Конфокальная визуализация и визуализация сверхвысокого разрешения поляризованного внутриклеточного трафика и секреции белков базальной мембраны во время оогенеза дрозофилы

Резюме

Базальная мембрана необходима для морфогенеза тканей и органов во время развития. Чтобы лучше понять механизмы, ведущие к правильному размещению этой структуры, представленный протокол описывает методы визуализации и характеристики внутриклеточного трафика и секреции белков базальной мембраны в эпителиальных клетках с использованием конфокальной микроскопии и микроскопии сверхвысокального разрешения.

Аннотация

Базальная мембрана (БМ) - специализированный лист внеклеточного матрикса, присутствующий на базальной стороне эпителиальных клеток - имеет решающее значение для установления и поддержания морфологии эпителиальной ткани и морфогенеза органов. Кроме того, БМ необходим для моделирования тканей, выступая в качестве сигнальной платформы и обеспечивая внешние силы для формирования тканей и органов. Несмотря на многие важные роли, которые БМ играет во время нормального развития и патологических состояний, биологические пути, контролирующие внутриклеточный трафик БМ-содержащих везикул и то, как базальная секреция приводит к поляризованному отложению белков БМ, плохо изучены. Фолликулярный эпителий яичника Drosophila является отличной модельной системой для изучения базального осаждения мембранных белков BM, поскольку он производит и секретирует все основные компоненты BM. Конфокальная и сверхвысокая визуализация в сочетании с обработкой изображений в фиксированных тканях позволяет идентифицировать и характеризовать клеточные факторы, специфически участвующие во внутриклеточном трафике и отложении белков BM. В этой статье представлен подробный протокол окрашивания и визуализации BM-содержащих везикул и депонированных BM с использованием эндогенно меченых белков в фолликулярном эпителии яичника Drosophila . Этот протокол может быть применен для решения как качественных, так и количественных вопросов, и он был разработан для обеспечения высокопроизводительного скрининга, позволяющего быстро и эффективно идентифицировать факторы, участвующие в поляризованном внутриклеточном трафике и секреции везикул во время развития эпителиальной ткани.

Введение

Базальная мембрана (BM) представляет собой тонкий лист слоистого клеточного адгезивного внеклеточного матрикса (ECM), критического для эпителиальной структуры и морфогенеза¹. Он содержит ~ 50 белков и находится повсеместно лежащим в основе эпителиальных и эндотелиальных клеток, а также обволакивает скелетные, гладкие и сердечные мышечные клетки и адипоциты ^1,2,3. Тремя основными компонентами БМ на базальной стороне эпителиальных клеток являются коллаген IV, перлекан и ламинины. BM лежит в основе эпителиальных клеток и отвечает за многие функции, включая разделение тканей и барьер, рост и поддержку, а также поляризацию клеток 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Его роль в качестве сигнальной платформы регулирует морфологию и дифференцировку эпителиальных клеток и тканей во время развития ^3,13,14. Более того, неправильная регуляция БМ и/или нарушение его целостности являются основными причинами многих патологических состояний, включая метастазирование опухоли ^2,15,16. Несмотря на существенные функции, выполняемые БМ во время морфогенеза тканей и органов, компоненты биологического пути (путей), предназначенные для поляризованного внутриклеточного трафика и секреции белков БМ, смутно известны.

Для изучения внутриклеточного трафика BM-содержащих везикул и секреции белков BM эпителиальными клетками фолликулярный эпителий (FE) яичника Drosophila является мощной модельной системой (рисунок 1). Яичник дрозофилы содержит 16-20 длинных трубчатых структур, называемых явариолами (рисунок 1A,B)17,18,19. Каждый овариол можно рассматривать как линию сборки яиц с возрастной прогрессией яйцеклеток (каждая из которых дает начало яйцеклетке), которая начинается на переднем конце и движется кзади, пока зрелая яйцеклетка не выйдет через яйцевод. Каждая яйцеклеточная камера инкапсулирована FE, монослоем клеток соматических фолликулов (FC), который окружает клетки центральной зародышевой линии (GC). FE сильно поляризован с отчетливой апикально-базальной полярностью, где апикальный домен обращен к зародышевой линии, а белки BM секретируются базально^18,19. ФК активно секретируют все основные компоненты БМ, включая коллаген IV, перлекан и ламины^20,21. В эпителиальных клетках, таких как FC, компоненты BM вырабатываются и требуют специализированного поляризованного пути секреции для их внеклеточного осаждения. Например, в случае наиболее распространенного компонента БМ, коллагена IV (Coll IV), детали, окружающие его поляризованный внутриклеточный трафик и секрецию, расплывчаты, несмотря на то, что его производство и осаждение находятся в центре внимания многих исследований. Coll IV транслируется в эндоплазматический ретикулум (ER), где каждая фибриля, состоящая из трех полипептидов (две цепи α1 и одна цепь α2), собирается в тройную спираль²². Правильное складывание и функционирование Coll IV требуют ER-шаперонов и ферментов, включая лизил и пролил-гидроксилазы, такие как Plod и PH4αEFB 20,22,23,24,25,26. Эти посттрансляционные ферменты регулируют сортировку ER Coll IV, так как потеря каждого из них приводит к тому, что Coll IV попадает в ловушку в базальном ER 20,23,24,25,26. Затем вновь синтезированный Coll IV выходит из ER для Гольджи в везикулах, покрытых COPII. Грузовой рецептор Tango1 помогает упаковывать коллагены в значительные везикулы, связанные с Гольджи, которые могут вмещать большие многомерные белки^20,27. Как только Coll IV упаковывается во внутриклеточные экзоцитарные везикулы, он специфически секретируется базально из эпителиальных клеток. Чтобы направить отложение БМ на базальную сторону, эпителиальным клеткам требуется другой набор факторов, специально предназначенных для поляризованной секреции БМ. Используя FE яичника Drosophila, были охарактеризованы несколько компонентов этого нового клеточного процесса, включая нуклеотидные обменные факторы (GEFs) Crag and Stratum, GTPasEs Rab8 и Rab10, а также уровни фосфоинозитида PI(4,5)P2 и моторных белков Kinesin 1 и 3 20,28,29,30,31 . Эти компоненты имеют решающее значение для обеспечения поляризованного распределения белков BM.

Для мониторинга внутриклеточной локализации белков BM в FE могут^{быть использованы} эндогенно меченые белки базальной мембраны (белковые ловушки), такие как Viking-GFP (Vkg-GFP или α2 Coll IV-GFP) и Perlecan-GFP (Pcan-GFP). Было показано, что эти линии белковой ловушки точно отражают эндогенное распределение белков BM и позволяют более чувствительно обнаруживать везикулярный трафик^28,30. Компоненты, участвующие в поляризованном осаждении БМ в FE, были впервые охарактеризованы с использованием линий белковых ловушек для Vkg-GFP и Pcan-GFP ^20,28,29,30. Белковые ловушки могут быть использованы в различных генетических фонах, включая мутантов и линии Gal4 ³⁴. Кроме того, белковые ловушки могут быть использованы в комбинации с флуоресцентными красителями и/или флуоресцентным иммуноокрашиванием, что позволяет точно охарактеризовать локализацию белков BM при сравнении условий дикого типа и мутантов³⁵.

Для точной и эффективной оценки распределения и локализации везикул, содержащих белки BM, конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (CLSM) и методы визуализации со сверхвысоким разрешением представляют собой значительное преимущество перед другими подходами к визуализации. Эти подходы сочетают изображения с высоким разрешением с относительной простотой использования. CLSM - это метод микроскопии, который позволяет улучшить оптическое разрешение путем сканирования образца лазером в растровом сканировании с использованием гальванометров. Отверстие с точечным отверстием является основным компонентом конфокального микроскопа. Блокируя нефокусированные сигналы, поступающие сверху или ниже фокальной плоскости, апертура с точечным отверстием приводит к значительному превосходному разрешению по оси^{Z 36}. Это также позволяет получить серию изображений в z-плоскости, называемую z-стеком, соответствующую ряду оптических сечений. z-стеки впоследствии создают 3D-изображение образца с помощью 3D-реконструкции с помощью программного обеспечения для визуализации. Обычные эпифлуоресцентные (широкоугольные) микроскопы, в отличие от конфокальных микроскопов, позволяют расфокусированному свету способствовать качеству изображения, снижению разрешения изображения и контрастности^36,37. Это делает эпифлуоресцентную микроскопию менее привлекательным кандидатом при изучении локализации белка или колокализации.

Хотя CLSM является подходящим подходом для различных применений, включая визуализацию и характеристику внутриклеточного трафика белков BM, он по-прежнему представляет проблему при визуализации образцов ниже дифракционного предела света Аббе (200-250 нм). При визуализации таких образцов конфокальная микроскопия, особенно при использовании масляного объектива, может привести к высокому разрешению. Однако методы сверхвысокого разрешения превышают предел конфокальной микроскопии. Существуют различные подходы к достижению микроскопии со сверхвысоким разрешением, каждый из которых имеет определенные пределы разрешения, и каждый подходит для различных анализов. Эти подходы включают фотоактивированную локализационную микроскопию (PALM) или стохастическую оптическую реконструкционную микроскопию (STORM), микроскопию с стимулированным эмиссионным истощением (STED), структурированную микроскопию освещения (SIM) и микроскопию Airyscan (сверхразрешение) ^{38,39,40,41,42,43,44,45,46} . Хотя Airyscan имеет более грубое разрешение, чем PALM / STORM, STED и SIM, он все же может достигать разрешения до ~ 120 нм (примерно в два раза больше разрешения CLSM). Кроме того, было показано, что этот подход к микроскопии со сверхвысоким разрешением имеет преимущество перед SIM и другими методами сверхвысокого разрешения при визуализации толстых образцов и образцов с низким отношением сигнал/шум^47,48.

Airyscan является относительно новой технологией конфокальной микроскопии сверхвысокального разрешения⁴⁶. В отличие от традиционных CLSM, которые используют точечные и одноточечные детекторы для отклонения нефокусированного света, этот подход со сверхвысоким разрешением использует 32-канальный детектор площади фотоумножителя арсенида галлия (GaAsP), который собирает весь свет в каждой позиции сканирования⁴⁵. Каждый из 32 детекторов работает как небольшое точечное отверстие, уменьшая размер точечного отверстия с традиционного 1.0 Airy Unit (A.U.) до улучшенного 0.2 A.U., обеспечивая еще более высокое разрешение и отношение сигнал/шум, сохраняя при этом эффективность диаметра 1,25 A.U.⁴⁵. Кроме того, линейная деконволюция, используемая Airyscan, приводит к увеличению разрешения⁴⁵ в 2 раза. Принимая это во внимание, CLSM и, в частности, микроскопия со сверхвысоким разрешением хорошо подходят для изучения белков BM и белков, которые регулируют базальное осаждение белков BM, поскольку они могут производить изображения с очень высоким разрешением для исследований локализации и колокализации, тем самым обеспечивая новое понимание пространственных, временных и молекулярных событий, которые контролируют эти процессы.

Альтернативным подходом к конфокальной микроскопии, который может быть использован для проведения экспериментов по локализации, является деконволюция изображений. Поскольку широкоугольная микроскопия позволяет нефокусированному свету достигать детекторов, математические и вычислительные алгоритмы деконволюции могут быть применены для удаления или переназначения нефокусированного света из изображений, полученных с помощью широкоугольной микроскопии, тем самым улучшая разрешение и контрастность изображения⁴⁹. Алгоритмы деконволюции также могут быть применены к конфокальным изображениям для дальнейшего увеличения разрешения и контрастности, создавая конечные изображения, почти сопоставимые с микроскопией сверхвысокого разрешения⁵⁰. Airyscan использует деконволюцию на основе фильтра Вайнера вместе с переназначением пикселей Шеппарда, что приводит к значительно улучшенному пространственному разрешению и соотношению сигнал/шум. По сравнению с конфокальной микроскопией, увеличение разрешения в 2 раза во всех трех пространственных измерениях (120 нм в x и y и 350 нм в z) наблюдается при использовании этого метода микроскопии со сверхвысоким разрешением^45,51.

Эта рукопись содержит подробные и оптимизированные протоколы для окрашивания, получения и визуализации внутриклеточного трафика и осаждения белков BM с использованием FE яичника Drosophila в качестве модельной системы в сочетании с конфокальной микроскопией и микроскопией сверхвысокального разрешения. Линии дрозофилы , экспрессирующие эндогенно меченые белки базальной мембраны, например, Vkg-GFP и Pcan-GFP, являются эффективными и точными инструментами для визуализации трафика и секреции белка BM. Кроме того, они могут быть легко использованы в различных генетических фонах, включая мутантные и Gal4/UAS линии³⁴. Хотя рекомендуются эндогенно помеченные белки базальной мембраны, использование антител против специфических белков BM также совместимо с описанными протоколами. Эти протоколы особенно полезны для ученых, которые заинтересованы в изучении внутриклеточного трафика и секреции белков BM в интактной эпителиальной ткани с использованием конфокальной визуализации и визуализации сверхвысокого разрешения. Более того, способность сочетать анализ эпителиальной ткани с обширными инструментами генетики дрозофилы делает этот подход особенно мощным. Наконец, эти протоколы могут быть легко адаптированы для изучения везикулярного трафика и сортировки других белков, представляющих интерес.

протокол

1. Подготовка мухи к рассечению яичников

1. Поместите 10-15 самок мух Drosophila melanogaster (1-2 дня) нужного генотипа в узкий флакон, содержащий ~8 мл среды Drosophila fly, посыпанный небольшим количеством гранулированных пекарских дрожжей за 2-3 дня до рассечения при 25 °C. Добавление нескольких самцов во флакон может повысить урожайность яйцеклетки. Однако следите за тем, чтобы общее количество мух не превышало 20, так как это может негативно сказаться на развитии яичников.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Описание дрозофилы мужчин и женщин, а также полезные советы и рекомендации для ученых, не имеющих предварительного опыта дрозофилы, можно найти в цитируемых статьях^34,52. Добавление дрожжей будет стимулировать производство яйцеклеток и генерировать яичники с различными представленными стадиями. Кроме того, это также откармливает яичники и облегчает их иссечение. Влажные дрожжи также можно использовать вместо гранулированных дрожжей, однако для более слабых запасов мухи могут застрять и погибнуть.

2. Рассечение и фиксация яичников

ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения дополнительных ресурсов по вскрытию и окрашиванию яичников читатели направляются к цитируемым протоколам 53,54,55.

1. В день вскрытия готовят свежий фиксирующий раствор с конечной концентрацией 4% параформальдегида (PFA) путем разбавления раствора PFA в 1x фосфатном буферном физиологическом растворе (PBS).
2. Обезболивайте мух с помощью CO₂ и поместите их на нахлыстовую площадку. Держите мух под наркозом до рассечения. Рассмотрим мух, должным образом обезболенных, как только их движения прекратились, что обычно занимает 10-20 секунд.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя использование CO₂ рекомендуется как более безопасный и быстрый вариант, мух можно обезболить с помощью льда.
3. Поместите стеклянную вогнутую горку или витражную посуду с неглубокими вдавленными колодцами под рассекающий микроскоп и заполните колодцы 1x PBS.
4. Схватите самку мухи в нижней части грудной клетки, используя пару щипцов. Обеспечить пол мух можно за счет отсутствия мужских гениталий на заднем конце брюшка и отсутствия половых гребней на передних лапах в качестве вторичной характеристики⁵². Рассеченные мухи индивидуально с помощью другой пары щипцов (шаг 2.5), погружая их в скважины, заполненные 1x PBS под рассекающим микроскопом (рекомендуется 20-кратное увеличение).
5. Глядя через рассекающий микроскоп, используйте другую пару щипцов, чтобы потянуть за заднюю часть брюшка мухи, делая видимыми внутренние органы (например, яичники, кишечник).
6. Осторожно сожмите переднюю часть брюшной полости мухи (как с тюбиком зубной пасты), чтобы вытеснить яичники из брюшной полости. Этот метод должен сохранить яичники нетронутыми. Отсоедините и аккуратно удалите другие органы и обломки.
7. Используя щипцы или рассекающие иглы, отделите яичные яичники, сохраняя при этом общую структуру яичника неповрежденной. Целью этого шага является разрушение мышечной оболочки, покрывающей яичники, и обеспечение более эффективного и однородного окрашивания.
8. Быстро перенесите яичники в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл, содержащую 1x PBS, и держите трубку на льду, пока все мухи не будут рассечены. Не держите трубку на льду, если микротрубочки или микрофиламенты (или везикулы, продаваемые этими цитоскелетными компонентами) должны быть визуализированы, так как это может вызвать деполимеризацию.
9. После того, как все яичники рассечены и перенесены в микроцентрифужную трубку, позвольте им опуститься на дно трубки и удалите все, кроме ~ 50 мкл PBS. Добавьте 1 мл 4% PFA и поместите на нутационную платформу коромысла на 15 мин. Важно отметить, что проверьте, движутся ли яичники вперед и назад в растворе для фиксации, чтобы обеспечить надлежащую фиксацию, поскольку неполная фиксация может привести к проблемам с окрашиванием и визуализацией.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость нутатора не имеет решающего значения. В то время как некоторые нутаторы имеют контроль скорости, другие поставляются с предустановленной скоростью. Предустановленная скорость достаточна, а если ее регулировать, то устанавливается на 40-50 об/мин.
10. Удалите раствор для фиксации (как на этапе 2.9), а затем выполните две быстрые промывки с 1 мл 1x PBS, содержащей 0,1% Triton-X 100 (1x PBST), осторожно перевернув микрофьюжные трубки 5-6 раз. Затем приступайте к четырем 10-15-минутным промывкам (длительная стирка) с 1 мл 1x PBST (всего 40-60 мин).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать 1x PBS + 0,1% Triton-X 100 для стирки, так как увеличение процента моющего средства может привести к денатурации GFP, что приведет к снижению флуоресценции и обнаружению помеченных GFP белков BM.
11. Для окрашивания красителем, например, окрашивания ДНК и F-актином, перейдите к этапу 3. Для иммуноокрашения перейдите к шагу 4. Яичники можно хранить в 1x PBST при 4 °C в течение 24 ч, прежде чем продолжить.

3. Стандартное окрашивание ДНК / F-актином

1. После фиксации и стирки удалите ПБСТ. Добавьте 500 мкл ДНК и раствор для окрашивания F-актином. Чтобы приготовить раствор ДНК/F-актина, смешайте Hoechst (окрашивание ДНК; разведение 1:1000 1 мг/мл стокового раствора) и флуорофор-меченый фаллоидин (окрашивание F-актина; разведение 1:500 для Alexa Fluor 546 или разведение 1:100 для Alexa Fluor 647, каждый из 66 мкМ стандартного раствора) в 500 мкл PBST.
2. Накройте трубки алюминиевой фольгой, чтобы держать завязи и красители в темноте, чтобы поддерживать флуоресценцию для эффективной визуализации, и инкубируйте на коромысле нутирующей платформы в течение 15 минут.
3. После инкубации удаляют раствор ДНК/F-актина (как на этапе 2.9). Выполните две быстрые стирки и три длительные (10-15 мин) промывки в 1x PBST, как описано в шаге 2.10. Перейдите к монтажу, как описано в шаге 5.

4. Флуоресцентное иммуноокрашивание

ПРИМЕЧАНИЕ: Это стандартный протокол иммуноокрашивания для флуоресцентной визуализации и совместим с большинством первичных антител.

1. Блокирование и первичное иммуноразрашивание антител (День 1)
   1. После фиксации и стирки удалите PBST, как описано в шаге 2.9. Добавьте 1 мл блокирующего раствора (PBS + 5% BSA) и заблокируйте яичники на коромысле нутирующей платформы минимум на 1 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В дополнение к BSA, к блокирующему раствору может быть добавлена фетальная бычья сыворотка (FBS) или обычная козья сыворотка (NGS). В качестве альтернативы, яичники могут быть заблокированы на ночь на нутирующей платформе-коромысле при 4 °C.
   2. Удаляют блокирующий раствор, как на стадии 2.9, и добавляют 300 мкл раствора первичного антитела, содержащего первичные антитела, разведенные в соответствующих им концентрациях (специфичных для используемого антитела) в блокирующий раствор. Инкубировать в течение ночи на коромысле нутирующей платформы при 4 °C. На следующий день удаляют раствор первичного антитела и приступают к вторичному иммуноокрашиванию антител.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые первичные антитела могут быть сохранены и повторно использованы. В некоторых случаях повторно используемые первичные антитела могут уменьшить фоновое окрашивание, что приводит к улучшению визуализации. Тем не менее, повторное использование должно быть проверено для каждого антитела, чтобы обеспечить эффективность.
2. Вторичное иммуноразрашивание антител (День 2)
   1. После удаления первичного раствора антител выполните две быстрые промывки и четыре длительные (10-15 мин) промывки, как на шаге 2.10. Тщательно выполненные повторяющиеся стирки с использованием свежего 1x PBST уменьшат неспецифический фон и приведут к оптимальной визуализации.
   2. Удалите PBST, как на этапе 2.9, и добавьте 500 мкл раствора вторичных антител, содержащих флуоресцентные вторичные антитела, которые будут обнаруживать используемые первичные антитела. Защитите трубку от света, покрыв ее алюминиевой фольгой с этого момента для оптимального сохранения флуоресценции, что имеет решающее значение для получения и анализа изображений.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор вторичных антител должен содержать вторичные антитела, конъюгированные с флуорофорами, которые не перекрываются с эндогенно мечеными белками. Например, при использовании белков, помеченных GFP, рекомендуется использование вторичных антител Alexa Fluor на красных или дальних красных длинах волн (например, 546, 568 или 647 нм). Флуоресцентные красители, такие как Hoechst и Alexa Fluor 546 или 647 конъюгированный фаллоидин, могут быть добавлены во вторичный раствор. Эти пятна могут быть полезны для обозначения общей структуры клеток (т. Е. Ядер и F-актина). Концентрации см. в стадии 3.1.
   3. Инкубируют яичники в растворе вторичных антител на нутирующей платформе-коромысле в течение 2 ч при комнатной температуре. Выполните две быстрые стирки и четыре длительные (10-15 мин) стирки в 1x PBST, как в шаге 2.10. Приступайте к монтажу, как показано в шаге 5.

5. Монтаж окрашенных яичников

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод работает очень хорошо, если яичники хорошо развиты и обильны. Тщательное крепление яичников на слайде имеет решающее значение для оптимальной визуализации.

1. После последней промывки используйте пипетку p1000, чтобы аккуратно пипетировать яичники вверх и вниз в трубке, чтобы отделить яйцеклетки. Дайте яичным камерам опуститься на дно, удерживая трубку в вертикальном положении в течение 5-10 минут. Тщательное разделение отдельных яичных камер имеет решающее значение для достижения оптимального получения изображения.
2. Удалите PBST с помощью пипетки Пастера, оставив ~50 мкл. Удалите как можно больше оставшегося PBST с помощью пипетки p200. Добавьте две капли монтажной среды, достаточно равномерно распределить на крышке размером 22 мм х 22 мм. Яичники можно хранить в монтажной среде в микроцентрифужных трубках при 4 °C в течение 1 месяца до монтажа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько различных монтажных носителей доступны в продаже; для достижения оптимальных условий визуализации рекомендуется использовать жестко устанавливаемые крепления, такие как Aqua-Poly/Mount или ProLong Glass Antifade Mountant. Использование глицерина в качестве монтажной среды не рекомендуется, поскольку это может привести к плохим условиям визуализации (например, нестабильность флуорофора). Для монтажных сред, которые не полимеризуются, запечатайте крышку с помощью укрывного герметика / лака для ногтей, чтобы закрепить его на месте.
3. Пометьте стеклянный слайд и протрите его мягкой, свободной от пыли бумагой, чтобы удалить пыль и отпечатки пальцев. Отрежьте конец наконечника пипетки p200, чтобы обеспечить легкое перемещение вязкой монтажной среды на затвор из трубки микроцентрифуги. Далее медленно перенесите все яйцеклетки в монтажной среде на стеклянную горку, следя за тем, чтобы не образовались пузырьки.
4. Под рассекающим микроскопом аккуратно распределите монтажную среду и отделите камеры для яиц с помощью нового наконечника p200 или щипцов, чтобы покрыть область размером примерно с крышку.
5. Используя щипцы, аккуратно поместите крышку (очищенную беспыльной бумагой) на камеры яиц под углом, чтобы избежать пузырьков.
6. Храните горку комнатной температуры на ровной поверхности в темноте в течение 2 дней для полимеризации. После отверждения монтажного носителя слайд можно хранить при температуре 4 °C в темноте в течение нескольких недель для визуализации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для жесткой настройки монтажной среды важно полимеризовать перед визуализацией. Если среда еще не полимеризовалась, яичники будут плавать под крышкой, влияя на получение изображения. Более того, оптимальный отражающий показатель монтажного материала достигается только после того, как он полностью установится (подробности см. в информации производителя).
7. Альтернативный метод монтажа: Этот метод рекомендуется для уменьшения потери тканей, если яичники не обильны. В этом способе (описанном ниже) отделяют овариолы и яйцеклетки камеры на слайде во время монтажа, вместо того, чтобы разделять их в микроцентрифужной трубке путем пипетирования, как описано на этапе 5.1.
   1. После последней стирки удалите все, кроме ~100 мкл моющего раствора. Используя пипетку Пастера или пипетку p1000, перенесите неповрежденные яичники в PBS на слайд. Используя пипетку p200, осторожно удалите как можно больше PBST с слайда. При необходимости используйте беспыльную бумагу, чтобы вытереть PBST. Не трогайте яичники.
   2. Добавьте две капли монтажного носителя. Тщательно отделите яйцеклетки и яйцеклетки с помощью щипцов или рассекающих игл. Удалите и выбросьте постороннюю ткань, а затем распределите яйцеклетки и яичные камеры и яириолы в монтажной среде. Перейдите к шагам 5.5-5.6.

6. Конфокальное получение изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе приведены ключевые параметры для достижения оптимального получения изображения с помощью любого конфокального микроскопа (рисунок 2).

1. Настройте микроскоп и найдите образец, как описано ниже.
   1. Перед визуализацией крайне важно найти интересующую область (ROI) с помощью окуляра флуоресцентного микроскопа. Используйте объектив с низким увеличением (20x) или объектив, который будет использоваться для получения изображения (т.е. 40x или 63x). Выберите камеру яйца для изображения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения изображений рекомендуется использовать объективы с высоким увеличением, такие как 40x или 63x (см. 6.2.1).
   2. После выбора ROI перейдите к получению изображения; Перейдите к шагу 6.2 для конфокальной визуализации и шагу 7 для визуализации со сверхвысоким разрешением.
2. Выберите ключевые параметры для оптимального получения изображения, как описано ниже (примеры ключевых параметров для репрезентативных изображений приведены в таблице 1).
   1. Выбор цели: Для получения конфокального изображения внутриклеточного трафика и секреции белков BM в FE используйте объектив 40x или 63x.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения наилучшего возможного разрешения настоятельно рекомендуется использовать объективы Plan-Apochromat с высокой числовой апертурой (NA), которые обеспечивают наивысшую ахроматическую коррекцию.
   2. Выбор лазеров для каждого канала/трека: Для GFP используйте лазер 488 нм; для DAPI или Hoechst используйте лазер 405 нм; для Alexa Fluor 546 или 568 используйте лазер 561 нм; а для Alexa Fluor 647 используйте лазер 640 нм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый лазерный выбор приведет к образованию другого канала / трека. Здесь термин канал относится к изображению, образованному записанным распределением интенсивности для возбужденных флуорофоров для выбранной ROI на определенной длине волны каждого канала.
   3. Настройка pinhole: Чтобы уменьшить рассеянный свет во время получения изображения, установите точечное отверстие для каждого канала на 1 а.е.
   4. Настройки интенсивности и усиления детектора: для тонкой настройки чувствительности изображения используйте как усиление мастера детектора, так и мощность лазера. Для правильной настройки чувствительности изображения рекомендуется использовать индикатор диапазона. Установите как основной коэффициент усиления, так и мощность лазера, чтобы иметь надлежащую чувствительность там, где интересующие структуры (например, BM-содержащие везикулы) хорошо видны, избегая насыщения детектора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать фотоотбеливания, используйте необходимую минимальную мощность лазера. Рекомендуется сначала увеличить коэффициент усиления детектора при использовании минимально возможной мощности лазера. Если увеличение усиления детектора не может достичь желаемой интенсивности, то увеличьте мощность лазера. Рекомендуется интенсивность мощности лазера от 0,5% до 1,2%.
   5. Размер кадра: рекомендуется использовать оптимальный размер изображения, определенный программным обеспечением для сбора. Для большинства приложений используйте максимальное разрешение 1024 x 1024. Более высокое разрешение значительно увеличит время приобретения.
   6. Скорость сканирования: используйте скорость сканирования от 6 до 9, что безопасно для большинства образцов. Если образец шумный, используйте более медленную скорость сканирования для улучшения соотношения сигнал/шум. Однако низкая скорость сканирования увеличивает время фотоотбеливания и захвата.
   7. Усреднение средней интенсивности: для улучшения качества изображения используйте усреднение средней интенсивности с помощью последовательных сканирований с идентичными настройками. В большинстве случаев используйте усреднение двух для улучшения соотношения сигнал/шум без фотоотбеливания образца.
   8. Масштабирование: отрегулируйте область сканирования с помощью функции масштабирования. Используйте масштабирование между 2x-4x с целями 40x и 63x в качестве наиболее эффективного значения для четкой визуализации BM-содержащих везикул в FE. Тщательно выбирайте минимальную рентабельность инвестиций, чтобы сократить время приобретения.
3. Чтобы получить z-стек с помощью программного обеспечения Zeiss Zen, используйте следующие параметры Z-секционирования и задайте их, как описано ниже.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Везикулы и другие внутриклеточные структуры, содержащие белки BM, являются 3-мерными (3D) структурами. Приобретение z-стека через FE значительно улучшит качество и разрешение изображения. Обычно диапазон, охватывающий толщину/ глубину ткани, достаточен для эффективной визуализации внутриклеточной локализации. Для оптимальной 3D-реконструкции рекомендуется использовать оптимальный интервал, который определяется программным обеспечением. Для целей 40x и 63x избегайте интервалов выше 0,5 мкм между каждым z-секцией, чтобы обеспечить оптимальную 3D-реконструкцию.
   1. Установите флажок z-Stack в главной области на вкладке Приобретение . Выберите режим сканирования «Все дорожки на фрагмент» для z-стека. Это приведет к изменению дорожек канала для каждого фрагмента z-позиции.
   2. Выберите нужный канал для наблюдения за образцом и нажмите Live, чтобы начать сканирование в реальном времени. Рекомендуется использовать канал, необходимый для обнаружения белка BM, помеченного GFP.
   3. Задайте диапазон для z-стека, как описано выше. Используя ручку тонкой регулировки на микроскопе, найдите z-местоположение для одного конца образца и нажмите «Установить первым». Аналогичным образом найдите z-расположение для другого конца образца и нажмите «Установить последний».
   4. Для каждого местоположения в z-стеке нажмите на каждый канал отдельно с выбранным индикатором диапазона и отрегулируйте интенсивность лазера и коэффициент усиления мастера по мере необходимости, как описано в шаге 6.2.4.
   5. Установите интервал для z-стека, чтобы назначить размер шага, как рекомендовано в ПРИМЕЧАНИИ ниже шага 6.3. Щелкните Начать эксперимент, чтобы начать сбор z-стека.

7. Получение изображения со сверхвысоким разрешением

1. Выберите объектив, совместимый с Airyscan. Для визуализации внутриклеточной локализации белка BM оптимально использовать 63-кратный масляный объектив (рисунок 3). Установите объектив на 63x и аккуратно поместите каплю погружного масла на объектив. Расположите слайд на объективе с крышкой, обращенной к объективу, чтобы найти образец.
2. Выберите конфигурацию с соответствующими параметрами для флуорофора, как описано ниже.
   1. Нажмите кнопку Smart Setup на вкладке Приобретение , чтобы настроить новый эксперимент. Выберите Airyscan (сверхвысокое разрешение); если этот параметр выбран, потребуется дальнейший выбор между разрешением (Airyscan SR), SNR/чувствительностью (Airyscan Confocal) и скоростью (Multiplex SR-2Y). Для фиксированной ткани выберите Разрешение , так как это приведет к лучшему приобретению.
   2. Нажмите кнопку + в поле Настроить эксперимент, чтобы добавить треки/каналы. Выберите дорожки для определенных красителей из базы данных красителей. Для многоканального эксперимента добавьте каждый трек по мере необходимости, выбрав соответствующие красители.
   3. После того, как все треки будут добавлены, выберите одно из предложений эксперимента, предоставляемых программным обеспечением. Для этого эксперимента используйте Best Signal, так как, хотя скорость будет немного медленнее по сравнению с предложением Smartest (Line), он создаст лучшие аппаратные настройки для каждого красителя, что приведет к максимальному усилению сигнала и минимальному излучению перекрестных помех. После установки и загрузки эксперимента он появится в окне Настройка образа на вкладке Приобретение.
   4. После выбора интеллектуальной настройки автоматически будет выбран диапазон длин волн для детектора GaAsP-PMT. Отрегулируйте диапазон, переместив полосу прокрутки внизу, чтобы увеличить или уменьшить диапазон или полностью переместить диапазон в другую область по мере необходимости. Используйте это, чтобы убедиться, что диапазоны двух разных каналов не перекрываются, чтобы избежать перекрестных помех. Сохраните конфигурацию для повторного использования в будущем.
3. После установки конфигурации перейдите к настройке области масштабирования и сканирования, как показано в шаге 6.2.8. Оптимизируйте область сканирования, чтобы сосредоточиться на интересующей области, чтобы сократить время сканирования и пространство для хранения. Переходите к получению изображений.
4. Для каждого отдельного канала выберите трек в разделе «Канал» и нажмите « Live». Отрегулируйте коэффициент усиления и мощность лазера с помощью инструмента индикатора дальности, как описано в шаге 6.2.4, и следуйте всем описанным рекомендациям, чтобы избежать насыщенных пикселей. Убедитесь, что гексагональный вид детектора центрирован и выровнен, нажав кнопку Airyscan Detector View . В большинстве случаев вид шестиугольного детектора автоматически центрируется и выравнивается. Повторите для дополнительных каналов.
5. В окне переключения режима получения в разделе Размер изображения щелкните SR (количество пикселей с ограниченным сверхвысоким разрешением), чтобы максимизировать возможности детектора. Это автоматически отрегулирует размер кадра.
6. Сохраните усреднение в None , так как обычно это не нужно, и это уменьшит время сканирования. В некоторых случаях усреднение в 2 раза может улучшить отношение сигнал/шум.
7. Собирайте необработанные данные с глубиной 8 бит данных. Нажмите на Snap , чтобы получить изображение. Чтобы получить z-стек, выполните шаг 6.3.
8. Выполните обработку изображений, как описано ниже. Это приведет к созданию 16-битного образа.
   1. После получения изображения или z-стека нажмите на Метод обработки > и выберите Обработка Airyscan.
   2. Выполните автоматический фильтр для начала и выполните дальнейшую ручную обработку, изменив значение SR для получения наилучших результатов для образца. После определения оптимального значения SR нажмите кнопку Применить , чтобы создать обработанное изображение. В случае изображений z-стека обрабатывайте либо как один z-срез (Current Image [2D]), либо как весь z-стек, щелкнув поле 3D-обработка .

8. Обработка изображений и анализ данных (ортогональная проекция, 3D реконструкция и профиль интенсивности)

ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого метода шаги, используемые для создания ортогональных проекций, 3D-реконструкций и профилей интенсивности, описаны для программного обеспечения Zen (см. Таблицу материалов). Аналогичный анализ данных также может быть выполнен с помощью программного обеспечения^{ImageJ 56}.

1. Выполните ортогональную проекцию, как описано ниже (рисунок 4).
   1. После того, как z-стек был получен с использованием конфокальной или сверхвысокой микроскопии, сгенерируйте ортогональную проекцию для просмотра везикул в оси Z клетки в 2D-виде (по сравнению с 3D-реконструкцией). Для этого нажмите на Метод обработки > и выберите Ортогональная проекция.
   2. В разделе Параметры выберите требуемую плоскость проекции. Для проекции оси Z (z-стек) выберите фронтальную (XY) плоскость. В разделе Метод выберите Максимум , чтобы получить проекцию высочайшего качества.
   3. Далее определите толщину проекции, выбрав исходное положение (стартовый z-срез), и определите толщину (общее количество z-срезов) в проекции. Идеально выбрать толщину, равную толщине одной ячейки по оси z.
   4. После того, как параметры были заданы, нажмите кнопку Применить , чтобы создать проекцию z-стека в плоскости XY.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При создании ортогональных проекций из нескольких z-стеков для сравнения количества конкретного интересующего объекта крайне важно сохранить толщину проекции одинаковой (или как можно ближе) для точности данных.
2. Выполните 3D-реконструкцию, как описано ниже (рисунок 5).
   1. Создавайте 3D-реконструкции z-стеков для наблюдения за локализацией и формой структур. Сделайте это для z-стеков, полученных с использованием конфокальных подходов и подходов сверхразрешения. Сначала обработайте z-стеки сверхвысокого разрешения, используя 3D-обработку, как в шаге 7.8 для 3D-реконструкции.
   2. Чтобы сгенерировать 3D-изображение, нажмите на значок 3D в окне предварительного просмотра. После нажатия кнопки 3D-вкладка появится в разделе управления отображением в нижней половине экрана. Будут видны 3D-виды, такие как «Прозрачность», «Громкость», «Максимум», «Поверхность» и «Смешанные». Используйте поверхностный или смешанный виды при просмотре структуры везикул (предпочтительно).
   3. Для получения изображения высочайшего качества выберите Параметр Точность , так как самая быстрая настройка будет менее точной и приведет к плохому 3D-рендерингу.
   4. После создания изображения управляйте им, поворачивая и увеличивая масштаб, чтобы сфокусироваться на предпочтительном месте для просмотра интересующих объектов. Управляйте 3D-изображением на вкладке «Внешний вид ».
   5. После получения удовлетворительного изображения на вкладке 3D выберите Отображаемое разрешение, а затем нажмите « Создать изображение». Это создаст снимок изображения в той же ориентации, в которой оно было просмотрено, и может быть сохранено и экспортировано в различных форматах файлов.
3. Сгенерируйте профиль интенсивности, как описано ниже (рисунок 7).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Профили распределения и интенсивности пикселей, связанных с различными флуоресцентными сигналами, можно рассматривать как наложенное изображение для определения их колокализации.
   1. После получения оптимального изображения с помощью изображения с конфокальным или сверхвысоким разрешением на панели «Вид» окна предварительного просмотра нажмите « Профиль». В окне предварительного просмотра появится гистограмма, отображающая профиль интенсивности в зависимости от расстояния, а также таблица с указанием расстояний и значений интенсивности.
   2. В области элементов управления отображением в нижней части экрана щелкните инструмент «Стрелки» на вкладке «Определение профиля ». Нарисуйте стрелку вдоль длины объекта, для которого необходимо оценить профиль интенсивности различных пикселей. Чтобы нарисовать стрелку, увеличьте масштаб изображения.
   3. Профиль интенсивности появится слева от предварительного просмотра изображения, где будет отображаться расстояние и соответствующие пики по пути стрелки. Чтобы удалить гистограмму, отображаемую на самом изображении, снимите флажок Показать профиль в графике .
   4. На вкладке Размеры в области управления отображением снимите флажки с каналов, которые не должны быть включены в профиль интенсивности.
   5. На вкладке Графика дважды щелкните Профиль , отображаемый в поле Аннотации/Измерения , чтобы открыть всплывающее окно Формат графических элементов . Используйте это для изменения цвета стрелки, а также ее стиля и толщины обводки. Закройте окно после выбора нужных настроек.
   6. Перейдите на вкладку Просмотр профиля . В разделе нового изображения щелкните Текущее представление , а затем Сохранить как , чтобы сохранить файл. Рекомендуется сохранить файл в виде файла .tif, чтобы избежать сжатия и потери данных.

Результаты

Способы, описанные в настоящем описании, могут быть использованы для эффективного и точного изображения и характеристики внутриклеточного трафика и секреции белков BM в поляризованных эпителиальных клетках, таких как FE яичника Drosophila . Далее мы предоставляем ожидаемые результаты, ...

Обсуждение

БМ имеет решающее значение для эмбрионального и органного морфогенеза, а также физиологических функций взрослых. Кроме того, БМ выступает в качестве сигнальной платформы для установления и поддержания эпителиальной полярности и обеспечивает тканям поддержку². Тем не мен?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 546 phalloidin	Invitrogen	A22283	F-Actin Stain (1/500 of 66µM)
Alexa Fluor 647 phalloidin	Invitrogen	A22287	F-Actin Stain (1/100 of 66µM))
Anti-GM130 Antibody	abcam	ab30637	For Golgi Stain (colocalization); use as concentration of 7µg/uL
Aqua-Polymount	Polysciences, Inc.	1860620	Mounting Medium
Bakers Yeast (Active Dry Yeast)	Genesee Scientific	62-103	To fatten the overies for dissection
Bovine Serum Albumin (30% solution)	Sigma-Aldrich	A7284	For blocking solution
Depression wells	Electron Microscopy Sciences	7156101	For dissection (glass concavity slide can be used instead)
Dissecting needle	Fisher scientifc	13-820-024
Drosophila Incubator	Genesee Scientific/Invictus
Fly Stock: Perlecan-GFP Drosophila line (ZCL1700)			Morin et al., 2001
Fly Stock: UAS-Crag RNAi line (TRIP line HMS00241)	Bloomington Drosophila Stock Center	33594	RNAi against Crag
Fly Stock: Viking-GFP Drosophila line (CC00791)			Buszczak et al., 2007
Fly Stock: Vkg-GFP, tj-Gal4			Devergne et al., 2017. Drive the expression of Crag RNAi in the FE
Forceps (Dumont 5)	Fine Science Tools	11251-30	For dissection
Glass Concavity Slide	Electron Microscopy Sciences	7187804	For dissection (depression wells can be used instead)
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568	Invitrogen	A11036	Secondary antibody (GM130 antibody) (5 µg/mL)
Hoechst (Hoechst 33342)	Invitrogen	H3570	DNA Stain (1 ug/mL)
Kimwipes	Kimtech	Fisher Scientific: 06-666	Delicate task wipers
Leica Fluorescent Stereo Microscope  M165 FC	Leica		For ovary imaging
Microscope Slides	Corning	294875X25	Microscope Slides
Nutating platform rocker	Corning Life Sciences	6720	For ovary fixation and staining
Nutri-Fly BF	Genesee Scientific	66-121	Fly Food
Paraformaldehyde 20% Solution	Electron Microscopy Sciences	Fisher Scientific: 15713	For PFA 4%
Phosphate Buffered Saline Tablets	Fisher scientific	BP2944100	For PBS solution
ProLong Glass Antifade Mountant	Invitrogen	P36980	Mounting Medium
Square Cover Glass	Corning	285022	Cover glass for microscope slides
Triton x-100	Sigma-Aldrich	9036-19-5	For PBST
Zeiss LSM 900 with Airyscan 2	Zeiss		Confocal and super-resolution Microscope
Zeiss Stemi 305 Stereo Microscope	Zeiss		Dissecting microscope
Zeiss Zen Software version 3.3 (Blue Edition)	Zeiss		Image acquisition and processing