Method Article
Tip 1 diyabet, çölyak hastalığı ve koronavirüs hastalığı 2019 için acil tarama ihtiyacı doğrultusunda, dört adacık otoantikorlarını, doku transglutaminaz otoantikorlarını ve şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2'nin reseptör bağlanma alanına karşı antikorları aynı anda tespit etmek için yüksek verimli bir 6-Plex elektrokemilüminesans testi geliştirdik.
Devam eden bir klinik çalışma olan Çocuklar için Otoimmünite Taraması (ASK), Amerika Birleşik Devletleri'nde tip 1 diyabet (T1D) ve çölyak hastalığı için genel popülasyondaki ilk tarama çalışmasıdır. Koronavirüs hastalığı 2019 (COVID-19) pandemisi ile birlikte, genel popülasyonda COVID-19'un epidemiyolojisine ve COVID-19 enfeksiyonu ile T1D gelişimi arasındaki ilişki hakkında bilgiye acilen ihtiyaç duyulmaktadır. Radyo bağlama testinin (RBA) şu anda standart tarama yöntemi iki büyük zorluğu karşılamıştır: tek bir tahlil formatı ile düşük verimlilik ve taramada üretilen düşük afiniteli antikorların büyük bir kısmı ile düşük hastalık özgüllüğü. Daha önce kurduğumuz multipleks elektrokemilüminesans (ECL) testinin platformuyla, dört adacık otoantikorunun (IAbs) tümünü tek bir kuyucukta insülin, glutamik asit dekarboksilaz (GAD65), insülinoma antijeni 2 (IA-2) ve T1D için Çinko taşıyıcı 8 (ZnT8), çölyak hastalığı için transglutaminaz otoantikorları (TGA) ve şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2 (SARS-CoV-2) reseptör bağlayıcı etki alanı (RBD) antikorlarına birleştiren yeni bir 6-Plex ECL testi geliştirilmiştir. COVID-19. Tahlil, 325 pozitif örnek ve 555 tüm antikor-negatif örnek dahil olmak üzere ASK çalışmasından 880 örnek kullanılarak kör olarak doğrulandı ve standart RBA'lar ve tek bir ECL testi ile karşılaştırıldı. Yüksek verimlilik, düşük maliyet ve düşük serum hacminin avantajları ile bu tahlil, ASK çalışması için birincil tarama aracı olarak kabul edilmiştir.
Dünya çapında yapılan büyük epidemiyolojik çalışmalar, tip 1 diyabet (T1D) insidansının yılda %3-5 oranında hızla arttığını ve T1D prevalansının son 20 yılda, özellikle küçük çocuklarda iki katına çıktığını göstermektedir 1,2. Adacık otoantikorları (IAbs) genellikle klinik semptomlardan yıllar önce ortaya çıkar ve şu anda T1D3 için en güvenilir prediktif ve tanısal biyobelirteçlerdir. T1D otoantikorlarının taranması, klinik T1D'ye ilerleme riski taşıyan kişileri belirleyebilir, halkı eğitebilir, ketoasidozun hayatı tehdit eden komplikasyonunu büyük ölçüde azaltabilir ve önleme tedavileri için klinik çalışmalara fayda sağlayabilir. T1D için dünya çapında önleme çabaları devam etmektedir ve klinik T1D'ye ilerlemeyi geciktirmek için IAbs pozitif olan denekler arasında çoklu girişimsel çalışmalar yürütülmektedir ve Barbara Davis Diyabet Merkezi, 2016 yılında T1D ve çölyak hastalığı için genel popülasyonda taramanın ilk ABD klinik denemesini başlattı, Çocuklar için Otoimmünite Taraması (ASK)4 . Çölyak hastalığı (ÇH), immün ve genetik faktörlere bağlı kronik intestinal inflamatuar bir hastalıktır. T1D'li çocuklarda ÇH prevalansı %24,5'e kadar çıkabilir5. CD'li bireylerin yarısından fazlasında prezentasyon6'da tipik semptomlar olmayabilir, bu nedenle çölyak hastalığı için serolojik tarama oldukça gereklidir.
Koronavirüs hastalığı 2019 (COVID-19) pandemisinin başlamasından bu yana, dünya çapında 200 milyondan fazla vaka bildirilmiştir ve çocuklar laboratuvar tarafından doğrulanmış vakaların% 16'sını oluşturmaktadır7. Birçok çalışma, mevcut T1D'nin COVID-19 enfeksiyonu8'in ciddiyeti ve ölümü üzerindeki etkisini gösterirken, COVID-19 enfeksiyonunun T1D gelişimi üzerindeki etkisi açık değildir. Şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2 (SARS-COV-2) antikorlarının belirlenmesi ve COVID-19 enfeksiyonu ile T1D otoimmünitesinin tetiklenmesi veya T1D progresyonunun hızlandırılması arasındaki ilişkinin incelenmesi ile genel popülasyonda COVID-19 enfeksiyonunun toplam oranının araştırılması acilen gerekli ve çok önemlidir, devam eden ASK çalışması ise bunun için mükemmel bir platformdur. Tek tahlil formatı ve büyük oranda düşük afiniteli antikor pozitifliğinin üretilmesi nedeniyle, standart radyo-bağlayıcı tahlil (RBA) düşük verimlilik ve düşük hastalık özgüllüğü9 darboğazını karşılamıştır. Bu yazıda, bir multipleks ECL test platformumuz üzerine inşa edilmiş, altı otoantikor testini tek bir kuyuda birleştiren, dört ana IAb'nin insülin (IAA), glutamik asit dekarboksilaz-65 (GADA), insülinoma antijen-2 (IA-2A) ve Çinko transport-8 (ZnT8A), çölyak hastalığı için transglutaminaza (TGA) otoantikorları da dahil olmak üzere tek bir kuyucukta birleştiren yeni bir 6-Plexed elektrokemilüminesans (ECL) testi sunuyoruz. ve SARS-CoV-2 reseptör bağlayıcı etki alanı (RBD) antikorları (COVID-19A). Bu, dört büyük IAbs'den oluşan eksiksiz bir paneli işe alan ve bunu TGA ve COVID-19A ile birleştiren ilk multipleks tahlildir. ASK çalışmasında standart RBA'nın yerini alan birincil tarama aracı olarak doğrulanmış ve resmi olarak kabul edilmiştir.
Araştırma protokolü Colorado Çoklu Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylandı.
1. Tampon Hazırlama
2. Biotin ve Ru Sulfo-NHS ile ayrı ayrı antijen protein etiketlemesi
NOT: Daha yüksek etiketleme verimliliği için daha yüksek konsantrasyonda antijen proteini ≥0.5 mg/mL önerilir.
3. 6-Plex ECL testi (dama tahtası testi) için biyotin ve Ru Sulfo-NHS etiketli antijenler için en iyi konsantrasyonu ve oranları tanımlayın
NOT: Her antijen için dama tahtası testi, çoğullanmış teste entegre edilmeden önce gereklidir.
4. Bağlayıcı bağlantılı antijen çözeltisi oluşturun
5. Serum örneklerini etiketli antijenle inkübe edin
6. 6-Plex plakayı hazırlayın
7. Serum/antijen inkübatörlerini 6-Plex plakaya aktarın
8. 6-Plex plakayı yıkayın ve okuma tamponu ekleyin
9. Plakayı okuyun ve verileri analiz edin
Tablo 1, Tablo 2 ve Tablo 3 temsili sonuçları göstermektedir. Okuma makinesinden elde edilen ham CPS Tablo 1'de gösterilmiştir. Tablo 2'de, ham CPS altı bağlayıcı ve karşılık gelen antikorlar tarafından düzenlenmiş ve sıralanmıştır. Tablo 3, tahlil protokolünde açıklandığı gibi CPS ile hesaplanan indeks değerlerini göstermektedir. Kötü kopyaların neden olduğu yanlış nihai dizin sonuçlarını önlemek için tüm ham sayım değerleri kontrol edilmelidir. Tablo 1'de, Tablo 3'teki son dizin hesaplamasında hataya neden olan hatalı yineleme örnekleri verilmiştir.
Bu tahlil, 325 IAbs pozitif numune ve 555 tüm Abs negatif numune ile ASK çalışmasından seçilen 880 örnek kullanılarak kör bir şekilde doğrulanmıştır. 880 numune için 6-Plex ECL testinden elde edilen otoantikorların seviyeleri, karşılık gelen tek ECL tahlillerinin seviyeleri (Şekil 2) ve karşılık gelen tek standart RBA (Şekil 3) ile noktadan noktaya karşılaştırıldı. Her bir antikor için kesik, duyarlılık ve özgüllük Tablo 4'te listelenmiştir. Bu ECL-COVID-19A testinin duyarlılığı ve özgüllüğü sırasıyla %100 ve %99,9,10 olarak tanımlanmıştır.
Resim 1: 6-Plex ECL testinin çizimi. Serum otoantikorları, Ru Sulfo-NHS etiketli antijenin, spesifik bir bağlayıcı ile birleştirilen ve bir antijen-antikor-antijen-bağlayıcı kompleksi oluşturan biyotinile antijene bağlanmasını sağlar. Kompleksler, her bir özel bağlayıcı aracılığıyla 6-Plex plakadaki belirli noktalara yakalanır. Her antijen için spesifik bağlayıcı numaraları atandı: GAD-linker-1, Covid-19-linker-2, IA-2-linker-3, tTG-linker-8, ZnT8-linker-9 ve Proinslulin-linker-10. Bu rakam He ve ark.11'in izniyle değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: ASK çalışmasından alınan 880 örnekte altı antikor seviyesinin tek ECL testi ile 6-Plex ECL testi arasında karşılaştırılması. Panellerde sırasıyla GADA, IAA, IA-2A, ZnT8A, TGA ve COVID-19A için antikor düzeylerinin karşılaştırmaları gösterilmektedir (COVID-19A indeksi (100 x hesaplanan indeks değeri) olarak sunulmuştur). Noktalı çizgiler, her antikor testi için tahlil kesiklerini temsil eder. Bu rakam He ve ark.11'in izniyle değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: RBA ve 6-Plex ECL testi arasındaki ASK çalışmasından 880 örnekte beş antikor seviyesinin karşılaştırılması. Paneller sırasıyla GADA, IAA, IA-2A, ZnT8A ve TGA için antikor seviyelerinin karşılaştırmalarını göstermektedir. Noktalı çizgiler, her antikor testi için tahlil kesiklerini temsil eder. Bu rakam He ve ark.11'in izniyle değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: Ham CPS sayıları (plakanın sol yarısı). Ham CPS, bir tahlil plakasının sol yarısından elde edilen sayımlardır. Her örnek çift olarak gerçekleştirilir. Aynı sütundaki her CPS sayımı (A1, A2, A3, vb.) aynı kuyucuktaki 10 noktadan okuma verilerini temsil eder (karşılık gelen bağlayıcı sayıları işaretlenir). Hatalı yineleme örnekleri, satır D-linker 3 sütun 5 ve sütun 6'da görüldüğü gibi gri renkle vurgulanır. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Tablo 2: Altı bağlayıcı ile sıralanmış Tablo 1 verilerinin düzenlenmesi. Tablo 1'deki CPS değerleri, CPS'nin yinelenen okumaları için ortalama değerler hesaplanarak ve 4-7 bağlayıcıları için kullanılmayan değerler silinerek yeniden düzenlenmiştir. Her otoantikor testinin dahili standart yüksek pozitif, düşük pozitif ve negatif kontrollerinin değerleri koyu kalın olarak işaretlenmiştir. PC, pozitif kontrol. NC, negatif kontrol. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Tablo 3: Dizin değerlerinin sonuçları. Altı antikorun tümü için her numunenin indeks değerleri, karşılık gelen pozitif ve negatif kontrollere karşı hesaplandı. Kesme değerinden daha büyük bir endeks değeri, koyu kalın olarak işaretlenmiş pozitif olarak tanımlanmıştır. Tablo 1'deki hatalı yinelenen CPS değerleri, satır D-bağlayıcı 3-sütun 5 ve 6, örnek 11'in (gri renkle vurgulanmış) pozitif bir IA-2A dizin değerine yol açtı ve bu muhtemelen yanlış pozitif bir sonuçtu. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Tablo 4: 325 IAbs pozitif numune ve 555 tüm antikorlar negatif numune dahil olmak üzere 880 ASK numunesi arasında GADA, IA-2A, ZnT8A, IAA ve TGA için tahlil kesme, duyarlılık ve özgüllük. GADA, IA-2A, ZnT8A, IAA ve TGA testinin optimal kesme indeksi değeri, 555 normal kontrol örneğinin en az 99. yüzdelik dilimine ayarlanmıştır. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
T1D'ye müdahale, T1D için devam eden ulusal ve uluslararası büyük ölçekli tarama programları ve klinik T1D 12,13'e ilerlemeyi iptal etmek veya yavaşlatmak için aşama 1 T1D'de uygulanan patlayan klinik çalışmalarlaT1D öncesi döneme girmiştir. Tek bir IAb tahlil formatına sahip mevcut standart RBA'yı kullanarak dört IAb'nin ölçülmesi, bir kitle tarama programı için zahmetli ve verimsizdir. Yüksek verimli çoklanmış IAbs testi, çoklanmış ECL testi, 3 Ekranlı ICA ELISA ve aglütinasyon-PCR (ADAP) ile antikor tespiti için acil talep ile şu anda rekabetçi teknolojiler olarak ortaya çıkmıştır. Almanya'daki küçük çocuk popülasyonunda T1D taramasının Fr1da çalışmasında, ana test14 olarak 3 IAb'yi (GADA, IA-2A ve ZnT8A) birleştiren 3 Ekranlı ICA ELISA kullanılmıştır. 3 Ekranlı ICA ELISA'nın önemli bir sınırlaması, çoğunlukla T1D'li küçük çocuklarda yüksek prevalansı olan ilk IAb olan IAA'nın olmamasıdır. Ayrıca, tahlil üç IAbs'den hangisinin pozitif bir sinyalden pozitif olduğunu ayırt edemez ve her pozitif numunenin onay için üç tek tahlille tekrarlanması gerekir. ADAP15, GADA, IA-2A ve IAA'yı birleştirir ve IASP çalıştayında yüksek tahlil duyarlılığı ve özgüllüğü göstermiştir, ancak IASP çalıştayının belirleyemediği T1D çalışmaları için popülasyon tabanlı taramada ne kadar öngörücü olduğuna dair verilerden yoksundur. Bu çalışmadaki multipleks ECL testi, TrailNet 9,16, DAISY 17,18,19 ve ASK 4,20,21 gibi çoklu klinik çalışmalarda mevcut standart RBA'ya karşı doğrulanmış tek bir ECL testinin platformu üzerine inşa edilmiştir. okumak. Mevcut tahlil, ASK çalışmasının katılımcılarından 880 serum örneği kullanılarak hem RBA hem de tek ECL testine karşı doğrulanmıştır. Şekil 2 ve Şekil 3'te gösterildiği gibi, 6-Plex ve tek ECL arasındaki veya 6-Plex ve RBA arasındaki antikor seviyeleri, antikorların pozitifliği için çoğunlukla birbirleriyle uyumluydu. RBA ve 6-Plex ile test edilen IAbs'lerin tesadüf oranları %91.7-97.8, tek ECL ve 6-Plex ile test edilen IAbs'lerin tesadüf oranları ise %95.3-%99.2 idi. ECL testi ve RBA arasındaki uyumsuzluk esas olarak tek IAb'li olanlardan kaynaklanıyordu. 6-Plex ve tek ECL (r = 0.6431-0.9434, tüm p < 0.0001) ve 6-Plex ve RBA (r = 0.5775-0.8576, tüm p < 0.0001) ile test edilen IAbs seviyeleri de iyi korelasyona sahipti. 6-Plex testi ile test edilen TGA, hem RBA (% 99.4) hem de tek ECL testinin (% 99.4) sonuçları ile yüksek oranda korelasyon göstermiştir. Ek olarak, 6-Plex tarafından test edilen COVID-19A, tek ECL testinin sonuçlarıyla %99,8 uyumluluğa ulaşmıştır.
Sonuç olarak, 6-Plex ECL testi, devam eden ASK çalışması için birincil tarama yöntemi olarak resmen kabul edilmiş ve standart RBA22'nin yerini almıştır. Bu test, standart RBA ile karşılaştırıldığında daha yüksek verim, daha düşük maliyet ve daha az serum hacmi ile mükemmel hassasiyetini ve özgüllüğünü göstermiştir.
T1D tarama çalışmasında, IAb pozitifliklerinin büyük bir bölümünü kaplayan RBA tarafından tespit edilen tek IAb'nin, düşük hastalık riski ile düşük afiniteye sahip olduğu ve genel olarak düşük prediktif değer 19,21,23,24,25,26 ile sonuçlandığı belgelenmiştir. Bu kadar düşük risk tahmini, takip ziyaretlerinin büyük ekstra maliyetlerine neden olmuş ve T1D önleyici çalışmalar için zorluklara neden olmuştur. Kurulan ECL tahlil platformu, RBA tarafından üretilen düşük afiniteli IAb'lerden yüksek afiniteli IAb'leri ayırt etmek ve özellikle tek IAb pozitifliği 16,17,18,21 ile dört IAb'nin tümü için öngörücü değerleri önemli ölçüde artırmak için birden fazla klinik çalışmada gösterilmiştir. . Multipleks ECL testi teknolojisi, yüksek afiniteli Abs'nin tespitinin bu belirgin avantajı ile tek ECL testinin platformu üzerine inşa edilmiştir. Bu çalışmada, 6-Plex ECL testi, duyarlılık ve özgüllük açısından karşılık gelen tek ECL testleri ile benzerliğini göstermiştir.
Birden fazla Plex plaka kullanan multipleks ECL testinin bazı sınırlamaları ve teknik kaygıları daha önceki yayınlarda zaten ele alınmıştır27,28. Bir kuyucukta altı etiketli antijen ile, farklı antijenler arasında bazı etkiler olabilir ve aynı kuyucukta çoklama için her bir antikor testi eklenirken tahlil arka planı artabilir. Tahlil koşullarını ayarlamak için, özellikle de her bir antijen için dama tahtası testine dayanan her etiketli antijen proteininin nihai konsantrasyonlarını ayarlamak için, her bir antikor testinin duyarlılığını ve özgüllüğünü korumak için büyük miktarda tahlil optimizasyonu çalışması gereklidir. Önceki çalışmalarda belirtildiği gibi27,28, az sayıda örnek (<%1), altta yatan açık bir neden olmaksızın çoklu Plex plakasında yanlış pozitifliğe neden olur. Tüm olumlu sonuçlar tekrarlanmalı ve rutin laboratuvar kalite güvencesi olarak tek bir ECL testi ile doğrulanmalıdır; genellikle, yanlış pozitifler kaldırılacaktır. Önceki 7-Plex ECL testi27,28'de gözlenen "prozon etkisinin" neden olduğu yanlış negatif sonuçlar bu çalışmada gözlenmemiştir. Burada açıklanan tahlilde, serum örneklerinin asit tedavisinin adımını önceki protokolden çıkardık; Bunun yerine, serum örneklerini 56 ° C'de 30 dakika boyunca önceden ısıttık (adım 5.1.). Plaka yıkamanın ikinci gününde, plakayı daha sıkı bir şekilde yıkamak için normal yıkama tamponu yerine 0,4 M NaCl (adım 8,1.) içeren bir yıkama tamponu kullandık. Bu değişiklikler, multipleks ECL testini daha basit hale getirdi ve tahlil hassasiyetini kaybetmeden arka planı alçalttı.
Sonuç olarak, bu tahlil aynı anda dört IAb, TGA ve COVID-19A'yı tespit etmek için olağanüstü bir performansa sahiptir. Çoklama özelliğinin yanı sıra yüksek verim, düşük maliyet ve küçük serum hacmi gereksinimi, T1D ve eşlik eden hastalıklar için büyük ölçekli taramayı genel popülasyonda çok daha uygulanabilir hale getirir. T1D veya herhangi bir otoimmün hastalığı olan hastalar diğer otoimmün hastalıklar için çok daha yüksek bir riske sahiptir. Multipleks ECL testi, T1D ve çoklu otoimmün hastalıkları aynı anda taramak için mükemmel bir platform sağlar.
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Çalışma JDRF hibe 2-SRA-2019-695-S-B, 2-SRA-2020-965-S-B, 1-SRA-2017-564-M_N, NIH hibe DK32083 ve Diyabet Araştırma Merkezi (DRC) hibe P30 DK116073 tarafından desteklenmiştir.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
5 mM NaCl | ThermoFisher | 1070832 | |
96-well Plate Shaker | VWR | 12620-926 | |
96-well round bottom plate | Fisher | 8408220 | |
Biotin | ThermoFisher | PI21329 | |
Blocker A | MSD | R93AA | |
Bottle-Top 500 ml-Filter Units | Fisher | 0974064A | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A-7906 | |
GAD65 protein | Diamyd Medical | 10-65702-01 | |
IA-2 protein (aa 605-979) | Creative BioMart | 283309 | |
MESO QuickPlex SQ120 | MSD | R31QQ-3 | Electrochemiluminescence analyzer |
PBS 10x | ThermoFisher | 70011044 | |
PBS 1x | ThermoFisher | 10010023 | |
Proinsulin protein | AmideBio | 20160118B3 | |
Read buffer B | MSD | Y0800019 | |
SARS-CoV-2 RBD protein | Creative Biomart | Spike-190V | |
Stop Solution | MSD | Y0090019 | |
Sulfo-TAG | MSD | R91AO-1 | |
tTG protein | Diarect AG | 15201 | |
Tween 20 | Sigma | P-1379 | |
U-Plex 6-Assay SECTOR plate | MSD | Z00U0142E | 6-plex plate |
U-PLEX Linker 1 | MSD | L0010022 | |
U-PLEX Linker 10 | MSD | L0100020 | |
U-PLEX Linker 2 | MSD | L0020015 | |
U-PLEX Linker 3 | MSD | L0030018 | |
U-PLEX Linker 8 | MSD | L0080018 | |
U-PLEX Linker 9 | MSD | L0090014 | |
ZeBa Column | ThermoFisher | 89892 | Spin columns |
ZnT8 protein | Research Laboratory | n/a |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır