
Fly Stock: UAS-Crag RNAi line (TRIP line HMS00241)	Bloomington Drosophila Stock Center	33594	RNAi against Crag
Fly Stock: Viking-GFP Drosophila line (CC00791)			Buszczak et al., 2007
Fly Stock: Vkg-GFP, tj-Gal4			Devergne et al., 2017. Drive the expression of Crag RNAi in the FE
Forceps (Dumont 5)	Fine Science Tools	11251-30	For dissection
Glass Concavity Slide	Electron Microscopy Sciences	7187804	For dissection (depression wells can be used instead)
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568	Invitrogen	A11036	Secondary antibody (GM130 antibody) (5 µg/mL)
Hoechst (Hoechst 33342)	Invitrogen	H3570	DNA Stain (1 ug/mL)
Kimwipes	Kimtech	Fisher Scientific: 06-666	Delicate task wipers
Leica Fluorescent Stereo Microscope  M165 FC	Leica		For ovary imaging
Microscope Slides	Corning	294875X25	Microscope Slides
Nutating platform rocker	Corning Life Sciences	6720	For ovary fixation and staining
Nutri-Fly BF	Genesee Scientific	66-121	Fly Food
Paraformaldehyde 20% Solution	Electron Microscopy Sciences	Fisher Scientific: 15713	For PFA 4%
Phosphate Buffered Saline Tablets	Fisher scientific	BP2944100	For PBS solution
ProLong Glass Antifade Mountant	Invitrogen	P36980	Mounting Medium
Square Cover Glass	Corning	285022	Cover glass for microscope slides
Triton x-100	Sigma-Aldrich	9036-19-5	For PBST
Zeiss LSM 900 with Airyscan 2	Zeiss		Confocal and super-resolution Microscope
Zeiss Stemi 305 Stereo Microscope	Zeiss		Dissecting microscope
Zeiss Zen Software version 3.3 (Blue Edition)	Zeiss		Image acquisition and processing