Высокопроизводительный мультиплексированный скрининг на диабет 1 типа, целиакию и COVID-19

Резюме

В соответствии с настоятельной необходимостью скрининга диабета 1 типа, целиакии и коронавирусной болезни 2019 года мы разработали высокопроизводительный электрохемилюминесцентный анализ 6-Plex для одновременного обнаружения всех четырех островковых аутоантител, аутоантител тканевой трансглутаминазы и антител к рецепторсвязывающему домену коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома 2.

Аннотация

Продолжающееся клиническое испытание, аутоиммунный скрининг для детей (ASK), является первым скрининговым исследованием среди населения в целом на диабет 1 типа (T1D) и целиакию в Соединенных Штатах. С пандемией коронавирусной болезни 2019 года (COVID-19) срочно необходимы эпидемиология COVID-19 среди населения в целом и знания о связи между инфекцией COVID-19 и развитием СД1. В настоящее время стандартный метод скрининга радиосвязывающего анализа (RBA) столкнулся с двумя серьезными проблемами: низкой эффективностью при одном формате анализа и низкой специфичностью заболевания с большой долей низкоаффинных антител, генерируемых при скрининге. С помощью платформы мультиплексного анализа электрохемилюминесценции (ECL), который мы установили ранее, был разработан новый анализ ECL 6-Plex, который объединяет в одной лунке все четыре островковых аутоантитела (IAbs) с инсулином, декарбоксилазой глутаминовой кислоты (GAD65), антигеном инсулиномы 2 (IA-2) и транспортером цинка 8 (ZnT8) для T1D, трансглутаминазными аутоантителами (TGA) для целиакии и тяжелого острого респираторного синдрома коронавируса 2 (SARS-CoV-2) рецептор-связывающих доменов (RBD) антител для антител к рецептор-связывающему домену (RBD) тяжелого острого респираторного синдрома COVID-19. Анализ был проверен вслепую с использованием 880 образцов из исследования ASK, включая 325 положительных образцов и 555 всех отрицательных образцов на антитела, и сравнивался со стандартными RBA и одним анализом ECL. Благодаря преимуществам высокой эффективности, низкой стоимости и низкого объема сыворотки, этот анализ был принят в качестве основного инструмента скрининга для исследования ASK.

Введение

Крупные эпидемиологические исследования во всем мире показывают, что заболеваемость диабетом 1 типа (СД1) быстро растет на 3-5% ежегодно, а распространенность СД1 удвоилась за последние 20 лет, особенно у маленьких детей ^1,2. Островковые аутоантитела (IAbs) обычно появляются за годы до клинических симптомов и в настоящее время являются наиболее надежными прогностическими и диагностическими биомаркерами для T1D³. Скрининг на аутоантитела T1D может идентифицировать людей, подверженных риску прогрессирования до клинического T1D, просвещать общественность, в значительной степени уменьшать опасные для жизни осложнения кетоацидоза и приносить пользу клиническим испытаниям для профилактической терапии. Во всем мире предпринимаются усилия по профилактике СД1, и проводятся многочисленные интервенционные испытания среди субъектов с положительным IAbs, чтобы задержать прогрессирование клинического СД1, а Центр диабета Барбары Дэвис запустил первое в США клиническое испытание скрининга среди населения в целом в 2016 году на СД1 и целиакию, аутоиммунный скрининг для детей (ASK)⁴ . Целиакия (БК) является хроническим кишечным воспалительным заболеванием, связанным с иммунными и генетическими факторами. Распространенность БК у детей с СД1 может достигать до 24,5%⁵. Более половины людей с БК могут не иметь типичных симптомов при презентации⁶, поэтому серологический скрининг на целиакию совершенно необходим.

С начала пандемии коронавирусной болезни 2019 года (COVID-19) во всем мире зарегистрировано более 200 миллионов случаев заболевания, а на детей приходится до 16% лабораторно подтвержденных случаев⁷. Многие исследования продемонстрировали влияние существующего СД1 на тяжесть и летальность инфекции COVID-19⁸, в то время как влияние инфекции COVID-19 на развитие СД1 неясно. Исследование общего уровня заражения COVID-19 в общей популяции путем определения антител к коронавирусу 2 тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-COV-2) и изучение связи между инфекцией COVID-19 и запуском аутоиммунитета T1D или ускорением прогрессирования T1D срочно необходимы и очень важны, в то время как продолжающееся исследование ASK является отличной платформой для этого. Благодаря единому формату анализа и генерации значительной доли положительности антител с низким сродством, стандартный радиосвязывающий анализ (RBA) столкнулся с узким местом низкой эффективности и низкой специфичности заболевания⁹. В настоящей статье мы представляем новый 6-плексированный электрохемилюминесцентный анализ (ECL), построенный на нашей предыдущей мультиплексной платформе анализа ECL с использованием пластины multiple-Plex, объединяющей шесть анализов аутоантител в одной лунке, включая все четыре основных IAbs к инсулину (IAA), декарбоксилазе глутаминовой кислоты-65 (GADA), антигену инсулиномы-2 (IA-2A) и транспорту цинка-8 (ZnT8A), аутоантителаминазе к трансглутаминазе (TGA) для целиакии, и антитела к SARS-CoV-2 рецептор-связывающему домену (RBD) (COVID-19A). Это первый мультиплексный анализ, который набрал полную группу из четырех основных IAb и в дальнейшем объединил это с TGA и COVID-19A. Он был подтвержден и официально принят в качестве основного инструмента скрининга, заменяющего стандартный RBA в исследовании ASK.

протокол

Протокол исследования был одобрен Колорадским советом по множественному институциональному обзору.

1. Подготовка буфера

1. Подготовьте буфер маркировки (2x PBS, pH 7,9): Добавьте 100 мл 10x PBS к 400 мл дистиллированной воды и отрегулируйте pH с помощью NaOH до 7,9.
2. Сделать 3 мМ биотина и Ru Sulfo-NHS: Растворить 1 мг биотина в 588 мкл буфера маркировки и растворить 150 нмоль Ru Sulfo-NHS в 50 мкл буфера маркировки.
3. Подготовьте буфер антигена (1% BSA): Растворите 5 г бычьего сывороточного альбумина (BSA) в 500 мл 1x PBS.
4. Подготовьте буфер покрытия (3% Блокатор А): Растворите 15 г блокатора А в 500 мл 1x PBS.
5. Подготовьте первый промывочный буфер (0,05 % Tween 20, PBST): Смешайте 2,5 мл Tween 20 в 5000 мл 1x PBS.
6. Подготовьте второй промывочный буфер (0,4 М NaCl): Смешайте 50 мл 5 М NaCl в 575 мл дистиллированной воды, чтобы получить раствор 0,4 М NaCl.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для эффективной маркировки всегда используйте свежеприготовленные растворы биотина и Ru Sulfo-NHS, а не хранящиеся, изготовленные ранее.

2. Маркировка белка антигена биотином и Ru Sulfo-NHS отдельно

ПРИМЕЧАНИЕ: Для повышения эффективности маркировки рекомендуется более высокая концентрация белка антигена ≥0,5 мг/мл.

1. Готовят шесть целевых белковых растворов антигена, включая проинсулин, GAD-65, IA-2, ZnT8, TG и рецептор-связывающий домен (RBD) спайкового белка SARS-CoV-2. Рассчитайте моли каждого белка антигена в соответствии с его молекулярной массой и сделайте соответствующие молярные соотношения биотина или Ru Sulfo-NHS. Отношение антигена к сумме биотина или Ru Sulfo-NHS составит 1:5 для малых молекулярных антигенов (молекулярная масса ≤10 kd), таких как белок проинсулина. Для среднемолекулярных антигенов (молекулярная масса 10-50 кд), таких как ZnT8, соотношение будет корректироваться до 1:10. Для больших молекулярно-весовых антигенов (молекулярная масса >50 кд), таких как GAD, молярное соотношение составит 1:20.
2. Разделите белок антигена на две равные части и отдельно смешайте его с биотином и Ru Sulfo-NHS, используя рассчитанное молярное соотношение на этапе 2.1. Инкубировать смесь при комнатной температуре (RT) в течение 1,5 ч, избегая света.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все восстанавливающие химические вещества, такие как Трис или глицин в буфере белка антигена, должны быть удалены размерной спиновой колонкой, загрунтованной буфером 2x PBS (рН 7,9).
3. Загрунтуйте спиновые колонки 2x PBS (размер спиновой колонки, 2 мл или 5 мл, зависит от объема белка антигена маркировки): Добавьте 1 мл 2x буфера PBS в спиновую колонку, центрифугируйте его при 1000 x g в течение 2 мин и повторите шаг еще в 2 раза.
4. Пусть антигенный белок-биотин или смесь -Ru Sulfo-NHS проходят через загрунтованную спиновую колонку 1x (центрифугировать колонку на 1000 х г в течение 2 мин) для очистки и остановки реакции маркировки.
5. Измерьте конечный объем меченого белка антигена, элюированного из спиновых колонок, рассчитав концентрации биотин- или Ru Sulfo-NHS-меченого белка антигена. Сделайте меньшие аликвоты меченого антигенного белка (50 мкл / пробирка) и храните их при -80 ° C для длительного использования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Покрытие белка после каждой спиновой колонки будет составлять приблизительно 90%-95% коэффициент удержания.

3. Определите наилучшую концентрацию и соотношение для антигенов, меченных биотином и Ru Sulfo-NHS, для анализа 6-Plex ECL (шахматный анализ)

ПРИМЕЧАНИЕ: Шахматный анализ для каждого антигена необходим перед интеграцией в мультиплексированный анализ.

1. Нанесите шахматный анализ на каждый антиген отдельно.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 3.2.-3.7. будет использовать TGA в качестве краткого примера. Процесс шахматного анализа TGA предназначен для моделирования процесса анализа, но только с одним видом антигена.
2. Производят серийное разведение биотинилированного tTG и Ru Sulfo-NHS-меченого tTG. Рекомендуемые рабочие концентрации первого раствора смеси начинаются от 240 нг/мл как для биотинилированных, так и для tTG, меченных Ru Sulfo-NHS. Предположим, что концентрации как оригинального биотинилированного, так и меченого Ru Sulfo-NHS tTG составляют 1,0 мкг/мкл. Сделайте 10-кратное разведение оригинального Ru Sulfo-NHS-меченого tTG и 5-кратное разведение исходного биотинилированного tTG с 5% BSA.
3. Смешайте 4 мкл биотинилированного белка tTG со 156 мкл 5% BSA (антигенный буфер) и 240 мкл стрептавидин-конъюгированного линкера в одной пробирке и инкубируйте раствор на RT в течение 30 мин. Затем добавляют 160 мкл стоп-раствора и инкубируют на RT еще 30 мин. Взять 400 мкл смеси и смешать с 2 мл стоп-раствора. Концентрация биотинилированного тТГ в смеси составляет 240 нг/мл.
4. Чтобы сделать серийное разведение для биотин-меченого антигена ZnT8, подготовьте еще пять новых пробирок, возьмите 1 мл аликвоты из смеси на стадии 3.3. и смешать с 1 мл стоп-раствора в новой пробирке, и получить смесь с концентрацией 120 нг/мл. Повторите этот шаг, сделайте последовательные разведения 1:1 и получите меченый биотином tTG при 60 нг/мл, 30 нг/мл, 15 нг/мл и 7,5 нг/мл.
5. Добавьте 4 мкл меченого Ru Sulfo-NHS tTG с 1,6 мл стоп-раствора и получите смесь Ru Sulfo-NHS-меченого tTG в концентрации 240 нг/мл. С теми же шагами 3,4. сделайте последовательные разведения 1:1 и получите антиген ZnT8 с маркировкой Ru Sulfo-NHS при 60 нг/мл, 30 нг/мл, 15 нг/мл, 7,5 нг/мл и 3,75 нг/мл. Последняя концентрация составляет 0 нг/мл, только стоп-раствор и без антигена, меченного Ru Sulfo-NHS.
6. Подготовьте tTG положительные контрольные и отрицательные контрольные образцы сыворотки (предварительно сертифицированные и стандартизированные одним анализом ECL tTG) и 96-луночную ПЦР-пластину. Аликвот положительных и отрицательных контрольных образцов сыворотки на левую половину и правую половину пластины, соответственно, с 7 мкл в каждой лунке. Добавьте в тарелку 1 pBS с 33 мкл на лунку.
7. На левую половину пластины ПЦР добавляют 24 мкл серийного разбавленного раствора tTG-линкера с меткой биотина в каждую лунку, одну колонку с одной концентрацией в порядке от самой высокой до самой низкой. Таким же образом добавляют 16 мкл серийного разбавленного антигена Ru Sulfo-NHS, меченного tTG, в каждую лунку, один ряд с одной концентрацией, а затем тщательно перемешивают. Повторите шаг на правой половине пластины ПЦР.
8. Продолжите остальные этапы анализа, описанные в шагах 5.3.-9.1. до получения необработанных данных подсчета.
9. Рассчитайте отношение положительных управляющих сигналов к соответствующим отрицательным управляющим сигналам. Определить наилучшую концентрацию для антигена, меченного биотином, и антигена, меченного Ru Sulfo-NHS, с более высокими значениями соотношения и более низким фоном для отрицательного контрольного образца. Оптимальные рабочие концентрации биотина и меченого антигена Ru Sulfo-NHS показаны ниже: 16,0 нг/мл и 8,0 нг/мл для GAD65, 18,8 нг/мл и 9,4 нг/мл для SARS-CoV-2 RBD, 42,0 нг/мл и 42,0 нг/мл для IA-2, 60,0 нг/мл и 60,0 нг/мл для tTG, 4,2 нг/мл и 4,2 нг/мл для ZnT8, и 31,3 нг/мл и 31,3 нг/мл для проинсулина.

4. Создание раствора антигена, связанного с линкером

1. Разбавьте биотин- и Ru-сульфо-NHS-меченые антигены с 5% BSA до оптимальных рабочих концентраций в соответствии с этапом 3.9.
2. Связывают предварительно выбранные линкеры с каждым биотинилированным антигенным белком. Для одного 96-луночного пластинчатого анализа добавьте 4 мкл биотинилированного GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 и белка проинсулинового антигена в отдельную пробирку, содержащую 156 мкл 1% BSA, и смешайте с 240 мкл соответствующих стрептавидин-конъюгированных линкеров 1, 2, 3, 8, 9 и 10 (рисунок 1). Инкубировать смесь в течение 30 мин при РТ.
3. Аликвот 160 мкл стоп-раствора в каждой пробирке и инкубируют смесь на RT в течение 30 мин. Выньте 400 мкл раствора смеси из каждой пробирки и соедините их вместе.
4. Добавьте 4 мкл Ru Sulfo-NHS с маркировкой GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 и проинсулиновый антиген к смеси выше, а затем добавьте 1,6 мл стоп-раствора и 3,2 мл 1x PBS и перемешайте. Теперь раствор антигена готов к использованию в анализе.

5. Инкубация образцов сыворотки с меченым антигеном

1. Аликвота 7 мкл сыворотки на лунку для 96-луночной ПЦР-пластины и покрытия герметизирующей пленкой. Разогрейте сыворотки при 56 °C в течение 30 мин на аппарате ПЦР. Кратковременно центрифугируют пластину при 100 х г в течение 1 мин.
2. Добавьте 63 мкл раствора антигена (приготовленного на стадии 4,4) на лунку и смешайте с сыворотками. Накройте пластину ПЦР уплотнительной фольгой, чтобы избежать света.
3. Встряхните пластину на шейкере при 450 об/мин при RT в течение 2 ч, а затем инкубируйте пластину при 4 °C в течение 18-24 ч.

6. Подготовьте плиту 6-Plex

1. Возьмите плиту 6-Plex из холодильника с температурой 4 °C, чтобы пластина попала в RT. Добавьте 150 мкл 3% Blocker A к каждой лунке пластины 6-Plex.
2. Поместите тарелку обратно в холодильник при температуре 4 °C, накройте тарелку фольгой, избегая света, и высиживайте в течение ночи.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы анализа в День 1 включают разделы 4.-6.

7. Перенос инкубации сыворотки/антигена в пластину 6-Plex

1. На следующий день возьмите инкубационную 6-plex плиту из холодильника и выбросьте весь буфер из тарелки. Похлопайте тарелку по бумажным полотенцам, чтобы высохнуть.
2. Мойте 6-Plex пластину 3x с 150 мкл промывочного буфера на лунку каждый раз. Высушите пластину на бумажных полотенцах, и аликвотная сыворотка/антиген инкубируется из каждой лунки ночной инкубирующей ПЦР-пластины в две лунки 6-plex пластины (30 мкл на лунку для дубликатов).
3. Накройте пластину фольгой, затем положите пластину на шейкер и встряхните со скоростью 450 об/мин при RT в течение 1 ч.

8. Вымойте пластину 6-Plex и добавьте буфер считывания

1. Высыпьте раствор в пластину 6-Plex и промойте пластину 3x с 150 мкл 0,4 M NaCl промывочного буфера на каждую лунку каждый раз.
2. После завершения третьей стирки высушите пластину на бумажном полотенце и добавьте 150 мкл буфера для считывания в каждую лунку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пузырьки воздуха в скважине влияют на точность пластинчатого считывателя, и их следует избегать любой ценой.

9. Прочитайте пластину и проанализируйте данные

1. Подсчитайте пластину на электрохемилюминесцентном анализаторе. Результаты чтения будут представлены со значениями в счетчиках в секунду (CPS). Рассчитать относительный индекс антител каждого образца с помощью сырого CPS, полученного из считывающей машины, против CPS внутреннего стандарта положительного и отрицательного контроля каждого специфического антитела (Значение индекса = [CPS (образец) - CPS (отрицательный стандарт)] / [CPS (положительный стандарт) - CPS (отрицательный стандарт)]).
2. Определить отрицательные или положительные результаты антител, используя пороговые значения, которые были установлены на^99,5-99,8-м процентилях 555 отрицательных контрольных образцов из исследования ASK (все отрицательные образцы антител без истории или семейной истории диабета или любого другого типа аутоиммунного заболевания).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы анализа в День 2 включают разделы 7-9.

Результаты

Таблица 1, Таблица 2 и Таблица 3 иллюстрируют репрезентативные результаты. Необработанные CPS, полученные из считывающей машины, проиллюстрированы в таблице 1. В таблице 2 необработанные CPS были организованы и отсортированы по шести линкерам и соответствующим антителам. В таблице 3 показаны рассчитанные значения индекса с помощью CPS, как описано в протоколе анализа. Все необработанные значения подсчета должны быть проверены, чтобы избежать неправильных конечных результатов индекса, вызванных плохими дубликатами. В таблице 1 приведены примеры плохих дубликатов, которые привели к ошибке при окончательном расчете индекса в таблице 3.

Этот анализ был проверен слепым способом с использованием 880 отобранных образцов из исследования ASK с 325 положительными образцами IAbs и 555 всеми abs-отрицательными образцами. Уровни аутоантител из анализа 6-Plex ECL для 880 образцов сравнивали точечно с уровнями соответствующих одиночных анализов ECL (рисунок 2) и с соответствующим единым стандартом RBA (рисунок 3). Отсечение, чувствительность и специфичность для каждого антитела перечислены в таблице 4. Чувствительность и специфичность этого анализа ECL-COVID-19A были идентифицированы как 100% и 99,9% соответственно¹⁰.

Рисунок 1: Иллюстрация анализа ECL 6-Plex. Сывороточные аутоантитела образуют соединение меченого Ru Sulfo-NHS антигена с биотинилированным антигеном, который соединен со специфическим линкером и образует комплекс антиген-антитело-антиген-линкер. Комплексы захватываются через каждый конкретный линкер на определенные точки в пластине 6-Plex. Для каждого антигена были присвоены специфические номера линкера: GAD-linker-1, Covid-19-linker-2, IA-2-linker-3, tTG-linker-8, ZnT8-linker-9 и Proinslulin-linker-10. Эта цифра была изменена с разрешения He et ^al.11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Сравнение шести уровней антител в 880 образцах из исследования ASK между одним анализом ECL и анализом 6-Plex ECL. Панели отображают сравнение уровней антител для GADA, IAA, IA-2A, ZnT8A, TGA и COVID-19A соответственно (индекс COVID-19A был представлен как (100-кратное расчетное значение индекса)). Пунктирные линии представляют собой отсечки анализа для каждого анализа антител. Эта цифра была изменена с разрешения He et ^al.11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Сравнение пяти уровней антител в 880 образцах из исследования ASK между RBA и 6-Plex ECL анализом. Панели отображают сравнение уровней антител для GADA, IAA, IA-2A, ZnT8A и TGA соответственно. Пунктирные линии представляют собой отсечки анализа для каждого анализа антител. Эта цифра была изменена с разрешения He et ^al.11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Необработанные подсчеты CPS (левая половина пластины). Необработанные подсчеты CPS получены из левой половины пробирной пластины. Каждый образец выполняется в двух экземплярах. Каждый счетчик CPS в одном столбце (A1, A2, A3 и т. Д.) Представляет данные чтения из 10 точек в одной и той же скважине (отмечены соответствующие номера компоновщика). Примеры плохих дубликатов выделены серым цветом, как показано в строке D-linker 3, столбце 5 и столбце 6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 2: Расположение данных таблицы 1, отсортированных с помощью шести компоновщиков. Значения CPS из таблицы 1 были перегруппированы, вычисляя средние значения для повторяющихся показаний CPS и удаляя неиспользуемые значения для компоновщиков 4-7. Значения внутреннего стандарта высоких положительных, низких положительных и отрицательных контрольных значений каждого анализа аутоантител выделены темным жирным шрифтом. ПК, положительный контроль. NC, отрицательный контроль. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 3: Результаты значений индексов. Значения индекса для каждой выборки для всех шести антител были рассчитаны по соответствующим положительным и отрицательным контрольным показателям. Значение индекса, превышающее значение отсечения, было определено как положительное, выделенное жирным шрифтом. Плохое дублирование значений CPS в таблице 1, строка D-linker 3-столбцы 5 и 6, привело к положительному значению индекса IA-2A выборки 11 (выделено серым цветом), что, вероятно, было ложноположительным результатом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 4: Отсечение анализа, чувствительность и специфичность для GADA, IA-2A, ZnT8A, IAA и TGA среди 880 образцов ASK, включая 325 положительных образцов IAbs и 555 всех отрицательных образцов антител. Оптимальное значение индекса отсечения GADA, IA-2A, ZnT8A, IAA и TGA было установлено по крайней мере на 99-й процентиль из 555 нормальных контрольных образцов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Обсуждение

Вмешательство для T1D вступило в эру до T1D, с продолжающимися национальными и международными крупномасштабными программами скрининга для T1D и быстро развивающимися клиническими испытаниями, применяемыми на стадии 1 T1D, чтобы отменить или замедлить прогрессирование до клинического T1D^12,13. Измерения четырех IAb с использованием текущего стандарта RBA с одним форматом анализа IAb являются трудоемкими и неэффективными для программы массового скрининга. С острым спросом на высокопроизводительный мультиплексированный анализ IAbs, мультиплексированный анализ ECL, 3-Screen ICA ELISA и обнаружение антител с помощью агглютинации-ПЦР (ADAP) стали в настоящее время конкурентоспособными технологиями. В исследовании Fr1da скрининга на СД1 в популяции маленьких детей в Германии в качестве основного теста¹⁴ использовался 3-Screen ICA ELISA, объединяющий 3 IAbs (GADA, IA-2A и ZnT8A). Основным ограничением 3-Screen ICA ELISA является отсутствие IAA, который в основном является первым IAb, который появляется с высокой распространенностью у маленьких детей с СД1. Кроме того, анализ не в состоянии отличить, какой из трех IAb является положительным от положительного сигнала, и каждый положительный образец должен быть повторен с тремя одиночными анализами для подтверждения. ADAP¹⁵ сочетает в себе GADA, IA-2A и IAA и иллюстрирует высокую чувствительность и специфичность анализа на семинаре IASP, но не имеет данных о том, насколько он прогностичен в популяционном скрининге для исследований T1D, которые семинар IASP не в состоянии определить. Мультиплексный анализ ECL в настоящем исследовании построен на платформе одного анализа ECL, который был проверен на соответствие текущему стандарту RBA в нескольких клинических испытаниях, таких как TrailNet ^9,16, DAISY 17,18,19 и ASK ^4,20,21 изучать. Настоящий анализ был проверен как по RBA, так и по одному анализу ECL с использованием 880 образцов сыворотки от участников исследования ASK. Как показано на рисунках 2 и 3, уровни антител между 6-Plex и одним ECL или между 6-Plex и RBA были в основном конгруэнтны друг другу для положительности антител. Частота совпадений IAbs, протестированных RBA и 6-Plex, составила 91,7%-97,8%, а частота совпадений IAbs, протестированных одним ECL и 6-Plex, составила 95,3%-99,2%. Несоответствие между анализом ECL и RBA было в основном от тех, у кого был единственный IAb. Уровни IAbs, протестированные 6-Plex и одним ECL (r = 0,6431-0,9434, все p < 0,0001) и 6-Plex и RBA (r = 0,5775-0,8576, все p < 0,0001), также были хорошо коррелированы. TGA, протестированные с помощью анализа 6-Plex, были сильно коррелированы с результатами как RBA (99,4%), так и одного анализа ECL (99,4%). Кроме того, covid-19A, протестированный 6-Plex, достиг 99,8% соответствия результатам единого анализа ECL.

В результате анализ 6-Plex ECL был официально принят в качестве основного метода скрининга для текущего исследования ASK и заменил стандартный RBA²². Этот анализ продемонстрировал его отличную чувствительность и специфичность с более высокой пропускной способностью, более низкой стоимостью и меньшим объемом сыворотки по сравнению со стандартным RBA.

Было задокументировано, что в скрининговом исследовании T1D один IAb, обнаруженный RBA, который занимал большую долю позитивов IAb, имел низкое сродство с низким риском заболевания и приводил к общей низкой прогностической ценности 19,21,23,24,25,26. Такое прогнозирование низкого риска вызвало огромные дополнительные расходы на последующие посещения и привело к трудностям для профилактических исследований СД1. Установленная платформа анализа ECL была продемонстрирована в нескольких клинических испытаниях, чтобы отличить высокоаффинные IAbs от низкородных IAbs, генерируемых RBA, и значительно повысить прогностические значения для всех четырех IAb, особенно с одной положительностью IAb 16,17,18,21 . Мультиплексная технология анализа ECL была построена на платформе одного анализа ECL, с этим явным преимуществом обнаружения высокоаффинного Abs. В настоящем исследовании анализ 6-Plex ECL проиллюстрировал его сходство с соответствующими одиночными анализами ECL по чувствительности и специфичности.

Некоторые ограничения и технические проблемы мультиплексного анализа ECL с использованием нескольких пластин Plex уже были освещены в предыдущих публикациях^27,28. С шестью мечеными антигенами в одной лунке могут быть некоторые влияния между различными антигенами, и фон анализа может увеличиваться при добавлении каждого анализа антител для мультиплексирования в одной и той же лунке. Большой объем работы по оптимизации анализа необходим для корректировки условий анализа, особенно для корректировки конечных концентраций каждого меченого белка антигена на основе шахматного анализа для каждого антигена, для поддержания чувствительности и специфичности для каждого анализа антител. Как упоминалось в предыдущих исследованиях^27,28, небольшое количество образцов (<1%) приводит к ложной позитивности на множественной пластине Plex без четкой основной причины. Все положительные результаты должны быть повторены и подтверждены одним ECL-анализом в качестве обычного лабораторного обеспечения качества; как правило, ложные срабатывания удаляются. Ложноотрицательные результаты, вызванные «прозональным эффектом», наблюдаемым в предыдущем анализе 7-Plex ECL ^27,28, не наблюдались в настоящем исследовании. В анализе, описанном здесь, мы удалили этап кислотной обработки образцов сыворотки из предыдущего протокола; вместо этого мы предварительно нагревали образцы сыворотки при 56 °C в течение 30 мин (шаг 5.1.). На второй день мытья пластин мы использовали буфер для мытья, содержащий 0,4 M NaCl (шаг 8.1.) вместо обычного буфера для мытья, чтобы мыть пластину более строго. Эти модификации упростили мультиплексный анализ ECL и снизили фон без потери чувствительности анализа.

В заключение, этот анализ имеет выдающуюся производительность для обнаружения четырех IAbs, TGA и COVID-19A одновременно. Функция мультиплексирования, а также высокая пропускная способность, низкая стоимость и малый объем сыворотки делают крупномасштабный скрининг на СД1 и сопутствующие заболевания гораздо более осуществимым среди населения в целом. Пациенты с СД1 или любыми аутоиммунными заболеваниями имеют гораздо более высокий риск других аутоиммунных заболеваний. Мультиплексный анализ ECL обеспечивает отличную платформу для скрининга СД1 и нескольких аутоиммунных заболеваний одновременно.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mM NaCl	ThermoFisher	1070832
96-well Plate Shaker	VWR	12620-926
96-well round bottom plate	Fisher	8408220
Biotin	ThermoFisher	PI21329
Blocker A	MSD	R93AA
Bottle-Top 500 ml-Filter Units	Fisher	0974064A
Bovine Serum Albumin	Sigma	A-7906
GAD65 protein	Diamyd Medical	10-65702-01
IA-2 protein (aa 605-979)	Creative BioMart	283309
MESO QuickPlex SQ120	MSD	R31QQ-3	Electrochemiluminescence analyzer
PBS 10x	ThermoFisher	70011044
PBS 1x	ThermoFisher	10010023
Proinsulin protein	AmideBio	20160118B3
Read buffer B	MSD	Y0800019
SARS-CoV-2 RBD protein	Creative Biomart	Spike-190V
Stop Solution	MSD	Y0090019
Sulfo-TAG	MSD	R91AO-1
tTG protein	Diarect AG	15201
Tween 20	Sigma	P-1379
U-Plex 6-Assay SECTOR plate	MSD	Z00U0142E	6-plex plate
U-PLEX Linker 1	MSD	L0010022
U-PLEX Linker 10	MSD	L0100020
U-PLEX Linker 2	MSD	L0020015
U-PLEX Linker 3	MSD	L0030018
U-PLEX Linker 8	MSD	L0080018
U-PLEX Linker 9	MSD	L0090014
ZeBa Column	ThermoFisher	89892	Spin columns
ZnT8 protein	Research Laboratory	n/a