Imagem confocal e super-resolução de tráfico intracelular polarizado e secreção de proteínas de membrana de porão durante Drosophila Oogenesis

Resumo

A membrana do porão é essencial para morfogênese tecidual e órgão durante o desenvolvimento. Para entender melhor os mecanismos que levam à colocação adequada dessa estrutura, o protocolo apresentado descreve métodos para visualizar e caracterizar o tráfico intracelular e a secreção de proteínas de membrana de porão em células epiteliais utilizando microscopia confocal e super-resolução.

Resumo

A membrana do porão (ML) - uma folha especializada de matriz extracelular presente no lado basal das células epiteliais - é fundamental para o estabelecimento e manutenção da morfologia do tecido epitelial e da morfogênese do órgão. Além disso, o BM é essencial para a modelagem tecidual, servindo como uma plataforma de sinalização, e fornecendo forças externas para moldar tecidos e órgãos. Apesar dos muitos papéis importantes que o BM desempenha durante o desenvolvimento normal e as condições patológicas, as vias biológicas que controlam o tráfico intracelular de vesículas contendo BM e como a secreção basal leva à deposição polarizada das proteínas BM são mal compreendidas. O epitélio folicular do ovário Drosophila é um excelente sistema modelo para estudar a deposição basal de proteínas de membrana BM, pois produz e secreta todos os principais componentes do ovário BM. A imagem confocal e super-resolução combinada com o processamento de imagens em tecidos fixos permite a identificação e caracterização de fatores celulares especificamente envolvidos no tráfico intracelular e na deposição de proteínas BM. Este artigo apresenta um protocolo detalhado para coloração e imagem de vesículas contendo BM e BM depositado usando proteínas marcadas endogenosamente no epitélio folicular do ovário de Drosophila . Este protocolo pode ser aplicado para abordar questões qualitativas e quantitativas e foi desenvolvido para acomodar a triagem de alto rendimento, permitindo a identificação rápida e eficiente dos fatores envolvidos no tráfico intracelular polarizado e secreção de vesículas durante o desenvolvimento do tecido epitelial.

Introdução

A membrana do porão (BM) é uma fina folha de matriz extracelular aderente a células em camadas (ECM) crítica para estrutura epitelial e morfogênese¹. Compreende ~50 proteínas e é encontrado onipresentemente subjacente às células epiteliais e endoteliais, e células esqueléticas, lisas e cardíacas e adipócitos ^1,2,3. Os três principais componentes do BM no lado basal das células epiteliais são Colágeno IV, Perlecan e Laminins. O BM está por trás das células epiteliais e é responsável por muitas funções, incluindo separação e barreira tecidual, crescimento e suporte, e polarização celular 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Seu papel como plataforma de sinalização regula a morfologia e diferenciação de células e tecidos epiteliais durante o desenvolvimento ^3,13,14. Além disso, a má regulação do BM e/ou uma violação de sua integridade são as principais causas de muitas condições patológicas, incluindo a metástase tumoral ^2,15,16. Apesar das funções essenciais desempenhadas pelo MMC durante a morfogênese tecidual e de órgãos, os componentes da via biológica dedicada ao tráfico intracelular polarizado e secreção de proteínas BM são vagamente conhecidos.

Para estudar o tráfico intracelular de vesículas contendo BM e a secreção de proteínas BM por células epiteliais, o epitélio folicular (FE) do ovário de Drosophila é um poderoso sistema modelo (Figura 1). Um ovário de Drosophila compreende 16-20 estruturas longas, semelhantes a tubos, chamadas ovários (Figura 1A,B)17,18,19. Cada ovário pode ser considerado como uma linha de montagem de ovos, com a progressão de idade das câmaras de ovos (que cada uma dá origem a um ovo) que começa na extremidade anterior e se move posteriormente, até que o ovo maduro saia através do oviduto. Cada câmara de ovo é encapsulada pela FE, uma monocamada de células folículos somáticas (FCs), que circunda as células germinais centrais (GCs). O FE é altamente polarizado com uma distinta polaridade apical-basal onde o domínio apical enfrenta a germinal, e as proteínas BM são secretas basally ^18,19. Os FCs secretam ativamente todos os principais componentes do BM, incluindo Colágeno IV, Perlecan e Laminins^20,21. Em células epiteliais como FCs, os componentes de BM são produzidos e requerem um caminho de secreção polarizada especializada para sua deposição extracelularmente. Por exemplo, no caso do componente mais abundante do BM, Colágeno IV (Coll IV), os detalhes em torno de seu tráfico intracelular polarizado e secreção são vagos, apesar de sua produção e deposição serem o foco de muitos estudos. A coll IV é traduzida no ânticulo endoplasmático (ER), que também é onde cada fibril - composto por três polipeptídeos (duas cadeias α1 e uma cadeia α2) - é montado em uma hélice tripla²². A dobra e a função adequadas coll IV requerem acompanhantes e enzimas ER, incluindo lysyl e prolyl-hidroxilases como Plod e PH4αEFB 20,22,23,24,25,26. Essas enzimas pós-transacionais regulam a classificação do ER de Coll IV, pois a perda de cada uma faz com que o Coll IV fique preso no ER basal 20,23,24,25,26. Em seguida, o recém-sintetizado Coll IV sai do ER para o Golgi em vesículas revestidas de COPII. O receptor de carga Tango1 auxilia na embalagem de collagens em vesículas consideráveis ligadas a Golgi que podem acomodar grandes proteínas multiméricas^20,27. Uma vez que Coll IV é embalado em vesículas exocóis exocóis intracelulares, é especificamente secretado basalmente de células epiteliais. Para direcionar a deposição de BM para o lado basal, as células epiteliais requerem outro conjunto de fatores especificamente dedicados à secreção polarizada de BM. Usando o FE do ovário Drosophila, alguns componentes deste novo processo celular foram caracterizados, incluindo os fatores de troca de nucleotídeos (GEFs) Crag e Stratum, os GTPases Rab8 e Rab10, bem como os níveis do fosfoinostito PI(4,5)P2, e Kinesin 1 e 3 proteínas motoras 20,28,29, ^30,31 . Esses componentes são fundamentais para garantir a distribuição polarizada das proteínas BM.

Para monitorar a localização intracelular de proteínas BM no FE, proteínas de membrana de porão marcadas endógenamente (armadilhas proteicas), como Viking-GFP (Vkg-GFP ou α2 Coll IV-GFP) e Perlecan-GFP (Pcan-GFP) podem ser utilizadas ^32,33. Estas linhas de armadilhas proteicas têm sido demonstradas para refletir com precisão a distribuição endógena das proteínas BM e permitir uma detecção mais sensível do tráfico vesicular^28,30. Os componentes envolvidos na deposição polarizada de BM no FE foram caracterizados pela primeira vez utilizando linhas de armadilha de proteína para Vkg-GFP e Pcan-GFP 20,28,29,30. Armadilhas proteicas podem ser usadas em diferentes origens genéticas, incluindo mutantes e linhas Gal4 ³⁴. Além disso, armadilhas proteicas podem ser usadas em combinação com corantes fluorescentes e/ou imunostaining de fluorescência, permitindo uma caracterização precisa da localização de proteínas BM ao comparar condições do tipo selvagem e mutantes³⁵.

Avaliar com precisão e eficiência a distribuição e localização de vesículas contendo proteínas BM, microscopia de varredura a laser confocal (CLSM) e técnicas de imagem de super resolução apresentam uma vantagem significativa para outras abordagens de imagem. Estas abordagens acoplam imagens de alta resolução com relativa facilidade de uso. CLSM é uma técnica de microscopia que permite uma melhor resolução óptica escaneando a amostra com um laser em uma maneira de varredura raster usando galvanômetros. A abertura do pinhole é um componente central de um microscópio confocal. Bloqueando os sinais fora de foco provenientes de cima ou abaixo do plano focal, a abertura do pinhole resulta em uma resolução altamente superior no eixo z³⁶. Isso também permite obter uma série de imagens no plano z, chamada de pilha z, correspondente a uma série de seções ópticas. z-stacks posteriormente criar uma imagem 3D do espécime, através de reconstrução 3D, com o auxílio de software de imagem. Microscópios convencionais de epifluorescência (widefield), ao contrário dos microscópios confocal, permitem que a luz fora de foco contribua para a qualidade da imagem, diminuindo a resolução da imagem e o contraste^36,37. Isso torna a microscopia de epifluorescência um candidato menos atraente ao estudar localização ou colocalização de proteínas.

Embora o CLSM seja uma abordagem adequada para várias aplicações, incluindo imagem e caracterização do tráfico intracelular de proteínas BM, ele ainda apresenta um problema quando amostras de imagem abaixo do limite de difração de luz de Abbe (200-250 nm). Ao fotografar tais amostras, a microscopia confocal, especialmente quando se utiliza um objetivo de óleo, pode resultar em alta resolução. No entanto, as técnicas de super-resolução ultrapassam o limite da microscopia confocal. Existem várias abordagens para alcançar microscopia de super-resolução, cada uma com limites de resolução específicos, e cada uma apropriada para diferentes análises. Essas abordagens incluem microscopia de localização fotoativada (PALM) ou microscopia de reconstrução óptica estocástica (STORM), microscopia de esgotamento de emissões estimulada (STED), microscopia de iluminação estruturada (SIM) e microscopia airyscana (super-resolução) 38,39,40,41,42,43,44,45,46 . Embora o Airyscan tenha uma resolução mais grosseira que PALM/STORM, STED e SIM, ele ainda pode alcançar uma resolução de até ~120 nm (cerca de duas vezes a resolução do CLSM). Além disso, essa abordagem de microscopia de super resolução tem mostrado ter uma vantagem sobre o SIM e outras técnicas de super-resolução ao fotografar amostras grossas e amostras com uma baixa relação sinal-ruído^47,48.

Airyscan é uma tecnologia de microscopia confocal relativamente nova⁴⁶. Ao contrário dos CLSMs tradicionais, que usam o pinhole e os detectores de ponto único para rejeitar a luz fora de foco, esta abordagem de super-resolução usa um detector de área de tubo de arsultipto de arsênio de 32 canais (GaAsP) que coleta toda a luz em cada posição de varredura⁴⁵. Cada um dos 32 detectores funciona como um pequeno pinhole, reduzindo o tamanho do pinhole da tradicional Unidade Aérea 1.0 (A.U.) para um 0,2 A.U., permitindo uma resolução ainda maior e relação sinal-ruído, mantendo a eficiência de um diâmetro de 1,25 A.U.^{, 45}. Além disso, a desconvolução linear usada pelo Airyscan resulta em até um aumento de 2x na resolução⁴⁵. Levando isso em consideração, o CLSM, e especificamente a microscopia de super resolução, são adequados para estudar proteínas e proteínas de BM que regulam a deposição basal das proteínas BM, pois podem produzir imagens de alta resolução para estudos de localização e colocalização, fornecendo assim novas percepções nos eventos espaciais, temporais e moleculares que controlam esses processos.

Uma abordagem alternativa à microscopia confocal que pode ser usada para realizar experimentos de localização é a desconvolução de imagens. Uma vez que a microscopia widefield permite que a luz fora de foco atinja os detectores, algoritmos matemáticos e de desconvolução computacional podem ser aplicados para remover ou recoltir a luz fora de foco das imagens obtidas pela microscopia de campo largo, melhorando assim a resolução e o contraste da imagem⁴⁹. Algoritmos de desconvolução também podem ser aplicados a imagens confocal para aumentar ainda mais a resolução e o contraste, produzindo imagens finais quase comparáveis à da microscopia de super resolução⁵⁰. Airyscan faz uso da desconvolução baseada em filtro Weiner, juntamente com a redesignação de pixels de Sheppard, resultando em uma resolução espacial altamente melhorada e relação sinal-ruído. Em comparação com a microscopia confocal, observa-se um aumento de 2x em resolução nas três dimensões espaciais (120 nm em x e y, e 350 nm em z) ao utilizar esta técnica de microscopia de super resolução^45,51.

Este manuscrito fornece protocolos detalhados e otimizados para manchar, adquirir e visualizar o tráfico intracelular e a deposição de proteínas BM utilizando o FE do ovário Drosophila como um sistema modelo aliado à microscopia confocal e super-resolução. As linhas de drosophila que expressam proteínas de membrana de porão marcadas endógenamente, por exemplo, Vkg-GFP e Pcan-GFP, são ferramentas eficientes e precisas para visualizar o tráfico e a secreção de proteínas BM. Além disso, eles podem ser facilmente usados em diferentes origens genéticas, incluindo as linhas mutante e Gal4/UAS ³⁴. Embora proteínas de membrana de porão marcadas endógenamente sejam recomendadas, o uso de anticorpos contra proteínas BM específicas também é compatível com os protocolos descritos. Esses protocolos são particularmente úteis para cientistas interessados em estudar o tráfico intracelular e a secreção de proteínas BM em tecido epitelial intacto usando imagens confocal e super-resolução. Além disso, a capacidade de combinar a análise do tecido epitelial com as ferramentas expansivas da genética drosophila torna essa abordagem especialmente poderosa. Finalmente, esses protocolos poderiam ser facilmente adaptados para estudar o tráfico vesicular e a triagem de outras proteínas de interesse.

Protocolo

1. Preparação de moscas para dissecções de ovário

1. Coloque 10-15 moscas fêmeas de melanogaster Drosophila (1-2 dias de idade) do genótipo desejado em um frasco estreito contendo ~8 mL de mosca drosophila granulado com uma pequena quantidade de levedura granulada 2-3 dias antes da dissecção a 25 °C. Adicionar alguns machos ao frasco pode aumentar a produção de câmara de ovos. No entanto, certifique-se de que o número total de moscas não exceda 20, pois isso pode afetar negativamente o desenvolvimento do ovário.
   NOTA: A descrição de machos e fêmeas de Drosophila, e dicas e conselhos úteis para cientistas sem experiência prévia de Drosophila podem ser encontrados nos artigos^{citados 34,52}. A adição de levedura estimulará a produção de ovos e gerará ovários com diferentes estágios representados. Além disso, também engordará os ovários e os tornará mais fáceis de extirver. A levedura molhada também pode ser usada em vez de levedura granulada, no entanto, para estoques mais fracos, as moscas podem ficar presas e morrer.

2. Dissecção e fixação de ovários

NOTA: Para recursos adicionais sobre dissecação e coloração de ovários, os leitores são direcionados aos protocolos citados 53,54,55.

1. No dia da dissecção, prepare uma nova solução de fixação com uma concentração final de 4% de paraformaldeído (PFA) diluindo a solução de estoque pfa em 1x salina tampão de fosfato (PBS).
2. Anestesiar as moscas usando CO₂ e colocá-las em uma plataforma de voo. Mantenha as moscas anestesiadas até a dissecação. Considere moscas adequadamente anestesiadas uma vez que seus movimentos cessaram, o que geralmente leva de 10 a 20 anos.
   NOTA: Embora o uso de CO₂ seja recomendado como uma opção mais segura e rápida, as moscas podem ser anestesiadas usando gelo.
3. Coloque um escorregador de concave de vidro ou uma folha de coloração com poços de depressão rasos sob um microscópio dissecando e encha os poços com 1x PBS.
4. Segure uma mosca fêmea no tórax inferior usando um par de fórceps. Assegurar o sexo das moscas pela ausência de genitália masculina na extremidade posterior do abdômen e a ausência de pentes sexuais em suas patas dianteiras como característica secundária⁵². Dissecar voa individualmente usando outro par de fórceps (passo 2.5) enquanto submerge-os em poços preenchidos com PBS 1x sob o microscópio dissecando (recomenda-se a ampliação de 20x).
5. Ao olhar através do microscópio dissecando, use outro par de fórceps para puxar a parte posterior do abdômen da mosca, tornando visíveis os órgãos internos (por exemplo, ovários, intestino).
6. Esprema suavemente a parte anterior do abdômen da mosca (como com um tubo de pasta de dente) para forçar os ovários para fora do abdômen. Este método deve manter os ovários intactos. Despeir e remover cuidadosamente outros órgãos e detritos de mosca.
7. Usando fórceps ou agulhas dissecando, separe os ovários do ovário, mantendo intacta a estrutura do ovário. O objetivo desta etapa é quebrar a baia muscular cobrindo os ovários e permitir uma coloração mais eficiente e homogênea.
8. Transfira rapidamente os ovários para um tubo de microcentrifus de 1,5 mL contendo PBS 1x e mantenha o tubo no gelo até que todas as moscas sejam dissecadas. Não mantenha o tubo no gelo se microtúbulos ou microfilamentos (ou vesículas traficadas por esses componentes citoesqueléticos) devem ser visualizados, pois isso pode causar despomerização.
9. Uma vez que todos os ovários são dissecados e transferidos para um tubo de microcentrífuga, permita-lhes afundar até o fundo do tubo e remover todos, menos ~50 μL do PBS. Adicione 1 mL de 4% PFA e coloque em um roqueiro de plataforma por 15 minutos. É importante verificar se os ovários estão se movendo para frente e para trás na solução de fixação para permitir a fixação adequada, pois a fixação incompleta pode levar a problemas de coloração e imagem.
   NOTA: A velocidade do nutador não é crucial. Enquanto alguns nutadores têm um controle de velocidade, outros vêm com uma velocidade predefinida. A velocidade predefinida é suficiente e, se ajustável, fixada em 40-50 rpm.
10. Remova a solução de fixação (como na etapa 2.9), e depois execute duas lavagens rápidas com 1 mL de PBS 1x contendo 0,1% Triton-X 100 (1x PBST), invertendo suavemente os tubos de microfudão 5-6 vezes. Em seguida, prossiga com quatro lavagens de 10-15 min (lavagem longa) com 1 mL de 1x PBST (40-60 min total).
    NOTA: Recomenda-se o uso de 1x PBS + 0,1% Triton-X 100 para lavagens, pois o aumento da porcentagem de detergente pode resultar em desnaturação de GFP, levando à diminuição da fluorescência e detecção de proteínas BM marcadas por GFP.
11. Para coloração de tingimento, por exemplo, dna e coloração f-actin, proceda para o passo 3. Para imunostaining, proceda ao passo 4. Os ovários podem ser armazenados em 1x PBST a 4 °C por até 24 horas antes de prosseguir.

3. Coloração padrão de DNA/F-Actin

1. Após fixação e lavagem, remova o PBST. Adicione 500 μL de DNA e solução de coloração F-Actin. Para preparar a solução DNA/F-Actin, misture Hoechst (mancha de DNA; 1:1000 diluição de 1 mg/mL solução de estoque) e fhalloidina marcada por fluoróforo (mancha F-actin; diluição de 1:500 para Alexa Fluor 546 ou 1:100 diluição para Alexa Fluor 647, cada uma de 66 μM solução de estoque) em 500 μL de PBST.
2. Cubra os tubos com papel alumínio para manter os ovários e corantes no escuro para manter a fluorescência para imagens eficientes e incubar em um roqueiro de plataforma de nozes por 15 minutos.
3. Após a incubação, remova a solução DNA/F-Actin (como na etapa 2.9). Realize duas lavagens rápidas e três lavagens longas (10-15 min) em 1x PBST, conforme descrito na etapa 2.10. Prossiga para a montagem como descrito na etapa 5.

4. Imunostaining de fluorescência

NOTA: Este é um protocolo padrão de imunossuagem para imagens fluorescentes e é compatível com a maioria dos anticorpos primários.

1. Bloqueio e imunostenção de anticorpos primários (Dia 1)
   1. Após fixação e lavagem, remova o PBST conforme descrito na etapa 2.9. Adicione 1 mL de solução de bloqueio (PBS + 5% BSA) e bloqueie os ovários em um roqueiro de plataforma de nozes por 1h no mínimo.
      NOTA: Além da BSA, o soro bovino fetal (FBS) ou o soro de cabra normal (NGS) podem ser adicionados à solução de bloqueio. Alternativamente, os ovários podem ser bloqueados durante a noite em um roqueiro de plataforma de nozes a 4 °C.
   2. Remova a solução de bloqueio como na etapa 2.9 e adicione 300 μL de solução de anticorpos primários contendo anticorpos primários diluídos em suas concentrações apropriadas (específicas do anticorpo utilizado) na solução de bloqueio. Incubar durante a noite em um roqueiro de plataforma de nozes a 4 °C. No dia seguinte, remova a solução primária de anticorpos e prossiga para imunossuagem de anticorpos secundários.
      NOTA: Alguns anticorpos primários podem ser salvos e reutilizados. Em alguns casos, anticorpos primários reutilizados podem reduzir a coloração de fundo, resultando em melhor imagem. No entanto, o reaproveitamento deve ser testado para cada anticorpo para garantir a eficiência.
2. Imunostaining de anticorpos secundários (Dia 2)
   1. Depois de remover a solução de anticorpos primários, realize duas lavagens rápidas e quatro lavagens longas (10-15 min) como na etapa 2.10. Lavagens repetitivas cuidadosamente feitas usando 1x PBST fresco diminuirá o fundo não específico e levará a uma imagem ideal.
   2. Remova o PBST como na etapa 2.9 e adicione 500 μL de solução de anticorpos secundários contendo anticorpos secundários fluorescentes que detectarão os anticorpos primários utilizados. Proteja o tubo da luz cobrindo-o em papel alumínio a partir deste ponto para uma conservação ideal da fluorescência, o que é fundamental para a aquisição e análise da imagem.
      NOTA: A solução de anticorpos secundários deve conter anticorpos secundários conjugados com fluoroforos que não se sobrepõem com proteínas marcadas endógenamente. Por exemplo, se usar proteínas marcadas por GFP, recomenda-se o uso de anticorpos secundários Alexa Fluor em comprimentos de onda vermelhos ou vermelhos distantes (por exemplo, 546, 568 ou 647 nm). Corantes fluorescentes, como Hoechst e Alexa Fluor 546 ou 647 fálico conjugados, podem ser adicionados à solução secundária. Essas manchas podem ser úteis para marcar a estrutura celular global (ou seja, núcleos e F-Actin). Consulte a etapa 3.1 para as concentrações.
   3. Incubar os ovários na solução de anticorpos secundários em um roqueiro de plataforma de nozes por 2 h à temperatura ambiente. Realize duas lavagens rápidas e quatro lavagens longas (10-15 min) em 1x PBST como na etapa 2.10. Prossiga para a montagem como na etapa 5.

5. Montagem de ovários manchados

NOTA: Este método funciona muito bem se os ovários forem bem desenvolvidos e abundantes. A montagem cuidadosa dos ovários no slide é fundamental para uma imagem ideal.

1. Após a última lavagem, use uma pipeta p1000 para encanar suavemente os ovários para cima e para baixo no tubo para separar as câmaras de ovos. Deixe as câmaras de ovos afundarem até o fundo mantendo o tubo em posição vertical por 5-10 min. A separação cuidadosa das câmaras individuais de ovos é fundamental para alcançar a aquisição ideal de imagem.
2. Remova o PBST usando uma pipeta Pasteur, deixando ~50 μL. Remova o máximo possível do PBST restante usando uma pipeta p200. Adicione duas gotas de meio de montagem, o suficiente para se espalhar uniformemente em uma mancha de cobertura de 22 mm x 22 mm. Os ovários podem ser armazenados em meio de montagem em tubos de microcentrifuuge a 4 °C por até 1 mês antes da montagem.
   NOTA: Várias mídias de montagem diferentes estão disponíveis comercialmente; O uso de suportes de ajuste rígido, como o Aqua-Poly/Mount ou o ProLong Glass Antifade Mountant, é recomendado para alcançar condições ideais de imagem. O uso de glicerol como meio de montagem é desencorajado, pois pode levar a más condições de imagem (por exemplo, instabilidade fluoróvano). Para obter uma mídia de montagem que não polimerize, sele a mancha de cobertura usando um selante de tinta/esmalte para fixá-lo no lugar.
3. Rotule um slide de vidro e limpe-o com papel macio e sem poeira para remover poeira e impressões digitais. Corte a extremidade de uma ponta de pipeta p200 para permitir a fácil transferência do meio de montagem viscoso para o slide do tubo de microcentrifutura. Em seguida, transfira lentamente todas as câmaras de ovos no meio de montagem para o escorregador de vidro, garantindo não criar bolhas.
4. Sob um microscópio dissecando, espalhe suavemente as câmaras de ovos médias e separadas de montagem usando uma nova ponta p200 ou fórceps para cobrir uma área aproximadamente do tamanho do deslizamento de tampas.
5. Usando fórceps, coloque cuidadosamente o deslizamento (limpo com papel sem poeira) nas câmaras de ovos em um ângulo para evitar bolhas.
6. Armazene o slide à temperatura ambiente em uma superfície plana no escuro por 2 dias para polimerizar. Uma vez que a mídia de montagem tenha curado, o slide pode ser armazenado a 4 °C no escuro por algumas semanas para imagens.
   NOTA: É importante que a configuração dura seja de médio a polimerização antes da imagem. Se o meio ainda não tiver polimerizado, os ovários flutuarão sob o deslizamento de cobertura, afetando a aquisição de imagens. Além disso, o índice reflexivo ideal da mídia de montagem só é alcançado depois que ele define completamente (veja as informações do fabricante para obter detalhes).
7. Método alternativo de montagem: Este método é recomendado para reduzir a perda de tecido se os ovários não forem abundantes. Neste método (descrito abaixo), separe as ovários e as câmaras de ovos na lâmina durante a montagem, em vez de separá-las em um tubo de microcentrífuga por pipetagem conforme descrito na etapa 5.1.
   1. Após a última lavagem, remova todos, menos ~100 μL da solução de lavagem. Usando uma pipeta Pasteur ou pipeta p1000, transfira os ovários intactos em PBS para o slide. Usando uma pipeta p200, remova cuidadosamente o máximo de PBST possível do slide. Use um papel sem poeira para limpar o PBST, se necessário. Não toque nos ovários.
   2. Adicione duas gotas de mídia de montagem. Separe cuidadosamente os ovários e câmaras de ovos usando fórceps ou agulhas dissecando. Remova e descarte tecidos ím lomos e, em seguida, espalhe as câmaras de ovos e os ovários no meio de montagem. Prossiga para as etapas 5.5-5.6.

6. Aquisição de imagem confocal

NOTA: Esta seção fornece parâmetros-chave para obter a aquisição de imagem ideal usando qualquer microscópio confocal (Figura 2).

1. Configure o microscópio e localize a amostra conforme descrito abaixo.
   1. Antes da imagem, é crucial localizar a região de interesse (ROI) usando a ocular do microscópio de fluorescência. Use um objetivo de baixa ampliação (20x) ou o objetivo a ser utilizado para aquisição de imagens (ou seja, 40x ou 63x). Selecione uma câmara de ovos para imagem.
      NOTA: Para aquisição de imagem, recomenda-se o uso de objetivos de alta ampliação, como 40x ou 63x (ver 6.2.1).
   2. Uma vez selecionado o ROI, proceda à aquisição de imagens; proceder à etapa 6.2 para imagem confocal e passo 7 para imagens de super-resolução.
2. Selecione os parâmetros-chave para a aquisição de imagens ideais conforme descrito abaixo (exemplos de parâmetros-chave para as imagens representativas são dados na Tabela 1).
   1. Selecionando um objetivo: Para aquisição de imagem confocal do tráfico intracelular e secreção de proteínas BM no FE, utilize um objetivo de 40x ou 63x.
      NOTA: Para alcançar a melhor resolução possível, o uso de objetivos do Plano-Apochromat, com alta abertura numérica (NA) que proporcionam a maior correção acrática, é altamente recomendado.
   2. Selecionando lasers para cada canal/faixa: Para GFP, use laser de 488 nm; para DAPI ou Hoechst, use laser 405 nm; para Alexa Fluor 546 ou 568, use laser 561 nm; e para Alexa Fluor 647, use laser de 640 nm.
      NOTA: Cada seleção a laser resultará em uma formação de canal/faixa diferente. Aqui, o termo canal refere-se à imagem formada pela distribuição de intensidade registrada para fluoroforos animados para o ROI selecionado no comprimento de onda específico de cada canal.
   3. Configuração pinhole: Para reduzir a luz fora de foco durante a aquisição de imagem, ajuste o pinhole para cada canal para 1 UA.
   4. Intensidade do laser e configurações de ganho de detector: Para ajustar a sensibilidade da imagem, use tanto o ganho mestre do detector quanto a potência do laser. Para definir adequadamente a sensibilidade da imagem, recomenda-se um indicador de intervalo. Defina tanto o ganho mestre quanto a potência laser para ter uma sensibilidade adequada onde as estruturas de interesse (por exemplo, vesículas contendo BM) são claramente visíveis enquanto evitam a saturação do detector.
      NOTA: Para evitar fotobleaching, use o mínimo de potência laser necessária. Recomenda-se aumentar o ganho do detector primeiro enquanto usa a menor potência laser possível. Se um aumento do ganho do detector não conseguir alcançar a intensidade desejada, então aumente a potência do laser. Recomenda-se a intensidade de potência a laser entre 0,5%-1,2%.
   5. Tamanho do quadro: recomenda-se usar o tamanho ideal da imagem determinado pelo software de aquisição. Para a maioria das aplicações, use uma resolução máxima de 1024 x 1024. Uma resolução mais alta aumentará significativamente o tempo de aquisição.
   6. Velocidade de varredura: Use uma velocidade de varredura entre 6-9, que é segura para a maioria das amostras. Se a amostra for barulhenta, use uma velocidade de varredura mais lenta para melhorar as relações sinal-ruído. No entanto, as baixas velocidades de varredura aumentam o tempo de fotobleaching e aquisição.
   7. Média de intensidade: Para melhorar a qualidade da imagem, use a média de intensidade através de varreduras sucessivas com configurações idênticas. Para a maioria dos casos, use uma média de dois para melhorar a relação sinal-ruído sem fotobleaching a amostra.
   8. Zoom: Ajuste a área de varredura usando a função zoom. Use um zoom entre 2x-4x com objetivos de 40x e 63x como o valor mais eficaz para visualizar claramente vesículas contendo BM no FE. Selecione cuidadosamente o ROI mínimo para reduzir o tempo de aquisição.
3. Para adquirir uma pilha z usando o software Zeiss Zen, use os seguintes parâmetros de seção Z e defina-os conforme descrito abaixo.
   NOTA: Vesículas e outras estruturas intracelulares contendo proteínas BM são estruturas tridimensionais (3D). A aquisição de uma pilha z através do FE melhorará significativamente a qualidade e a resolução da imagem. Normalmente, uma faixa que abrange a espessura/profundidade do tecido é suficiente para visualizar eficientemente a localização intracelular. Para uma reconstrução 3D ideal, recomenda-se o intervalo ideal determinado pelo software. Para objetivos de 40x e 63x, evite intervalos superiores a 0,5 μm entre cada seção z para permitir uma reconstrução 3D ideal.
   1. Clique na caixa de seleção z-Stack na área principal sob a guia Aquisição . Selecione o modo de varredura All Tracks Per Slice para a pilha z. Isso resultará em uma mudança nas faixas de canal para cada fatia de posição z.
   2. Selecione o canal desejado para observar o espécime e clique em Live para iniciar uma varredura ao vivo. Recomenda-se o uso do canal necessário para detectar a proteína BM marcada por GFP.
   3. Defina um intervalo para a pilha z conforme descrito. Usando o botão de ajuste fino no microscópio, encontre o local z para uma extremidade do espécime e clique em Definir Primeiro. Da mesma forma, encontre o z-location para a outra extremidade do espécime e clique em Set Last.
   4. Para cada localização na pilha z, clique em cada canal separadamente com o indicador de intervalo selecionado e ajuste a intensidade do laser e o ganho mestre conforme necessário, conforme descrito na etapa 6.2.4.
   5. Defina o intervalo para que a pilha z atribua o tamanho da etapa conforme recomendado na NOTA abaixo da etapa 6.3. Clique em Iniciar experimento para iniciar a aquisição de pilha de z.

7. Aquisição de imagem de super resolução

1. Selecione um objetivo compatível com Airyscan. Para visualizar a localização intracelular da proteína BM, o uso de um objetivo de óleo de 63x é ótimo (Figura 3). Defina o objetivo para 63x e coloque suavemente uma gota de óleo de imersão em sua lente. Posicione o slide sobre o objetivo com o deslizamento de cobertura voltado para o objetivo de localizar o espécime.
2. Selecione uma configuração com configurações apropriadas para a imagem do fluorohore à imagem conforme descrito abaixo.
   1. Clique no botão Configuração inteligente na guia Aquisição para configurar um novo experimento. Selecione Airyscan (super-resolução); quando este for selecionado, será necessária uma nova seleção entre Resolução (RS Airyscan), SNR/sensibilidade (Airyscan Confocal) e Speed (Multiplex SR-2Y). Para tecido fixo, selecione Resolução , pois isso resultará na melhor aquisição.
   2. Clique em + na caixa Configurar sua caixa De experiência para adicionar faixas/canais. Selecione as faixas para corantes específicos do Banco de Dados de Corantes. Para um experimento multicanal, adicione cada faixa conforme necessário, selecionando os corantes apropriados.
   3. Depois de todas as faixas terem sido adicionadas, selecione uma das propostas de experimento fornecidas pelo software. Para este experimento, use o Best Signal, pois embora a velocidade seja um pouco mais lenta em comparação com a proposta smartest (Line), ele criará as melhores configurações de hardware para cada corante, resultando em ganho máximo de sinal e mínimo de emissão crosstalk. Uma vez que o experimento tenha sido configurado e carregado, ele aparecerá na janela Configuração de imagem na guia Aquisição.
   4. Uma vez selecionada uma configuração inteligente, a gama de comprimentos de onda para o detector GaAsP-PMT será automaticamente selecionada. Ajuste o intervalo movendo a barra de rolagem na parte inferior para aumentar ou diminuir o alcance ou mover completamente o alcance para outra região, conforme necessário. Use isso para garantir que as faixas de dois canais diferentes não se sobreponham para evitar o crosstalk. Salve a configuração para reutilizar no futuro.
3. Uma vez definida a configuração, proceda para ajustar a área de zoom e varredura como na etapa 6.2.8. Otimize a área de varredura para focar na região de interesse para reduzir o tempo de varredura e o espaço de armazenamento. Prossiga para a aquisição de imagens.
4. Para cada canal individual, selecione uma faixa em Canal e clique em Live. Ajuste o ganho mestre e a potência do laser usando a ferramenta indicador de alcance conforme descrito na etapa 6.2.4 e siga todas as diretrizes descritas para evitar pixels saturados. Confirme se a visão do detector hexagonal está centrada e alinhada clicando no botão Airyscan Detector View . Na maioria dos casos, a visão do detector hexagonal é automaticamente centrada e alinhada. Repita para canais adicionais.
5. Na janela Desempesa do modo Aquisição, em Tamanho de Imagem, clique em SR (contagem de pixels limitada por super resolução) para maximizar os recursos do detector. Isso ajustará automaticamente o tamanho do quadro.
6. Mantenha a média de Nenhum , pois normalmente não é necessário, e isso diminuirá o tempo de varredura. Em alguns casos, uma média de 2x pode melhorar a relação sinal-ruído.
7. Colete dados brutos com profundidades de dados de 8 bits. Clique no Snap para adquirir uma imagem. Para adquirir uma pilha z, siga o passo 6.3.
8. Realize o processamento de imagens conforme descrito abaixo. Isso produzirá uma imagem de 16 bits.
   1. Uma vez que a imagem ou pilha z seja obtida, clique no Método de processamento > e selecione Processamento airyscan.
   2. Execute o filtro automático para iniciar e realize mais processamento manual alterando o valor de RS para obter os melhores resultados para a amostra. Uma vez determinado o valor de RS ideal, clique em Aplicar para gerar uma imagem processada. No caso de imagens de pilha de z, processe tanto como uma fatia z (Imagem Atual [2D]) ou como toda a pilha z clicando na caixa de processamento 3D .

8. Processamento de imagens e análise de dados (projeção ortogonal, reconstrução 3D e perfil de intensidade)

NOTA: Para este método, os passos utilizados para gerar projeções ortogonais, reconstruções 3D e perfis de intensidade são descritos para o software Zen (ver Tabela de Materiais). Análises de dados semelhantes também podem ser realizadas com o software ImageJ⁵⁶.

1. Realize projeção ortogonal conforme descrito abaixo (Figura 4).
   1. Uma vez que uma pilha z tenha sido obtida usando microscopia confocal ou super-resolução, gere uma projeção ortogonal para visualizar as vesículas no eixo z da célula em uma visão 2D (em comparação com a reconstrução 3D). Para fazer isso, clique no Método de processamento > e selecione Projeção Ortogonal.
   2. Sob parâmetros, selecione o plano de projeção necessário. Para uma projeção do eixo z (z-stack), selecione o plano Frontal (XY). Em Método, selecione Máximo para resultar na projeção de maior qualidade.
   3. Em seguida, determine a espessura da projeção selecionando a posição inicial (xir-fatia-z) e determine a espessura (número total de fatias z) na projeção. O ideal é selecionar a espessura igual à de uma célula no eixo z.
   4. Uma vez definidos os parâmetros, clique em Aplicar para criar a projeção da pilha z de forma de plano XY.
      NOTA: Ao criar projeções ortogonais de múltiplas pilhas de z para comparar a quantidade de um determinado objeto de interesse, é imperativo manter a espessura da projeção a mesma (ou o mais próxima possível) para a precisão dos dados.
2. Realizar reconstrução 3D conforme descrito abaixo (Figura 5).
   1. Crie reconstruções 3D de pilhas z para observar a localização e forma de estruturas. Faça isso para z-stacks adquiridos usando abordagens confocal e super-resolução. Processe as pilhas z de super resolução primeiro usando o processamento 3D como na etapa 7.8 para reconstrução 3D.
   2. Para gerar uma imagem 3D, clique no ícone 3D na janela de visualização. Uma vez clicada, uma guia 3D aparecerá na seção de controle de exibição na metade inferior da tela. As visualizações 3D, como Transparência, Volume, Máximo, Superfície e Mixed serão visíveis. Use vistas superficiais ou mistas ao visualizar a estrutura de vesículas (preferível).
   3. Para obter a imagem da mais alta qualidade, selecione a configuração Precisa , pois a configuração mais rápida será menos precisa e levará a uma má renderização 3D.
   4. Uma vez que a imagem tenha sido gerada, manipule-a girando e ampliando para focar em um local preferido para visualizar os objetos de interesse. Manipule a imagem 3D sob a guia Aparência .
   5. Uma vez que uma exibição satisfatória tenha sido obtida, na guia 3D, selecione Resolução exibida e, em seguida, clique em Criar imagem. Isso criará um instantâneo da imagem na mesma orientação que foi visualizada e pode ser salva e exportada em vários formatos de arquivo.
3. Gerar um perfil de intensidade conforme descrito abaixo (Figura 7).
   NOTA: Os perfis de distribuição e intensidade dos pixels associados aos diferentes sinais fluorescentes podem ser vistos como uma imagem de sobreposição para determinar sua colocalização.
   1. Uma vez que uma imagem ideal tenha sido adquirida através de imagens confocal ou super-resolução, no painel Exibir da janela Visualização , clique em Perfil. Na janela de visualização, aparecerá um histograma exibindo o perfil de intensidade em função da distância, bem como uma tabela mostrando distâncias e valores de intensidade.
   2. Na área de controles de exibição na parte inferior da tela, clique na Ferramenta seta na guia Definição de perfil . Desenhe uma seta ao longo do comprimento do objeto para o qual o perfil de intensidade dos diferentes pixels precisa ser avaliado. Para desenhar a seta, amplie a imagem.
   3. O perfil de intensidade aparecerá à esquerda da visualização da imagem, onde a distância e os picos correspondentes ao longo do caminho da seta serão exibidos. Para remover o histograma exibido na própria imagem, desmarque o perfil de exibição na caixa Gráficos .
   4. Na guia Dimensões na área de controle de exibição, desmarque todos os canais que não devem ser incluídos no perfil de intensidade.
   5. Na guia Gráficos , clique duas vezes no Perfil mostrado na caixa Anotações/Medidas para abrir a caixa pop-up De elementos gráficos formato . Use isso para mudar a cor da seta, bem como seu estilo e espessura do traçado. Feche a caixa depois de selecionar as configurações desejadas.
   6. Clique na guia Exibição do perfil . Na nova seção de imagem, clique em Exibir a exibição e, em seguida, em Salvar como salvar o arquivo. Recomenda-se salvar o arquivo como um arquivo .tif para evitar compactação e perda de dados.

Resultados

Os métodos aqui descritos podem ser utilizados para imagem eficiente e precisa e caracterizar o tráfico intracelular e secreção de proteínas BM em células epiteliais polarizadas, como a FE do ovário de Drosophila . Em seguida, fornecemos resultados antecipados obtidos usando os métodos descritos, bem como conselhos úteis e potenciais armadilhas. Para isso, é utilizado O Vkg-GFP, um Vkg com etiqueta endógena (Drosophila Col IV). No entanto, os mesmos resultados podem ser alcançados com outras...

Discussão

O BM é fundamental para morfogênese embrionária e de órgãos, e funções fisiológicas adultas. Além disso, o BM atua como uma plataforma de sinalização para o estabelecimento e manutenção da polaridade epitelial e fornece tecidos com suporte². No entanto, os mecanismos que regulam a colocação adequada das proteínas BM são mal compreendidos. Uma melhor compreensão das vias biológicas dedicadas ao tráfico intracelular e à secreção polarizada das proteínas BM requer uma análise...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 546 phalloidin	Invitrogen	A22283	F-Actin Stain (1/500 of 66µM)
Alexa Fluor 647 phalloidin	Invitrogen	A22287	F-Actin Stain (1/100 of 66µM))
Anti-GM130 Antibody	abcam	ab30637	For Golgi Stain (colocalization); use as concentration of 7µg/uL
Aqua-Polymount	Polysciences, Inc.	1860620	Mounting Medium
Bakers Yeast (Active Dry Yeast)	Genesee Scientific	62-103	To fatten the overies for dissection
Bovine Serum Albumin (30% solution)	Sigma-Aldrich	A7284	For blocking solution
Depression wells	Electron Microscopy Sciences	7156101	For dissection (glass concavity slide can be used instead)
Dissecting needle	Fisher scientifc	13-820-024
Drosophila Incubator	Genesee Scientific/Invictus
Fly Stock: Perlecan-GFP Drosophila line (ZCL1700)			Morin et al., 2001
Fly Stock: UAS-Crag RNAi line (TRIP line HMS00241)	Bloomington Drosophila Stock Center	33594	RNAi against Crag
Fly Stock: Viking-GFP Drosophila line (CC00791)			Buszczak et al., 2007
Fly Stock: Vkg-GFP, tj-Gal4			Devergne et al., 2017. Drive the expression of Crag RNAi in the FE
Forceps (Dumont 5)	Fine Science Tools	11251-30	For dissection
Glass Concavity Slide	Electron Microscopy Sciences	7187804	For dissection (depression wells can be used instead)
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568	Invitrogen	A11036	Secondary antibody (GM130 antibody) (5 µg/mL)
Hoechst (Hoechst 33342)	Invitrogen	H3570	DNA Stain (1 ug/mL)
Kimwipes	Kimtech	Fisher Scientific: 06-666	Delicate task wipers
Leica Fluorescent Stereo Microscope  M165 FC	Leica		For ovary imaging
Microscope Slides	Corning	294875X25	Microscope Slides
Nutating platform rocker	Corning Life Sciences	6720	For ovary fixation and staining
Nutri-Fly BF	Genesee Scientific	66-121	Fly Food
Paraformaldehyde 20% Solution	Electron Microscopy Sciences	Fisher Scientific: 15713	For PFA 4%
Phosphate Buffered Saline Tablets	Fisher scientific	BP2944100	For PBS solution
ProLong Glass Antifade Mountant	Invitrogen	P36980	Mounting Medium
Square Cover Glass	Corning	285022	Cover glass for microscope slides
Triton x-100	Sigma-Aldrich	9036-19-5	For PBST
Zeiss LSM 900 with Airyscan 2	Zeiss		Confocal and super-resolution Microscope
Zeiss Stemi 305 Stereo Microscope	Zeiss		Dissecting microscope
Zeiss Zen Software version 3.3 (Blue Edition)	Zeiss		Image acquisition and processing