Uno screening multiplexed ad alto rendimento per diabete di tipo 1, celiachia e COVID-19

Riepilogo

In linea con l'urgente necessità di screening per il diabete di tipo 1, la celiachia e la malattia da coronavirus 2019, abbiamo sviluppato un test di elettrochemiluminescenza 6-Plex ad alta produttività per rilevare simultaneamente tutti e quattro gli autoanticorpi delle isole, gli autoanticorpi della transglutaminasi tissutale e gli anticorpi contro il dominio di legame del recettore della sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2.

Abstract

Uno studio clinico in corso, Autoimmunity Screening for Kids (ASK), è il primo studio di screening nella popolazione generale per il diabete di tipo 1 (T1D) e la celiachia negli Stati Uniti. Con la pandemia di coronavirus 2019 (COVID-19), l'epidemiologia di COVID-19 nella popolazione generale e le conoscenze sull'associazione tra infezione da COVID-19 e sviluppo di T1D sono urgentemente necessarie. Il metodo di screening attualmente standard del radio-binding assay (RBA) ha affrontato due grandi sfide: bassa efficienza con un singolo formato di test e bassa specificità della malattia con una grande percentuale di anticorpi a bassa affinità generati nello screening. Con la piattaforma del test multiplex electrochemiluminescence (ECL) che abbiamo stabilito in precedenza, è stato sviluppato un nuovo test ECL 6-Plex che combina, in un unico pozzetto, tutti e quattro gli autoanticorpi delle isole (IAbs) all'insulina, alla decarbossilasi dell'acido glutammico (GAD65), all'antigene dell'insulinoma 2 (IA-2) e al trasportatore di zinco 8 (ZnT8) per T1D, agli autoanticorpi della transglutaminasi (TGA) per la celiachia e agli anticorpi del dominio legante il recettore (RBD) della sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2) per COVID-19. Il test è stato convalidato in cieco utilizzando 880 campioni dello studio ASK, inclusi 325 campioni positivi e 555 tutti i campioni negativi agli anticorpi, e confrontato con gli RBA standard e un singolo test ECL. Con i vantaggi di alta efficienza, basso costo e basso volume di siero, questo test è stato accettato come strumento di screening primario per lo studio ASK.

Introduzione

Grandi studi epidemiologici in tutto il mondo dimostrano che l'incidenza del diabete di tipo 1 (T1D) è aumentata rapidamente del 3% -5% all'anno e la prevalenza di T1D è raddoppiata negli ultimi 20 anni, specialmente nei bambini piccoli ^1,2. Gli autoanticorpi delle isole (IAbs) di solito compaiono anni prima dei sintomi clinici e sono attualmente i biomarcatori predittivi e diagnostici più affidabili per T1D³. Lo screening per gli autoanticorpi T1D può identificare le persone a rischio di progredire verso il T1D clinico, educare il pubblico, ridurre in gran parte la complicanza pericolosa per la vita della chetoacidosi e beneficiare degli studi clinici per le terapie di prevenzione. Sono in corso sforzi di prevenzione a livello mondiale per il T1D e sono in corso molteplici studi interventistici tra soggetti con IAbs positivi per ritardare la progressione verso il T1D clinico e il Barbara Davis Center for Diabetes ha lanciato il primo studio clinico statunitense di screening nella popolazione generale nel 2016 per T1D e celiachia, Autoimmunity Screening for the Kids (ASK)⁴ . La celiachia (CD) è una malattia infiammatoria intestinale cronica correlata a fattori immunitari e genetici. La prevalenza di CD nei bambini con T1D può raggiungere fino al 24,5%⁵. Più della metà degli individui con CD potrebbe non avere sintomi tipici alla presentazione⁶, quindi lo screening sierologico per la celiachia è abbastanza necessario.

Dall'inizio della pandemia di coronavirus 2019 (COVID-19), sono stati segnalati oltre 200 milioni di casi a livello globale e i bambini rappresentano fino al 16% dei casi confermati in laboratorio⁷. Molti studi hanno dimostrato l'impatto del T1D esistente sulla gravità e la fatalità dell'infezione da COVID-19⁸, mentre l'impatto dell'infezione da COVID-19 sullo sviluppo del T1D non è chiaro. L'indagine del tasso totale di infezione da COVID-19 nella popolazione generale mediante la determinazione degli anticorpi della sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-COV-2) e lo studio dell'associazione tra infezione da COVID-19 e attivazione dell'autoimmunità T1D o accelerazione della progressione del T1D sono urgentemente necessari e molto importanti, mentre lo studio ASK in corso è una piattaforma eccellente per questo. A causa del formato del singolo test e della generazione di un'ampia percentuale di positività agli anticorpi a bassa affinità, il test standard di radio-legame (RBA) ha incontrato un collo di bottiglia di bassa efficienza e bassa specificità della malattia⁹. Nel presente articolo, presentiamo un nuovo test di elettrochemiluminescenza 6-Plexed (ECL) costruito sulla nostra precedente piattaforma di test ECL multiplex utilizzando una piastra multiple-Plex, combinando sei saggi di autoanticorpi in un unico pozzetto, inclusi tutti e quattro i principali IAb all'insulina (IAA), decarbossilasi-65 dell'acido glutammico (GADA), antigene dell'insulinoma-2 (IA-2A) e trasporto di zinco-8 (ZnT8A), autoanticorpi contro la transglutaminasi (TGA) per la celiachia, e anticorpi del dominio legante il recettore (RBD) SARS-CoV-2 (COVID-19A). Questo è il primo test multiplex che ha reclutato un panel completo di quattro IAb principali e lo ha ulteriormente combinato con TGA e COVID-19A. È stato convalidato e formalmente accettato come strumento di screening primario che sostituisce l'RBA standard nello studio ASK.

Protocollo

Il protocollo di ricerca è stato approvato dal Colorado Multiple Institutional Review Board.

1. Preparazione del buffer

1. Preparare il tampone di etichettatura (2x PBS, pH 7,9): aggiungere 100 ml di 10x PBS a 400 ml di acqua distillata e regolare il pH utilizzando NaOH a 7,9.
2. Produrre 3 mM di biotina e Ru Sulfo-NHS: sciogliere 1 mg di biotina in 588 μL di tampone di etichettatura e sciogliere 150 nmol di Ru Sulfo-NHS in 50 μL di tampone di etichettatura.
3. Preparare il tampone antigene (1% BSA): sciogliere 5 g di albumina sierica bovina (BSA) in 500 ml di 1x PBS.
4. Preparare il tampone di rivestimento (3% Blocker A): sciogliere 15 g di Blocker A in 500 mL di 1x PBS.
5. Preparare il primo tampone di lavaggio (0,05 % Tween 20, PBST): mescolare 2,5 mL di Tween 20 in 5.000 mL di 1x PBS.
6. Preparare il secondo tampone di lavaggio (0,4 M NaCl): mescolare 50 mL di 5 M NaCl in 575 mL di acqua distillata per ottenere la soluzione 0,4 M NaCl.
   NOTA: Per un'etichettatura efficiente, utilizzare sempre soluzioni di biotina e Ru Sulfo-NHS appena preparate e non quelle conservate realizzate in precedenza.

2. Etichettatura delle proteine dell'antigene con biotina e Ru Sulfo-NHS separatamente

NOTA: Si raccomanda una maggiore concentrazione di proteina dell'antigene ≥0,5 mg/ml per una maggiore efficienza di etichettatura.

1. Preparare sei soluzioni mirate di proteine antigenetiche, tra cui proinsulina, GAD-65, IA-2, ZnT8, TG e dominio legante il recettore (RBD) della proteina spike di SARS-CoV-2. Calcolare le moli di ciascuna proteina dell'antigene in base al suo peso molecolare e fare rapporti molari appropriati di biotina o Ru Sulfo-NHS. Il rapporto tra antigene e somma di biotina o Ru Sulfo-NHS sarà 1:5 per piccoli antigeni molecolari (peso molecolare ≤10 kd), come la proteina proinsulina. Per gli antigeni molecolari medi (peso molecolare 10-50 kd), come ZnT8, il rapporto si adatterà a 1:10. Per antigeni di peso molecolare di grandi dimensioni (peso molecolare >50 kd), come il GAD, il rapporto molare sarà 1:20.
2. Dividere la proteina dell'antigene in due parti uguali e mescolarla separatamente con biotina e Ru Sulfo-NHS utilizzando il rapporto molare calcolato nel passaggio 2.1. Incubare la miscela a temperatura ambiente (RT) per 1,5 ore, evitando la luce.
   NOTA: Tutte le sostanze chimiche riducenti come il Tris o la glicina nel tampone della proteina dell'antigene devono essere rimosse da una colonna di spin dimensionale innescata con un tampone di 2x PBS (pH 7,9).
3. Innescare le colonne di spin con 2x PBS (la dimensione della colonna di spin, 2 mL o 5 mL, dipende dal volume della proteina dell'antigene di marcatura): aggiungere 1 ml di tampone PBS 2x alla colonna di spin, centrifugare a 1.000 x g per 2 minuti e ripetere il passaggio 2 volte di più.
4. Lasciare che la miscela proteina-biotina dell'antigene o -Ru Sulfo-NHS passi attraverso la colonna di spin innescata 1x (centrifugare la colonna a 1.000 x g per 2 minuti) fino alla purificazione e interrompere la reazione di etichettatura.
5. Misurare il volume finale della proteina dell'antigene marcata eluita dalle colonne di spin, calcolando le concentrazioni di proteina antigene marcata con biotina o Ru Sulfo-NHS. Fare aliquote più piccole di proteina antigene marcata (50 μL/tubo) e conservarle a -80 °C per un uso a lungo termine.
   NOTA: La copertura delle proteine dopo ogni colonna di spin sarà approssimativamente del 90%-95% di ritenzione.

3. Definire la migliore concentrazione e i migliori rapporti per gli antigeni marcati con biotina e Ru Sulfo-NHS per il test ECL 6-Plex (test a scacchiera)

NOTA: Il test a scacchiera per ciascun antigene è necessario prima dell'integrazione nel test multiplexato.

1. Applicare separatamente il test a scacchiera per ciascun antigene.
   NOTA: passaggi 3.2.-3.7. utilizzerà TGA come breve esempio. Il processo di analisi a scacchiera TGA consiste nel simulare il processo di analisi, ma con un solo tipo di antigene.
2. Effettuare la diluizione seriale del tTG biotinilato e del tTG marcato con Ru Sulfo-NHS. Le concentrazioni di lavoro raccomandate della prima soluzione di miscela partono da 240 ng/mL sia per il tTG biotinilato che per il tTG marcato con Ru Sulfo-NHS. Supponiamo che le concentrazioni di entrambi i tTG originali biotinilati e marcati con Ru Sulfo-NHS siano 1,0 μg / μL. Effettuare una diluizione 10x del tTG originale marcato con Ru Sulfo-NHS e una diluizione 5x del tTG biotinilato originale con BSA al 5%.
3. Mescolare 4 μL di proteina tTG biotinilata con 156 μL di 5% BSA (tampone antigenetico) e 240 μL del linker coniugato con streptavidina in una provetta e incubare la soluzione a RT per 30 minuti. Quindi, aggiungere 160 μL di soluzione di arresto e incubare a RT per altri 30 minuti. Prelevare 400 μL della miscela e mescolare con 2 mL di soluzione di arresto. La concentrazione del tTG biotinilato nella miscela è di 240 ng/ml.
4. Per effettuare una diluizione seriale per l'antigene ZnT8 marcato con biotina, preparare altre cinque nuove provette, prelevare 1 mL di aliquota dalla miscela al punto 3.3. e mescolare con 1 mL di soluzione di arresto in un nuovo tubo e ottenere la miscela con una concentrazione di 120 ng/mL. Ripetere questo passaggio, effettuare diluizioni seriali 1: 1 e ottenere il tTG marcato con biotina a 60 ng / mL, 30 ng / mL, 15 ng / mL e 7,5 ng / mL.
5. Aggiungere 4 μL di tTG marcato con Ru Sulfo-NHS con 1,6 mL di soluzione di arresto e ottenere una miscela di tTG marcato con Ru Sulfo-NHS ad una concentrazione di 240 ng / mL. Con gli stessi passaggi di 3.4., effettuare diluizioni seriali 1: 1 e ottenere l'antigene ZnT8 marcato con Ru Sulfo-NHS a 60 ng / mL, 30 ng / mL, 15 ng / mL, 7,5 ng / mL e 3,75 ng / mL. L'ultima concentrazione è 0 ng / mL, con solo soluzione di arresto e nessun antigene marcato con Ru Sulfo-NHS.
6. Preparare campioni di siero di controllo positivo e negativo tTG (pre-qualificati e standardizzati da un singolo test ECL tTG) e una piastra PCR a 96 pozzetti. Aliquotare i campioni di siero di controllo positivo e negativo rispettivamente alla metà sinistra e alla metà destra della piastra con 7 μL in ciascun pozzetto. Aggiungere 1x PBS alla piastra, con 33 μL per pozzetto.
7. Sulla metà sinistra della piastra PCR, aggiungere 24 μL della soluzione seriale di tTG-linker marcata con biotina diluita a ciascun pozzetto, una colonna con una concentrazione in ordine dal più alto al più basso. Allo stesso modo, aggiungere 16 μL dell'antigene tTG diluito Ru Sulfo-NHS seriale a ciascun pozzetto, una fila con una concentrazione, e quindi mescolare accuratamente. Ripetere il passaggio sulla metà destra della piastra PCR.
8. Continuare le altre fasi del test descritte nei punti 5.3.-9.1. fino ad ottenere i dati grezzi di conteggio.
9. Calcola i rapporti tra segnali di controllo positivi e corrispondenti segnali di controllo negativi. Determinare la migliore concentrazione per l'antigene marcato con biotina e l'antigene marcato con Ru Sulfo-NHS con valori di rapporto più elevati e sfondo inferiore per il campione di controllo negativo. Le concentrazioni ottimali di lavoro della biotina e della proteina antigenica marcata con Ru Sulfo-NHS sono mostrate di seguito: 16,0 ng / mL e 8,0 ng / mL per GAD65, 18,8 ng / mL e 9,4 ng / mL per SARS-CoV-2 RBD, 42,0 ng / mL e 42,0 ng / mL per IA-2, 60,0 ng / mL e 60,0 ng / mL per tTG, 4,2 ng / mL e 4,2 ng / mL per ZnT8, e 31,3 ng/ml e 31,3 ng/ml per la proinsulina.

4. Creare una soluzione antigene accoppiata a linker

1. Diluire gli antigeni marcati con biotina e Ru Sulfo-NHS con BSA al 5% alle concentrazioni di lavoro ottimali secondo la fase 3.9.
2. Legare i linker preselezionati a ciascuna proteina dell'antigene biotinilato. Per un test su piastra a 96 pozzetti, aggiungere 4 μL di GAD65 biotinilato, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 e proteina dell'antigene proinsulina in una provetta separata contenente 156 μL di BSA all'1% e mescolare con 240 μL dei corrispondenti linker coniugati con streptavidina 1, 2, 3, 8, 9 e 10 (Figura 1). Incubare la miscela per 30 minuti a RT.
3. Aliquot 160 μL di soluzione di arresto in ciascuna provetta e incubare la miscela a RT per 30 minuti. Estrarre 400 μL della soluzione di miscela da ciascun tubo e combinarli insieme.
4. Aggiungere 4 μL di Ru Sulfo-NHS marcato GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 e antigene proinsulina alla miscela sopra, quindi aggiungere 1,6 ml di soluzione di arresto e 3,2 ml di 1x PBS e miscelare. Ora la soluzione dell'antigene è pronta per l'uso nel test.

5. Incubare campioni di siero con l'antigene marcato

1. Aliquot 7 μL di siero per pozzetto per una piastra PCR a 96 pozzetti e coperchio con pellicola sigillante. Preriscaldare i sieri a 56 °C per 30 minuti su una macchina PCR. Centrifugare brevemente la piastra a 100 x g per 1 min.
2. Aggiungere 63 μL di soluzione di antigene (preparata al punto 4.4) per pozzetto e mescolare con i sieri. Coprire la piastra PCR con un foglio sigillante per evitare la luce.
3. Agitare la piastra su uno shaker a 450 rpm a RT per 2 ore e quindi incubare la piastra a 4 °C per 18-24 h.

6. Preparare la piastra 6-Plex

1. Prelevare una piastra 6-Plex dal frigorifero a 4 °C, consentendo alla piastra di arrivare a RT. Aggiungere 150 μL di 3% Blocker A a ciascun pozzetto della piastra 6-Plex.
2. Riporre la piastra in frigorifero a 4 °C, coprire la piastra con un foglio evitando la luce e incubare per una notte.
   NOTA: le fasi di analisi del Giorno 1 includono le sezioni 4.-6.

7. Trasferire siero/antigene incubati nella piastra 6-Plex

1. Il giorno dopo, prendere la piastra 6-Plex di incubazione dal frigorifero e scaricare tutto il buffer fuori dalla piastra. Picchiettare il piatto su carta assorbente per asciugare.
2. Lavare la piastra 6-Plex 3x con 150 μL di tampone di lavaggio per pozzetto ogni volta. Asciugare la piastra su tovaglioli di carta e incubare siero/antigene aliquote da ciascun pozzetto della piastra PCR di incubazione notturna in due pozzetti della piastra 6-Plex (30 μL per pozzetto per duplicati).
3. Coprire la piastra con un foglio, quindi mettere la piastra su uno scuotitore e agitare con una velocità di 450 giri / min a RT per 1 ora.

8. Lavare la piastra 6-Plex e aggiungere il buffer di lettura

1. Scaricare la soluzione nella piastra 6-Plex e lavare la piastra 3 volte con 150 μL di tampone di lavaggio NaCl da 0,4 M per pozzetto.
2. Al termine del terzo lavaggio, asciugare la piastra contro il tovagliolo di carta e aggiungere 150 μL di tampone di lettura in ciascun pozzetto.
   NOTA: le bolle d'aria nel pozzo influiscono sulla precisione della macchina del lettore di piastre e dovrebbero essere evitate a tutti i costi.

9. Leggi la targa e analizza i dati

1. Contare la piastra su un analizzatore di elettrochemiluminescenza. I risultati della lettura verranno presentati con i valori in conteggi al secondo (CPS). Calcolare l'indice anticorpale relativo di ciascun campione utilizzando il CPS grezzo ottenuto dalla macchina di lettura rispetto al CPS dei controlli standard interni positivi e negativi di ciascun anticorpo specifico (valore indice = [CPS (campione) - CPS (standard negativo)] / [CPS (standard positivo) - CPS (standard negativo)]).
2. Determinare i risultati negativi o positivi degli anticorpi utilizzando i valori di cutoff che sono stati stabiliti al 99,5 ° al 99,8^° percentile di 555 campioni di controllo negativi dallo studio ASK (tutti i campioni negativi agli anticorpi senza una storia o storia familiare di diabete o qualsiasi altro tipo di malattia autoimmune).
   NOTA: le fasi di analisi del Giorno 2 includono le sezioni 7-9.

Risultati

Le tabelle 1, 2 e 3 illustrano i risultati rappresentativi. I CPS grezzi ottenuti dalla macchina di lettura sono illustrati nella tabella 1. Nella Tabella 2, i CPS grezzi sono stati disposti e ordinati dai sei linker e dagli anticorpi corrispondenti. La tabella 3 mostra i valori dell'indice calcolati con CPS come descritto nel protocollo di analisi. Tutti i valori di conteggio grezzi devono essere controllati per evitare risultati errati dell'indice finale causati da duplicati errati. Nella tabella 1 sono riportati esempi di duplicati danneggiati, che hanno comportato un errore per il calcolo dell'indice finale nella tabella 3.

Questo test è stato convalidato in cieco utilizzando 880 campioni selezionati dallo studio ASK con 325 campioni positivi IAbs e 555 tutti campioni negativi Abs. I livelli di autoanticorpi del test 6-Plex ECL per gli 880 campioni sono stati confrontati punto per punto con i livelli dei corrispondenti singoli saggi ECL (Figura 2) e con il corrispondente RBA singolo standard (Figura 3). Il cutoff, la sensibilità e la specificità per ciascun anticorpo sono elencati nella Tabella 4. La sensibilità e la specificità di questo test ECL-COVID-19A sono state identificate rispettivamente al 100% e al 99,9%¹⁰.

Figura 1: Illustrazione del test ECL 6-Plex. Gli autoanticorpi sierici collegano l'antigene marcato con Ru Sulfo-NHS all'antigene biotinilato, che è accoppiato con un linker specifico e forma un complesso di antigene-anticorpo-antigene-linker. I complessi vengono catturati attraverso ogni linker specifico sui punti specifici nella piastra 6-Plex. Per ogni antigene, sono stati assegnati i numeri specifici del linker: GAD-linker-1, Covid-19-linker-2, IA-2-linker-3, tTG-linker-8, ZnT8-linker-9 e Proinslulin-linker-10. Questa cifra è stata modificata con il permesso di He et ^al.11. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Confronto di sei livelli di anticorpi in 880 campioni dello studio ASK tra il singolo test ECL e il test ECL 6-Plex. I pannelli mostrano confronti dei livelli di anticorpi per GADA, IAA, IA-2A, ZnT8A, TGA e COVID-19A, rispettivamente (l'indice di COVID-19A è stato presentato come (100 x valore dell'indice calcolato)). Le linee tratteggiate rappresentano i cutoff del test per ciascun test anticorpale. Questa cifra è stata modificata con il permesso di He et ^al.11. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Confronto di cinque livelli di anticorpi in 880 campioni dello studio ASK tra il test RBA e il test ECL 6-Plex. I pannelli mostrano confronti dei livelli di anticorpi per GADA, IAA, IA-2A, ZnT8A e TGA, rispettivamente. Le linee tratteggiate rappresentano i cutoff del test per ciascun test anticorpale. Questa cifra è stata modificata con il permesso di He et ^al.11. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Tabella 1: Conteggi CPS grezzi (metà sinistra della piastra). Conteggi CPS grezzi acquisiti dalla metà sinistra di una piastra di analisi. Ogni campione viene eseguito in duplice copia. Ogni conteggio CPS all'interno della stessa colonna (A1, A2, A3, ecc.) rappresenta i dati di lettura dai 10 punti nello stesso pozzetto (i numeri di linker corrispondenti sono contrassegnati). Gli esempi di duplicati errati sono evidenziati in grigio, come si vede nella riga D-linker 3 colonna 5 e colonna 6. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Disposizione dei dati della Tabella 1, ordinati con sei linker. I valori CPS della tabella 1 sono stati riorganizzati, calcolando i valori medi per le letture duplicate di CPS ed eliminando i valori inutilizzati per i linker 4-7. I valori dei controlli standard interni high positive, low positive e negative di ciascun test di autoanticorpi sono contrassegnati in grassetto scuro. PC, controllo positivo. NC, controllo negativo. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 3: Risultati dei valori dell'indice. I valori dell'indice per ciascun campione per tutti e sei gli anticorpi sono stati calcolati rispetto ai corrispondenti controlli positivi e negativi. Un valore di indice maggiore del valore limite è stato definito come positivo, contrassegnato in grassetto scuro. I valori CPS duplicati errati nella Tabella 1, riga D-linker 3-colonne 5 e 6, hanno portato a un valore positivo dell'indice IA-2A del campione 11 (evidenziato in grigio), che era probabilmente un risultato falso positivo. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 4: Cutoff, sensibilità e specificità del saggio per GADA, IA-2A, ZnT8A, IAA e TGA tra 880 campioni ASK, inclusi 325 campioni positivi IAbs e 555 campioni negativi a tutti gli anticorpi. Il valore ottimale dell'indice di cutoff del test GADA, IA-2A, ZnT8A, IAA e TGA è stato impostato almeno al 99° percentile dei 555 campioni di controllo normali. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Discussione

L'intervento per il T1D è entrato nell'era pre-T1D, con programmi di screening su larga scala nazionali e internazionali in corso per il T1D e studi clinici in forte espansione applicati nella fase 1 T1D per abrogare o rallentare la progressione verso il T1D clinico^12,13. Le misurazioni di quattro IAb utilizzando l'attuale RBA standard con un singolo formato di test IAb sono laboriose e inefficienti per un programma di screening di massa. Con l'urgente richiesta di un test IAbs multiplexed ad alta produttività, il test ECL multiplexato, ICA ELISA a 3 schermi e il rilevamento degli anticorpi mediante agglutinazione-PCR (ADAP) sono emerse come tecnologie attualmente competitive. Nello studio Fr1da sullo screening per T1D in una popolazione di bambini piccoli in Germania, ICA ELISA a 3 schermi che combina 3 IAb (GADA, IA-2A e ZnT8A) è stato utilizzato come test principale¹⁴. Una delle principali limitazioni di ICA ELISA a 3 schermi è la mancanza di IAA, che è principalmente il primo IAb ad apparire con un'alta prevalenza nei bambini piccoli con T1D. Inoltre, il test non è in grado di distinguere quale dei tre IAb è positivo da un segnale positivo e ogni campione positivo deve essere ripetuto con tre singoli saggi per la conferma. ADAP¹⁵ combina GADA, IA-2A e IAA e ha illustrato un'elevata sensibilità e specificità del saggio nel workshop IASP, ma manca di dati su quanto sia predittivo nello screening basato sulla popolazione per gli studi T1D, che il workshop IASP non è in grado di determinare. Il test ECL multiplex nel presente studio è costruito sulla piattaforma di un singolo test ECL che è stato convalidato rispetto all'attuale RBA standard in più studi clinici come TrailNet 9,16, DAISY^17,18,19 e ASK 4,20,21 Studiare. Il presente test è stato convalidato sia rispetto all'RBA che al singolo test ECL utilizzando 880 campioni di siero dai partecipanti allo studio ASK. Come mostrato in Figura 2 e Figura 3, i livelli di anticorpi tra 6-Plex e singolo ECL o tra 6-Plex e RBA erano per lo più congruenti tra loro per la positività degli anticorpi. I tassi di coincidenza di IAbs testati da RBA e 6-Plex erano 91,7% -97,8% e i tassi di coincidenza di IAbs testati da singoli ECL e 6-Plex erano 95,3% -99,2%. La discordanza tra il test ECL e RBA era principalmente da quelli con IAb singolo. Anche i livelli di IAbs testati da 6-Plex e singolo ECL (r = 0,6431-0,9434, tutti p < 0,0001) e 6-Plex e RBA (r = 0,5775-0,8576, tutti p < 0,0001) erano ben correlati. Il TGA testato con il test 6-Plex era altamente correlato con i risultati sia del test RBA (99,4%) che del singolo test ECL (99,4%). Inoltre, COVID-19A testato da 6-Plex ha raggiunto il 99,8% di conformità con i risultati del singolo test ECL.

Di conseguenza, il test ECL 6-Plex è stato formalmente accettato come metodo di screening primario per lo studio ASK in corso e ha sostituito lo standard RBA²². Questo test ha dimostrato la sua eccellente sensibilità e specificità con una maggiore produttività, un costo inferiore e un volume inferiore di siero rispetto alla RBA standard.

È stato documentato che, nello studio di screening T1D, il singolo IAb rilevato dalla RBA, che ha assorbito una grande percentuale di positività IAb, era di bassa affinità, con basso rischio di malattia e ha portato a un basso valore predittivo complessivo 19,21,23,24,25,26. Tale previsione a basso rischio ha causato enormi costi aggiuntivi per le visite di follow-up e ha comportato difficoltà per gli studi preventivi sul T1D. La consolidata piattaforma di analisi ECL è stata dimostrata in più studi clinici per discriminare IAb ad alta affinità da IAb a bassa affinità generati da RBA e migliorare significativamente i valori predittivi per tutti e quattro gli IAb, in particolare con positività IAb singola^16,17,18,21 . La tecnologia di analisi ECL multiplex è stata costruita sulla piattaforma del singolo test ECL, con questo netto vantaggio del rilevamento di Abs ad alta affinità. Nel presente studio, il test 6-Plex ECL ha illustrato la sua somiglianza con i corrispondenti saggi ECL singoli in termini di sensibilità e specificità.

Alcune limitazioni e le preoccupazioni tecniche del test ECL multiplex che utilizza più piastre Plex sono già state trattate nelle pubblicazioni precedenti^27,28. Con sei antigeni marcati in un pozzetto, ci possono essere alcune influenze tra diversi antigeni e lo sfondo del test potrebbe aumentare quando si aggiunge ogni test anticorpale per il multiplexing nello stesso pozzetto. È necessaria una grande quantità di lavoro di ottimizzazione del test per regolare le condizioni del test, in particolare per regolare le concentrazioni finali di ciascuna proteina dell'antigene marcata in base al test a scacchiera per ciascun antigene, per mantenere la sensibilità e la specificità per ciascun test anticorpale. Come accennato in studi precedenti^27,28, un piccolo numero di campioni (<1%) provoca una falsa positività sulla piastra multipla di Plex senza una chiara ragione sottostante. Tutti i risultati positivi devono essere ripetuti e confermati da un singolo test ECL come garanzia di qualità di laboratorio di routine; Di solito, i falsi positivi verranno rimossi. Risultati falsi negativi causati dall'"effetto prozona" osservato nel precedente test 7-Plex ECL^27,28 non sono stati osservati nel presente studio. Nel test qui descritto, abbiamo rimosso la fase del trattamento acido dei campioni di siero dal protocollo precedente; invece, abbiamo preriscaldato i campioni di siero a 56 ° C per 30 minuti (fase 5.1.). Il secondo giorno di lavaggio delle piastre, abbiamo usato un tampone di lavaggio contenente 0,4 M NaCl (fase 8.1.) invece del normale tampone di lavaggio per lavare la piastra in modo più rigoroso. Queste modifiche hanno reso il test ECL multiplex più semplice e abbassato lo sfondo senza perdere la sensibilità del test.

In conclusione, questo test ha prestazioni eccezionali per rilevare quattro IAb, TGA e COVID-19A contemporaneamente. La funzione multiplexing, così come l'elevato rendimento, il basso costo e il piccolo volume di siero richiesto, rendono lo screening su larga scala per T1D e malattie concomitanti molto più fattibile nella popolazione generale. I pazienti con T1D o qualsiasi malattia autoimmune hanno un rischio molto più elevato per altre malattie autoimmuni. Il test ECL multiplex fornisce una piattaforma eccellente per lo screening simultaneo di T1D e più malattie autoimmuni.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mM NaCl	ThermoFisher	1070832
96-well Plate Shaker	VWR	12620-926
96-well round bottom plate	Fisher	8408220
Biotin	ThermoFisher	PI21329
Blocker A	MSD	R93AA
Bottle-Top 500 ml-Filter Units	Fisher	0974064A
Bovine Serum Albumin	Sigma	A-7906
GAD65 protein	Diamyd Medical	10-65702-01
IA-2 protein (aa 605-979)	Creative BioMart	283309
MESO QuickPlex SQ120	MSD	R31QQ-3	Electrochemiluminescence analyzer
PBS 10x	ThermoFisher	70011044
PBS 1x	ThermoFisher	10010023
Proinsulin protein	AmideBio	20160118B3
Read buffer B	MSD	Y0800019
SARS-CoV-2 RBD protein	Creative Biomart	Spike-190V
Stop Solution	MSD	Y0090019
Sulfo-TAG	MSD	R91AO-1
tTG protein	Diarect AG	15201
Tween 20	Sigma	P-1379
U-Plex 6-Assay SECTOR plate	MSD	Z00U0142E	6-plex plate
U-PLEX Linker 1	MSD	L0010022
U-PLEX Linker 10	MSD	L0100020
U-PLEX Linker 2	MSD	L0020015
U-PLEX Linker 3	MSD	L0030018
U-PLEX Linker 8	MSD	L0080018
U-PLEX Linker 9	MSD	L0090014
ZeBa Column	ThermoFisher	89892	Spin columns
ZnT8 protein	Research Laboratory	n/a