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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

La membrana basale è essenziale per la morfogenesi dei tessuti e degli organi durante lo sviluppo. Per comprendere meglio i meccanismi che portano al corretto posizionamento di questa struttura, il protocollo presentato descrive i metodi per visualizzare e caratterizzare il traffico intracellulare e la secrezione di proteine della membrana basale nelle cellule epiteliali utilizzando la microscopia confocale e super-risoluzione.

Abstract

La membrana basale (BM) - un foglio specializzato di matrice extracellulare presente sul lato basale delle cellule epiteliali - è fondamentale per l'istituzione e il mantenimento della morfologia del tessuto epiteliale e della morfogenesi degli organi. Inoltre, il BM è essenziale per la modellazione dei tessuti, fungendo da piattaforma di segnalazione e fornendo forze esterne per modellare tessuti e organi. Nonostante i molti ruoli importanti che il BM svolge durante il normale sviluppo e le condizioni patologiche, le vie biologiche che controllano il traffico intracellulare di vescicole contenenti BM e come la secrezione basale porta alla deposizione polarizzata delle proteine BM sono scarsamente comprese. L'epitelio follicolare dell'ovaio Drosophila è un eccellente sistema modello per studiare la deposizione basale delle proteine di membrana BM, in quanto produce e secerne tutti i principali componenti del BM. L'imaging confocale e a super-risoluzione combinato con l'elaborazione delle immagini in tessuti fissi consente l'identificazione e la caratterizzazione di fattori cellulari specificamente coinvolti nel traffico intracellulare e nella deposizione di proteine BM. Questo articolo presenta un protocollo dettagliato per la colorazione e l'imaging di vescicole contenenti BM e BM depositato utilizzando proteine marcate endogenamente nell'epitelio follicolare dell'ovaio Drosophila . Questo protocollo può essere applicato per affrontare questioni sia qualitative che quantitative ed è stato sviluppato per ospitare lo screening ad alto rendimento, consentendo l'identificazione rapida ed efficiente dei fattori coinvolti nel traffico intracellulare polarizzato e nella secrezione di vescicole durante lo sviluppo del tessuto epiteliale.

Introduzione

La membrana basale (BM) è un sottile foglio di matrice extracellulare aderente alle cellule stratificate (ECM) fondamentale per la struttura epiteliale e la morfogenesi1. Comprende ~ 50 proteine e si trova ubiquitariamente alla base delle cellule epiteliali ed endoteliali e delle cellule del muscolo scheletrico, liscio e cardiaco e degli adipociti 1,2,3. I tre componenti principali del BM sul lato basale delle cellule epiteliali sono Collagen IV, Perlecan e Laminine. Il BM è alla base delle cellule epiteliali ed è responsabile di molte funzioni, tra cui la separazione e la barriera dei tessuti, la crescita e il supporto e la polarizzazione cellulare 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Il suo ruolo di piattaforma di segnalazione regola la morfologia e la differenziazione delle cellule epiteliali e dei tessuti durante lo sviluppo 3,13,14. Inoltre, l'errata regolazione del BM e/o una violazione della sua integrità sono le cause primarie di molte condizioni patologiche, tra cui le metastasi tumorali 2,15,16. Nonostante le funzioni essenziali svolte dal BM durante la morfogenesi tissutale e d'organo, i componenti delle vie biologiche dedicate al traffico intracellulare polarizzato e alla secrezione di proteine BM sono vagamente note.

Per studiare il traffico intracellulare di vescicole contenenti BM e la secrezione di proteine BM da parte delle cellule epiteliali, l'epitelio follicolare (FE) dell'ovaio Drosophila è un potente sistema modello (Figura 1). Un'ovaia di Drosophila comprende 16-20 strutture lunghe simili a tubi, chiamate ovarioli (Figura 1A,B)17,18,19. Ogni ovariole può essere pensato come una catena di montaggio dell'uovo, con la progressione dell'età delle camere dell'uovo (che danno origine a ciascuna un uovo) che inizia all'estremità anteriore e si muove posteriormente, fino a quando l'uovo maturo esce attraverso l'ovidotto. Ogni camera uovo è incapsulata dal FE, un monostrato di cellule follicolari somatiche (FC), che circonda le cellule germinali centrali (GC). Il FE è altamente polarizzato con una distinta polarità apicale-basale in cui il dominio apicale è rivolto verso la linea germinale e le proteine BM sono secrete basalmente18,19. I FC secernono attivamente tutti i principali componenti del BM, tra cui Collagen IV, Perlecan e Laminins 20,21. Nelle cellule epiteliali come le FC, i componenti BM sono prodotti e richiedono una via di secrezione polarizzata specializzata per la loro deposizione extracellulare. Ad esempio, nel caso del componente più abbondante del BM, collagene IV (Coll IV), i dettagli che circondano il suo traffico intracellulare polarizzato e la secrezione sono vaghi nonostante la sua produzione e deposizione siano al centro di molti studi. Coll IV è tradotto nel reticolo endoplasmatico (ER), che è anche dove ogni fibrilla - composta da tre polipeptidi (due catene α1 e una catena α2) - è assemblata in una tripla elica22. Il corretto ripiegamento e funzione di Coll IV richiedono chaperoni ed enzimi ER, tra cui lisil e prolil-idrossilasi come Plod e PH4αEFB 20,22,23,24,25,26. Questi enzimi post-traduzionali regolano lo smistamento ER di Coll IV, poiché la perdita di ciascuno fa sì che Coll IV sia intrappolato nell'ER basale 20,23,24,25,26. Quindi, il Coll IV appena sintetizzato esce dal pronto soccorso per il Golgi in vescicole rivestite copiose. Il recettore di carico Tango1 aiuta a confezionare i collageni in vescicole legate al Golgi di grandi dimensioni che possono ospitare grandi proteine multimeriche20,27. Una volta che Coll IV è confezionato in vescicole esocitiche intracellulari, viene specificamente secreto basalmente dalle cellule epiteliali. Per dirigere la deposizione di BM sul lato basale, le cellule epiteliali richiedono un altro insieme di fattori specificamente dedicati alla secrezione di BM polarizzata. Utilizzando il FE dell'ovaio Drosophila, sono stati caratterizzati alcuni componenti di questo nuovo processo cellulare, tra cui i fattori di scambio nucleotidico (GEF) Crag e Stratum, le GTPasi Rab8 e Rab10, nonché i livelli del fosfoinositide PI(4,5)P2 e le proteine motorie Kinesin 1 e 3 20,28,29,30,31 . Questi componenti sono fondamentali per garantire la distribuzione polarizzata delle proteine BM.

Per monitorare la localizzazione intracellulare delle proteine BM nella FE, possono essere utilizzate proteine di membrana basale endogenamente marcate (trappole proteiche), come Viking-GFP (Vkg-GFP o α2 Coll IV-GFP) e Perlecan-GFP (Pcan-GFP)32,33. Queste linee di trappola proteica hanno dimostrato di riflettere accuratamente la distribuzione endogena delle proteine BM e consentono un rilevamento più sensibile del traffico vescicolare28,30. I componenti coinvolti nella deposizione polarizzata di BM nel FE sono stati inizialmente caratterizzati utilizzando linee di trappola proteica per Vkg-GFP e Pcan-GFP 20,28,29,30. Le trappole proteiche possono essere utilizzate in diversi background genetici, compresi i mutanti e le linee Gal4 34. Inoltre, le trappole proteiche possono essere utilizzate in combinazione con coloranti fluorescenti e/o immunocolorazione a fluorescenza, consentendo una caratterizzazione precisa della localizzazione delle proteine BM quando si confrontano le condizioni wild-type e mutanti35.

Per valutare in modo accurato ed efficiente la distribuzione e la localizzazione delle vescicole contenenti proteine BM, la microscopia a scansione laser confocale (CLSM) e le tecniche di imaging a super-risoluzione presentano un vantaggio significativo rispetto ad altri approcci di imaging. Questi approcci accoppiano l'imaging ad alta risoluzione con una relativa facilità d'uso. CLSM è una tecnica di microscopia che consente una migliore risoluzione ottica scansionando il campione con un laser in modo raster utilizzando galvanometri. L'apertura stenopeica è un componente fondamentale di un microscopio confocale. Bloccando i segnali fuori fuoco provenienti da sopra o sotto il piano focale, l'apertura stenopeica si traduce in una risoluzione altamente superiore nell'asse z36. Ciò consente anche di ottenere una serie di immagini nel piano z, chiamato z-stack, corrispondente a una serie di sezioni ottiche. Z-stacks crea successivamente un'immagine 3D del campione, tramite ricostruzione 3D, con l'ausilio di software di imaging. I microscopi a epifluorescenza (widefield) convenzionali, a differenza dei microscopi confocali, consentono alla luce sfocata di contribuire alla qualità dell'immagine, diminuendo la risoluzione dell'immagine e il contrasto36,37. Ciò rende la microscopia a epifluorescenza un candidato meno attraente quando si studia la localizzazione o la colocalizzazione delle proteine.

Sebbene CLSM sia un approccio adatto per varie applicazioni, tra cui l'imaging e la caratterizzazione del traffico intracellulare di proteine BM, presenta ancora un problema quando si visualizzano campioni al di sotto del limite di diffrazione della luce di Abbe (200-250 nm). Quando si esegue l'imaging di tali campioni, la microscopia confocale, specialmente quando si utilizza un obiettivo ad olio, può portare ad un'alta risoluzione. Tuttavia, le tecniche di super-risoluzione superano il limite della microscopia confocale. Esistono vari approcci per ottenere la microscopia a super-risoluzione, ognuno con limiti di risoluzione specifici e ciascuno appropriato per analisi diverse. Questi approcci includono microscopia di localizzazione fotoattivata (PALM) o microscopia di ricostruzione ottica stocastica (STORM), microscopia a deplezione di emissione stimolata (STED), microscopia a illuminazione strutturata (SIM) e microscopia Airyscan (super-risoluzione) 38,39,40,41,42,43,44,45,46 . Sebbene Airyscan abbia una risoluzione più grossolana di PALM / STORM, STED e SIM, può comunque raggiungere una risoluzione fino a ~ 120 nm (circa il doppio della risoluzione di CLSM). Inoltre, questo approccio di microscopia a super-risoluzione ha dimostrato di avere un vantaggio rispetto alla SIM e ad altre tecniche di super-risoluzione quando si visualizzano campioni spessi e campioni con un basso rapporto segnale-rumore47,48.

Airyscan è una tecnologia di microscopia confocale a super-risoluzione relativamente nuova46. A differenza dei CLSM tradizionali, che utilizzano i rilevatori stenopeici e a punto singolo per respingere la luce fuori fuoco, questo approccio a super-risoluzione utilizza un rilevatore di area del tubo fotomoltiplicatore a 32 canali di fosfuro di arseniuro di gallio (GaAsP) che raccoglie tutta la luce in ogni posizione di scansione45. Ciascuno dei 32 rivelatori funziona come un piccolo foro stenopeico, riducendo le dimensioni del foro stenopeico dalla tradizionale 1.0 Airy Unit (A.U.) a una maggiore 0.2 A.U., consentendo una risoluzione e un rapporto segnale-rumore ancora più elevati, pur mantenendo l'efficienza di un diametro 1.25 A.U.45. Inoltre, la deconvoluzione lineare utilizzata da Airyscan si traduce in un aumento fino a 2 volte della risoluzione45. Tenendo conto di ciò, i CLSM, e in particolare la microscopia a super-risoluzione, sono adatti per studiare le proteine BM e le proteine che regolano la deposizione basale delle proteine BM, in quanto possono produrre immagini ad altissima risoluzione per studi di localizzazione e colocalizzazione, fornendo così nuove intuizioni sugli eventi spaziali, temporali e molecolari che controllano questi processi.

Un approccio alternativo alla microscopia confocale che può essere utilizzato per eseguire esperimenti di localizzazione è la deconvoluzione delle immagini. Poiché la microscopia a largo campo consente alla luce fuori fuoco di raggiungere i rivelatori, è possibile applicare algoritmi di deconvoluzione matematica e computazionale per rimuovere o riassegnare la luce fuori fuoco dalle immagini ottenute con la microscopia a campo largo, migliorando così la risoluzione e il contrasto dell'immagine49. Gli algoritmi di deconvoluzione possono essere applicati anche alle immagini confocali per aumentare ulteriormente la risoluzione e il contrasto, producendo immagini finali quasi paragonabili a quelle della microscopia a super-risoluzione50. Airyscan utilizza la deconvoluzione basata sul filtro Weiner insieme alla riassegnazione dei pixel di Sheppard, con conseguente miglioramento della risoluzione spaziale e del rapporto segnale-rumore. Rispetto alla microscopia confocale, si osserva un aumento di 2 volte della risoluzione in tutte e tre le dimensioni spaziali (120 nm in x e y e 350 nm in z) quando si utilizza questa tecnica di microscopia a super-risoluzione 45,51.

Questo manoscritto fornisce protocolli dettagliati e ottimizzati per macchiare, acquisire e visualizzare il traffico intracellulare e la deposizione di proteine BM utilizzando il FE dell'ovaio Drosophila come sistema modello accoppiato con microscopia confocale e super-risoluzione. Le linee di Drosophila che esprimono proteine di membrana basale endogenamente etichettate, ad esempio Vkg-GFP e Pcan-GFP, sono strumenti efficienti e accurati per visualizzare il traffico e la secrezione di proteine BM. Inoltre, possono essere facilmente utilizzati in diversi background genetici, tra cui mutanti e Gal4 / UAS linee34. Sebbene si raccomandino proteine di membrana basale marcate endogenamente, l'uso di anticorpi contro specifiche proteine BM è anche compatibile con i protocolli descritti. Questi protocolli sono particolarmente utili per gli scienziati interessati a studiare il traffico intracellulare e la secrezione di proteine BM nel tessuto epiteliale intatto utilizzando l'imaging confocale e super-risoluzione. Inoltre, la capacità di combinare l'analisi del tessuto epiteliale con gli strumenti espansivi della genetica Drosophila rende questo approccio particolarmente potente. Infine, questi protocolli potrebbero essere facilmente adattati per studiare il traffico vescicolare e lo smistamento di altre proteine di interesse.

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Protocollo

1. Preparazione della mosca per le dissezioni ovariche

  1. Mettere 10-15 mosche femmine di Drosophila melanogaster (1-2 giorni) del genotipo desiderato in una fiala stretta contenente ~ 8 mL di Drosophila fly medium cosparsa con una piccola quantità di lievito di birra granulato 2-3 giorni prima della dissezione a 25 °C. L'aggiunta di alcuni maschi alla fiala può aumentare la resa della camera delle uova. Tuttavia, assicurarsi che il numero totale di mosche non superi 20 in quanto ciò può influire negativamente sullo sviluppo delle ovaie.
    NOTA: Descrizione di Maschi e femmine di Drosophila e consigli utili e consigli per gli scienziati senza precedente esperienza di Drosophila possono essere trovati negli articoli citati34,52. L'aggiunta di lievito stimolerà la produzione di uova e genererà ovaie con diversi stadi rappresentati. Inoltre, ingrasserà anche le ovaie e le renderà più facili da asportare. Il lievito umido può anche essere usato al posto del lievito granulato, tuttavia, per le scorte più deboli, le mosche possono rimanere bloccate e morire.

2. Dissezione e fissazione delle ovaie

NOTA: Per ulteriori risorse sulla dissezione e la colorazione delle ovaie, i lettori sono indirizzati ai protocollicitati 53,54,55.

  1. Il giorno della dissezione, preparare una soluzione di fissazione fresca con una concentrazione finale di paraformaldeide al 4% (PFA) diluendo la soluzione madre di PFA in 1x soluzione salina tampone fosfato (PBS).
  2. Anestetizzare le mosche usando CO2 e posizionarle su un fly pad. Tenere le mosche anestetizzate fino alla dissezione. Considera le mosche correttamente anestetizzate una volta che i loro movimenti sono cessati, che di solito richiede 10-20 s.
    NOTA: Sebbene l'uso di CO2 sia raccomandato come opzione più sicura e veloce, le mosche possono essere anestetizzate usando il ghiaccio.
  3. Posizionare un vetrino concavo o un piatto colorante con pozzetti di depressione poco profondi sotto un microscopio di dissezione e riempire i pozzetti con 1x PBS.
  4. Afferra una mosca femmina al torace inferiore usando un paio di pinze. Garantire il sesso delle mosche dall'assenza di genitali maschili all'estremità posteriore dell'addome e dall'assenza di pettini sessuali sulle zampe anteriori come caratteristica secondaria52. Sezionare le mosche individualmente usando un altro paio di pinze (passo 2.5) mentre le immerge in pozzetti riempiti con 1x PBS sotto il microscopio di dissezione (si raccomanda un ingrandimento 20x).
  5. Mentre guardi attraverso il microscopio di dissezione, usa un altro paio di pinze per tirare la parte posteriore dell'addome della mosca, rendendo visibili gli organi interni (ad esempio, ovaie, intestino).
  6. Spremere delicatamente la parte anteriore dell'addome della mosca (come con un tubo di dentifricio) per costringere le ovaie a uscire dall'addome. Questo metodo dovrebbe mantenere intatte le ovaie. Staccare e rimuovere con cura altri organi e detriti di mosca.
  7. Usando pinze o aghi di dissezione, separare gli ovarioli dell'ovaio mantenendo intatta la struttura ovarica complessiva. Lo scopo di questo passaggio è quello di rompere la guaina muscolare che copre le ovaie e consentire una colorazione più efficiente e omogenea.
  8. Trasferire rapidamente le ovaie in un tubo microcentrifuga da 1,5 ml contenente 1x PBS e mantenere il tubo sul ghiaccio fino a quando tutte le mosche non vengono sezionate. Non tenere il tubo sul ghiaccio se i microtubuli o i microfilamenti (o le vescicole trafficate da questi componenti citoscheletrici) devono essere visualizzati in quanto ciò può causare depolimerizzazione.
  9. Una volta che tutte le ovaie sono state sezionate e trasferite in un tubo microcentrifuga, lasciarle affondare sul fondo del tubo e rimuovere tutti tranne ~ 50 μL del PBS. Aggiungere 1 mL di PFA al 4% e posizionare su un bilanciere a piattaforma nutating per 15 minuti. È importante verificare se le ovaie si muovono avanti e indietro nella soluzione di fissazione per consentire una corretta fissazione poiché la fissazione incompleta potrebbe portare a problemi di colorazione e imaging.
    NOTA: la velocità del nutator non è cruciale. Mentre alcuni nutator hanno un controllo della velocità, altri sono dotati di una velocità preimpostata. La velocità preimpostata è sufficiente e, se regolabile, impostata su 40-50 giri/min.
  10. Rimuovere la soluzione di fissazione (come nel passaggio 2.9), quindi eseguire due lavaggi rapidi con 1 mL di 1x PBS contenente lo 0,1% di Triton-X 100 (1x PBST), invertendo delicatamente i tubi della microfuga 5-6 volte. Quindi, procedere con quattro lavaggi di 10-15 minuti (lavaggio lungo) con 1 mL di 1x PBST (40-60 minuti totali).
    NOTA: Si consiglia di utilizzare 1x PBS + 0,1% Triton-X 100 per i lavaggi poiché l'aumento della percentuale di detergente potrebbe comportare la denaturazione della GFP, portando a una diminuzione della fluorescenza e al rilevamento di proteine BM marcate con GFP.
  11. Per la colorazione del colorante, ad esempio la colorazione del DNA e della F-actina, procedere alla fase 3. Per l'immunocolorazione, procedere al passaggio 4. Le ovaie possono essere conservate in 1x PBST a 4 °C per un massimo di 24 ore prima di procedere.

3. Colorazione standard di DNA/F-actina

  1. Dopo la fissazione e il lavaggio, rimuovere PBST. Aggiungere 500 μL di DNA e soluzione colorante F-Actina. Per preparare la soluzione di DNA/F-Actina, mescolare Hoechst (colorazione del DNA; diluizione 1:1000 della soluzione madre da 1 mg/mL) e falloidina marcata con fluoroforo (colorazione F-actina; diluizione 1:500 per Alexa Fluor 546 o diluizione 1:100 per Alexa Fluor 647, ciascuna delle soluzione madre da 66 μM) in 500 μL di PBST.
  2. Coprire i tubi con un foglio di alluminio per mantenere le ovaie e i coloranti al buio per mantenere la fluorescenza per un imaging efficiente e incubare su un bilanciere a piattaforma nutating per 15 minuti.
  3. Dopo l'incubazione, rimuovere la soluzione di DNA/F-actina (come nel passaggio 2.9). Eseguire due lavaggi rapidi e tre lavaggi lunghi (10-15 minuti) in 1x PBST come descritto nel passaggio 2.10. Procedere al montaggio come descritto nel passaggio 5.

4. Immunocolorazione fluorescente

NOTA: Questo è un protocollo immunocolorante standard per l'imaging fluorescente ed è compatibile con la maggior parte degli anticorpi primari.

  1. Bloccante e immunocolorazione anticorpale primaria (Giorno 1)
    1. Dopo il fissaggio e il lavaggio, rimuovere PBST come descritto nel passaggio 2.9. Aggiungere 1 mL di soluzione bloccante (PBS + 5% BSA) e bloccare le ovaie su un bilanciere a piattaforma nutating per almeno 1 ora.
      NOTA: Oltre alla BSA, alla soluzione bloccante è possibile aggiungere siero bovino fetale (FBS) o siero di capra normale (NGS). In alternativa, le ovaie possono essere bloccate durante la notte su un bilanciere a piattaforma nutating a 4 °C.
    2. Rimuovere la soluzione bloccante come al punto 2.9 e aggiungere 300 μL di soluzione anticorpale primaria contenente anticorpi primari diluiti alle concentrazioni appropriate (specifiche per l'anticorpo utilizzato) nella soluzione bloccante. Incubare durante la notte su un bilanciere a piattaforma nutating a 4 °C. Il giorno successivo, rimuovere la soluzione anticorpale primaria e procedere all'immunocolorazione anticorpale secondaria.
      NOTA: Alcuni anticorpi primari possono essere salvati e riutilizzati. In alcuni casi, gli anticorpi primari riutilizzati possono ridurre la colorazione di fondo, con conseguente migliore imaging. Tuttavia, il riutilizzo dovrebbe essere testato per ciascun anticorpo per garantire l'efficienza.
  2. Immunocolorazione anticorpale secondaria (Giorno 2)
    1. Dopo aver rimosso la soluzione anticorpale primaria, eseguire due lavaggi rapidi e quattro lavaggi lunghi (10-15 minuti) come nel passaggio 2.10. Lavaggi ripetitivi eseguiti con cura utilizzando un NUOVO PBST 1x ridurranno lo sfondo non specifico e porteranno a un'imaging ottimale.
    2. Rimuovere PBST come nel passaggio 2.9 e aggiungere 500 μL di soluzione anticorpale secondaria contenente anticorpi secondari fluorescenti che rileveranno gli anticorpi primari utilizzati. Proteggi il tubo dalla luce coprendolo in un foglio di alluminio da questo punto in poi per una conservazione ottimale della fluorescenza, che è fondamentale per l'acquisizione e l'analisi delle immagini.
      NOTA: La soluzione anticorpale secondaria deve contenere anticorpi secondari coniugati con fluorofori che non si sovrappongono a proteine marcate endogenamente. Ad esempio, se si utilizzano proteine marcate con GFP, si raccomanda l'uso di anticorpi secondari Alexa Fluor a lunghezze d'onda rosse o rosso lontano (ad esempio, 546, 568 o 647 nm). I coloranti fluorescenti, come Hoechst e Alexa Fluor 546 o 647 falloidina coniugata, possono essere aggiunti alla soluzione secondaria. Queste macchie potrebbero essere utili per marcare la struttura cellulare complessiva (cioè nuclei e F-actina). Fare riferimento al passaggio 3.1 per le concentrazioni.
    3. Incubare le ovaie nella soluzione anticorpale secondaria su un bilanciere a piattaforma nutating per 2 ore a temperatura ambiente. Eseguire due lavaggi rapidi e quattro lavaggi lunghi (10-15 min) in 1x PBST come nel passaggio 2.10. Procedere al montaggio come nel passaggio 5.

5. Montaggio delle ovaie macchiate

NOTA: Questo metodo funziona molto bene se le ovaie sono ben sviluppate e abbondanti. Un attento montaggio delle ovaie sul vetrino è fondamentale per un'imaging ottimale.

  1. Dopo l'ultimo lavaggio, utilizzare una pipetta p1000 per pipettare delicatamente le ovaie su e giù nel tubo per separare le camere delle uova. Lasciare che le camere delle uova affondino sul fondo mantenendo il tubo in posizione verticale per 5-10 minuti. Un'attenta separazione delle singole camere delle uova è fondamentale per ottenere un'acquisizione ottimale delle immagini.
  2. Rimuovere PBST utilizzando un pipetto Pasteur, lasciando ~ 50 μL. Rimuovere il più possibile il PBST rimanente utilizzando una pipetta p200. Aggiungere due gocce di mezzo di montaggio, sufficienti per distribuire uniformemente su un coperchio di 22 mm x 22 mm. Le ovaie possono essere conservate in un mezzo di montaggio in tubi microcentrifugati a 4 °C fino a 1 mese prima del montaggio.
    NOTA: diversi supporti di montaggio sono disponibili in commercio; si consiglia di utilizzare montanti hard-setting, come Aqua-Poly/Mount o ProLong Glass Antifade Mountant, per ottenere condizioni di imaging ottimali. L'uso del glicerolo come mezzo di montaggio è scoraggiato poiché può portare a cattive condizioni di imaging (ad esempio, instabilità del fluoroforo). Per il montaggio di supporti che non polimerizzano, sigillare il coperchio utilizzando un sigillante per copricapedi/smalto per fissarlo in posizione.
  3. Etichettare un vetrino e pulirlo con carta morbida e priva di polvere per rimuovere polvere e impronte digitali. Tagliare l'estremità di una punta della pipetta p200 per consentire un facile trasferimento del mezzo di montaggio viscoso alla slitta dal tubo microcentrifuga. Quindi, trasferire lentamente tutte le camere delle uova nel mezzo di montaggio sul vetrino, assicurandosi di non creare bolle.
  4. Sotto un microscopio sezionante, stendere delicatamente il mezzo di montaggio e separare le camere delle uova utilizzando una nuova punta o pinza p200 per coprire un'area approssimativamente delle dimensioni del coperchio.
  5. Usando una pinza, posizionare con attenzione il coperchio (pulito con carta priva di polvere) sulle camere delle uova ad angolo per evitare bolle.
  6. Conservare la diapositiva a temperatura ambiente su una superficie piana al buio per 2 giorni per polimerizzare. Una volta che il supporto di montaggio è indurito, il vetrino può essere conservato a 4 °C al buio per alcune settimane per l'imaging.
    NOTA: è importante polimerizzare il mezzo di montaggio a presa dura prima dell'imaging. Se il mezzo non si è ancora polimerizzato, le ovaie fluttueranno sotto il coperchio, influenzando l'acquisizione dell'immagine. Inoltre, l'indice riflettente ottimale del supporto di montaggio si ottiene solo dopo che è stato completamente impostato (vedere le informazioni del produttore per i dettagli).
  7. Metodo di montaggio alternativo: Questo metodo è raccomandato per ridurre la perdita di tessuto se le ovaie non sono abbondanti. In questo metodo (descritto di seguito), separare gli ovarioli e le camere delle uova sul vetrino durante il montaggio, invece di separarli in un tubo microcentrifuga mediante pipettaggio come descritto al punto 5.1.
    1. Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere tutti tranne ~ 100 μL della soluzione di lavaggio. Utilizzando una pipetta Pasteur o una pipetta p1000, trasferire le ovaie intatte in PBS al vetrino. Utilizzando una pipetta p200, rimuovere con attenzione il maggior numero possibile di PBST dalla slitta. Utilizzare una carta priva di polvere per pulire il PBST, se necessario. Non toccare le ovaie.
    2. Aggiungere due gocce di supporto di montaggio. Separare accuratamente gli ovarioli e le camere delle uova usando pinze o aghi di dissezione. Rimuovere e scartare il tessuto estraneo, quindi distribuire le camere delle uova e gli ovarioli nel mezzo di montaggio. Procedere ai passaggi 5.5-5.6.

6. Acquisizione di immagini confocali

NOTA: questa sezione fornisce i parametri chiave per ottenere un'acquisizione ottimale delle immagini utilizzando qualsiasi microscopio confocale (Figura 2).

  1. Impostare il microscopio e individuare il campione come descritto di seguito.
    1. Prima dell'imaging, è fondamentale individuare la regione di interesse (ROI) utilizzando l'oculare del microscopio a fluorescenza. Utilizzare un obiettivo a basso ingrandimento (20x) o l'obiettivo da utilizzare per l'acquisizione di immagini (ad esempio, 40x o 63x). Selezionare una camera delle uova da visualizzare.
      NOTA: per l'acquisizione di immagini, si consiglia di utilizzare obiettivi di ingrandimento elevato come 40x o 63x (vedere 6.2.1).
    2. Una volta selezionato il ROI, procedere all'acquisizione delle immagini; procedere al passaggio 6.2 per l'imaging confocale e al passaggio 7 per l'imaging a super-risoluzione.
  2. Selezionare i parametri chiave per l'acquisizione ottimale delle immagini come descritto di seguito (esempi di parametri chiave per le immagini rappresentative sono riportati nella Tabella 1).
    1. Selezione di un obiettivo: per l'acquisizione di immagini confocali del traffico intracellulare e la secrezione di proteine BM nel FE, utilizzare un obiettivo 40x o 63x.
      NOTA: Per ottenere la migliore risoluzione possibile, l'uso di obiettivi Plan-Apochromat, con apertura numerica elevata (NA) che forniscono la massima correzione acromatica, è altamente raccomandato.
    2. Selezione dei laser per ogni canale/traccia: per GFP, utilizzare il laser a 488 nm; per DAPI o Hoechst, utilizzare laser 405 nm; per Alexa Fluor 546 o 568, utilizzare il laser 561 nm; e per Alexa Fluor 647, utilizzare laser 640 nm.
      NOTA: ogni selezione laser comporterà una diversa formazione di canale/traccia. Qui, il termine canale si riferisce all'immagine formata dalla distribuzione dell'intensità registrata per i fluorofori eccitati per il ROI selezionato alla lunghezza d'onda specifica di ciascun canale.
    3. Impostazione stenopeico: per ridurre la luce sfocata durante l'acquisizione dell'immagine, impostare il foro stenopeico per ciascun canale su 1 UA.
    4. Impostazioni dell'intensità del laser e del guadagno del rilevatore: per ottimizzare la sensibilità dell'immagine, utilizzare sia il guadagno principale del rilevatore che la potenza del laser. Per impostare correttamente la sensibilità dell'immagine, si consiglia un indicatore di intervallo. Impostare sia il guadagno principale che la potenza del laser per avere una sensibilità adeguata in cui le strutture di interesse (ad esempio, vescicole contenenti BM) sono chiaramente visibili evitando la saturazione del rilevatore.
      NOTA: per evitare il fotosbiancamento, utilizzare la potenza laser minima necessaria. Si consiglia di aumentare prima il guadagno del rilevatore utilizzando la potenza laser più bassa possibile. Se un aumento del guadagno del rilevatore non può raggiungere l'intensità desiderata, aumentare la potenza del laser. Si raccomanda un'intensità di potenza laser compresa tra lo 0,5% e l'1,2%.
    5. Dimensione del fotogramma: si consiglia di utilizzare la dimensione ottimale dell'immagine determinata dal software di acquisizione. Per la maggior parte delle applicazioni, utilizzare una risoluzione massima di 1024 x 1024. Una risoluzione più elevata aumenterà significativamente il tempo di acquisizione.
    6. Velocità di scansione: utilizzare una velocità di scansione compresa tra 6 e 9, che è sicura per la maggior parte dei campioni. Se il campione è rumoroso, utilizzare una velocità di scansione più lenta per migliorare il rapporto segnale/rumore. Tuttavia, le basse velocità di scansione aumentano il tempo di fotosbiancamento e acquisizione.
    7. Media dell'intensità: per migliorare la qualità dell'immagine, utilizzare la media dell'intensità media tramite scansioni successive con impostazioni identiche. Per la maggior parte dei casi, utilizzare una media di due per migliorare i rapporti segnale-rumore senza fotosbiancare il campione.
    8. Zoom: regola l'area di scansione utilizzando la funzione zoom. Usa uno zoom tra 2x-4x con obiettivi 40x e 63x come valore più efficace per visualizzare chiaramente le vescicole contenenti BM nella FE. Seleziona attentamente il ROI minimo per ridurre i tempi di acquisizione.
  3. Per acquisire uno z-stack utilizzando il software Zeiss Zen, utilizzare i seguenti parametri Z-sectioning e impostarli come descritto di seguito.
    NOTA: Le vescicole e altre strutture intracellulari contenenti proteine BM sono strutture tridimensionali (3D). L'acquisizione di uno z-stack attraverso la FE migliorerà significativamente la qualità e la risoluzione dell'immagine. Di solito, un intervallo che copre lo spessore / profondità del tessuto è sufficiente per visualizzare in modo efficiente la localizzazione intracellulare. Per una ricostruzione 3D ottimale, si consiglia di utilizzare l'intervallo ottimale determinato dal software. Per obiettivi 40x e 63x, evitare intervalli superiori a 0,5 μm tra ogni sezione z per consentire una ricostruzione 3D ottimale.
    1. Fare clic sulla casella di controllo z-Stack nell'area principale della scheda Acquisizione . Selezionare la modalità di scansione Tutte le tracce per sezione per z-stack. Ciò comporterà un cambiamento nelle tracce di canale per ogni fetta di posizione z.
    2. Selezionare il canale desiderato per osservare il campione e fare clic su Live per avviare una scansione dal vivo. Si raccomanda l'uso del canale necessario per rilevare la proteina BM con tag GFP.
    3. Impostare un intervallo per lo z-stack come descritto. Utilizzando la manopola di regolazione fine sul microscopio, trovare la posizione z per un'estremità del campione e fare clic su Imposta prima. Allo stesso modo, trova la posizione z per l'altra estremità del campione e fai clic su Imposta ultimo.
    4. Per ogni posizione nello z-stack, fare clic su ciascun canale separatamente con l'indicatore di intervallo selezionato e regolare l'intensità del laser e il guadagno principale in base alle esigenze, come descritto nel passaggio 6.2.4.
    5. Impostare l'intervallo per lo z-stack per assegnare la dimensione del passo come consigliato nella NOTA sotto il passaggio 6.3. Fare clic su Avvia esperimento per iniziare l'acquisizione z-stack.

7. Acquisizione di immagini a super-risoluzione

  1. Selezionare un obiettivo compatibile con Airyscan. Per visualizzare la localizzazione intracellulare della proteina BM, l'uso di un obiettivo di olio 63x è ottimale (Figura 3). Impostare l'obiettivo su 63x e posizionare delicatamente una goccia di olio per immersione sulla lente. Posizionare la diapositiva sull'obiettivo con la slitta di copertura rivolta verso l'obiettivo per individuare il campione.
  2. Selezionare una configurazione con le impostazioni appropriate per il fluoroforo all'immagine come descritto di seguito.
    1. Fare clic sul pulsante Smart Setup nella scheda Acquisizione per configurare un nuovo esperimento. Selezionare Airyscan (super-risoluzione); quando questa opzione è selezionata, sarà necessaria un'ulteriore selezione tra Risoluzione (Airyscan SR), SNR/sensibilità (Airyscan Confocal) e Velocità (Multiplex SR-2Y). Per il tessuto fisso, selezionare Risoluzione in quanto ciò si tradurrà nella migliore acquisizione.
    2. Fai clic su + nella casella Configura il tuo esperimento per aggiungere tracce/canali. Selezionare le tracce per coloranti specifici dal database dei coloranti. Per un esperimento multicanale, aggiungi ogni traccia secondo necessità selezionando i coloranti appropriati.
    3. Dopo aver aggiunto tutte le tracce, selezionare una delle proposte di esperimento fornite dal software. Per questo esperimento, utilizzare Best Signal, poiché sebbene la velocità sarà un po 'più lenta rispetto alla proposta Smartest (Line), creerà le migliori impostazioni hardware per ogni colorante, con conseguente massimo guadagno del segnale e diafonia di emissione minima. Una volta che l'esperimento è stato impostato e caricato, verrà visualizzato nella finestra Impostazione imaging nella scheda Acquisizione.
    4. Una volta selezionata una configurazione intelligente, verrà automaticamente selezionata la gamma di lunghezze d'onda per il rilevatore GaAsP-PMT. Regolare l'intervallo spostando la barra di scorrimento nella parte inferiore per aumentare o diminuire l'intervallo o spostare completamente l'intervallo in un'altra regione in base alle esigenze. Utilizzare questa opzione per assicurarsi che gli intervalli di due canali diversi non si sovrappongano per evitare la diafonia. Salvare la configurazione per riutilizzarla in futuro.
  3. Una volta impostata la configurazione, procedere alla regolazione dello zoom e dell'area di scansione come nel passaggio 6.2.8. Ottimizza l'area di scansione per concentrarti sulla regione di interesse per ridurre i tempi di scansione e lo spazio di archiviazione. Procedere all'acquisizione delle immagini.
  4. Per ogni singolo canale, seleziona una traccia sotto Canale e fai clic su Live. Regolare il guadagno principale e la potenza del laser utilizzando lo strumento indicatore di intervallo come descritto nel passaggio 6.2.4 e seguire tutte le linee guida descritte per evitare pixel saturi. Verificare che la vista esagonale del rilevatore sia centrata e allineata facendo clic sul pulsante Airyscan Detector View . Nella maggior parte dei casi, la vista esagonale del rilevatore viene automaticamente centrata e allineata. Ripetere l'operazione per altri canali.
  5. Nella finestra di commutazione della modalità di acquisizione, in Dimensioni immagine, fare clic su SR (conteggio pixel limitato a super-risoluzione) per massimizzare le capacità del rilevatore. Questo regolerà automaticamente le dimensioni del fotogramma.
  6. Mantenere la media su Nessuno in quanto di solito non è necessario e questo ridurrà il tempo di scansione. In alcuni casi, una media di 2x può migliorare il rapporto segnale-rumore.
  7. Raccogli dati grezzi con profondità di dati a 8 bit. Clicca su Snap per acquisire un'immagine. Per acquisire uno z-stack, seguire il passaggio 6.3.
  8. Eseguire l'elaborazione delle immagini come descritto di seguito. Questo produrrà un'immagine a 16 bit.
    1. Una volta ottenuta l'immagine o z-stack, fare clic su Metodo di elaborazione > e selezionare Elaborazione Airyscan.
    2. Eseguire il filtro automatico per iniziare ed eseguire un'ulteriore elaborazione manuale modificando il valore SR per ottenere i migliori risultati per il campione. Una volta determinato il valore SR ottimale, fare clic su Applica per generare un'immagine elaborata. Nel caso di immagini z-stack, elaborare come una z-slice (Current Image [2D]) o come l'intero z-stack facendo clic sulla casella Elaborazione 3D .

8. Elaborazione delle immagini e analisi dei dati (proiezione ortogonale, ricostruzione 3D e profilo di intensità)

NOTA: per questo metodo, i passaggi utilizzati per generare proiezioni ortogonali, ricostruzioni 3D e profili di intensità sono descritti per il software Zen (vedere Tabella dei materiali). Analisi di dati simili possono essere eseguite anche con il software ImageJ56.

  1. Eseguire la proiezione ortogonale come descritto di seguito (Figura 4).
    1. Una volta ottenuto uno z-stack utilizzando la microscopia confocale o a super-risoluzione, generare una proiezione ortogonale per visualizzare le vescicole nell'asse z della cella in una vista 2D (rispetto alla ricostruzione 3D). Per fare ciò, fare clic su Metodo di > di elaborazione e selezionare Proiezione ortogonale.
    2. In Parametri (Parameters), selezionate il piano di proiezione richiesto. Per una proiezione dell'asse z (z-stack), selezionate il piano frontale (XY ). In Metodo selezionare Massimo per ottenere la massima qualità di proiezione.
    3. Quindi, determinare lo spessore della proiezione selezionando la posizione iniziale (z-slice iniziale) e determinare lo spessore (numero totale di z-slice) nella proiezione. È ideale selezionare lo spessore uguale a quello di una cella nell'asse z.
    4. Una volta impostati i parametri, fare clic su Applica per creare la proiezione dello z-stack in modo XY.
      NOTA: quando si creano proiezioni ortogonali di più z-stack per confrontare la quantità di un particolare oggetto di interesse, è imperativo mantenere lo spessore della proiezione uguale (o il più vicino possibile) per l'accuratezza dei dati.
  2. Eseguire la ricostruzione 3D come descritto di seguito (Figura 5).
    1. Crea ricostruzioni 3D di z-stack per osservare la localizzazione e la forma delle strutture. Fallo per z-stack acquisiti utilizzando approcci confocali e super-risoluzione. Elabora gli z-stack a super-risoluzione utilizzando prima l'elaborazione 3D come nel passaggio 7.8 per la ricostruzione 3D.
    2. Per generare un'immagine 3D, fare clic sull'icona 3D nella finestra di anteprima. Una volta cliccato, una scheda 3D apparirà nella sezione di controllo del display nella metà inferiore dello schermo. Le viste 3D, ad esempio Trasparenza, Volume, Massimo, Superficie e Misto, saranno visibili. Utilizzate le viste Superficie o Misto quando visualizzate la struttura delle vescicole (preferibilmente).
    3. Per un'immagine di qualità superiore, selezionare l'impostazione Precisa , poiché l'impostazione più veloce sarà meno accurata e porterà a un rendering 3D scadente.
    4. Una volta generata l'immagine, manipolala ruotandola e ingrandendola per mettere a fuoco una posizione preferita per visualizzare gli oggetti di interesse. Manipolare l'immagine 3D nella scheda Aspetto .
    5. Una volta ottenuta una vista soddisfacente, nella scheda 3D selezionare Risoluzione visualizzata, quindi fare clic su Crea immagine. Questo creerà un'istantanea dell'immagine nello stesso orientamento in cui è stata visualizzata e può essere salvata ed esportata in vari formati di file.
  3. Generare un profilo di intensità come descritto di seguito (Figura 7).
    NOTA: i profili di distribuzione e intensità dei pixel associati ai diversi segnali fluorescenti possono essere visualizzati come un'immagine sovrapposta per determinarne la colocalizzazione.
    1. Una volta acquisita un'immagine ottimale tramite imaging confocale o a super-risoluzione, nel pannello Visualizza della finestra Anteprima , fare clic su Profilo. Nella finestra di anteprima, apparirà un istogramma che mostra il profilo di intensità in funzione della distanza, nonché una tabella che mostra le distanze e i valori di intensità.
    2. Nell'area dei controlli di visualizzazione nella parte inferiore dello schermo, fare clic sullo strumento freccia nella scheda Definizione profilo . Disegna una freccia lungo la lunghezza dell'oggetto per il quale è necessario valutare il profilo di intensità dei diversi pixel. Per disegnare la freccia, ingrandisci l'immagine.
    3. Il profilo di intensità apparirà a sinistra dell'anteprima dell'immagine, dove verranno visualizzati la distanza e i picchi corrispondenti lungo il percorso della freccia. Per rimuovere l'istogramma visualizzato sull'immagine stessa, deselezionare la casella Mostra profilo in grafica .
    4. Nella scheda Dimensioni nell'area di controllo dello schermo, deselezionate tutti i canali che non devono essere inclusi nel profilo di intensità.
    5. Nella scheda Grafica , fare doppio clic su Profilo mostrato nella casella Annotazioni/Misure per aprire la finestra a comparsa Formato elementi grafici . Utilizzatelo per modificare il colore della freccia, nonché lo stile e lo spessore del tratto. Chiudere la casella dopo aver selezionato le impostazioni desiderate.
    6. Fare clic sulla scheda Visualizzazione profilo . Nella sezione nuova immagine, fare clic su Visualizzazione corrente e quindi su Salva con nome per salvare il file. Si consiglia di salvare il file come file .tif per evitare la compressione e la perdita di dati.

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Risultati

I metodi qui descritti possono essere utilizzati per visualizzare e caratterizzare in modo efficiente e accurato il traffico intracellulare e la secrezione di proteine BM in cellule epiteliali polarizzate, come la FE dell'ovaio Drosophila . Successivamente, forniamo i risultati attesi ottenuti utilizzando i metodi descritti, nonché consigli utili e potenziali insidie. Per fare ciò, viene utilizzato Vkg-GFP, un Vkg endogenamente taggato (Drosophila Col IV). Tuttavia, gli stessi risultati possono essere...

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Discussione

Il BM è fondamentale per la morfogenesi embrionale e d'organo e per le funzioni fisiologiche dell'adulto. Inoltre, il BM funge da piattaforma di segnalazione per l'istituzione e il mantenimento della polarità epiteliale e fornisce ai tessuti supporto2. Tuttavia, i meccanismi che regolano il corretto posizionamento delle proteine BM sono poco conosciuti. Una migliore comprensione dei percorsi biologici dedicati al traffico intracellulare e alla secrezione polarizzata delle proteine BM richiede un...

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Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Gli autori sono grati a Julie Merkle per i suoi utili commenti sul manoscritto. Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione NIH R15GM137236 a O.D. Le immagini confocali e super-risoluzioni sono state acquisite utilizzando uno Zeiss LSM 900 con Airyscan 2, acquistato con 2018748 di sovvenzione NSF MRI.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 546 phalloidinInvitrogenA22283F-Actin Stain (1/500 of 66µM)
Alexa Fluor 647 phalloidinInvitrogenA22287F-Actin Stain (1/100 of 66µM))
Anti-GM130 Antibodyabcamab30637For Golgi Stain (colocalization); use as concentration of 7µg/uL
Aqua-PolymountPolysciences, Inc.1860620Mounting Medium
Bakers Yeast (Active Dry Yeast)Genesee Scientific62-103To fatten the overies for dissection
Bovine Serum Albumin (30% solution)Sigma-AldrichA7284For blocking solution
Depression wellsElectron Microscopy Sciences7156101For dissection (glass concavity slide can be used instead)
Dissecting needleFisher scientifc13-820-024
Drosophila IncubatorGenesee Scientific/Invictus
Fly Stock: Perlecan-GFP Drosophila line (ZCL1700)Morin et al., 2001
Fly Stock: UAS-Crag RNAi line (TRIP line HMS00241)Bloomington Drosophila Stock Center33594RNAi against Crag
Fly Stock: Viking-GFP Drosophila line (CC00791)Buszczak et al., 2007
Fly Stock: Vkg-GFP, tj-Gal4Devergne et al., 2017. Drive the expression of Crag RNAi in the FE
Forceps (Dumont 5)Fine Science Tools11251-30For dissection
Glass Concavity SlideElectron Microscopy Sciences7187804For dissection (depression wells can be used instead)
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568InvitrogenA11036Secondary antibody (GM130 antibody) (5 µg/mL)
Hoechst (Hoechst 33342)InvitrogenH3570DNA Stain (1 ug/mL)
KimwipesKimtechFisher Scientific: 06-666Delicate task wipers
Leica Fluorescent Stereo Microscope  M165 FCLeicaFor ovary imaging
Microscope SlidesCorning294875X25Microscope Slides
Nutating platform rockerCorning Life Sciences6720For ovary fixation and staining
Nutri-Fly BFGenesee Scientific66-121Fly Food
Paraformaldehyde 20% SolutionElectron Microscopy SciencesFisher Scientific: 15713For PFA 4%
Phosphate Buffered Saline TabletsFisher scientificBP2944100For PBS solution
ProLong Glass Antifade MountantInvitrogenP36980Mounting Medium
Square Cover GlassCorning285022Cover glass for microscope slides
Triton x-100Sigma-Aldrich9036-19-5For PBST
Zeiss LSM 900 with Airyscan 2ZeissConfocal and super-resolution Microscope
Zeiss Stemi 305 Stereo MicroscopeZeissDissecting microscope
Zeiss Zen Software version 3.3 (Blue Edition)ZeissImage acquisition and processing

Riferimenti

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