Yapay Olarak Yetiştirilen Bakteriler Tarafından Murin Vajinal Kolonizasyon Modelleri

Özet

Protokol, anaerobik olarak kültürlenmiş insan vajinal bakterileri ile vajinal kolonizasyonun bir fare modelini sunar. Prevotella bivia ve Fusobacterium nucleatum için öneriler eklerken Gardnerella vaginalis'e odaklanıyoruz. Bu protokol aynı zamanda vajinal aşılamalar ve diğer anaerobik olarak yetiştirilen bakterilerin canlı iyileşmesi için bir rehber olarak da kullanılabilir.

Özet

Memeli vajinası birçok bakteri taksonu tarafından kolonize edilebilir. İnsan vajinal mikrobiyomuna genellikle Lactobacillus türleri hakimdir, ancak dört kadından biri, düşük bir laktobasil seviyesine çeşitli anaerobik bakterilerin aşırı büyümesinin eşlik ettiği bakteriyel vajinozis yaşar. Bu durum, üreme ve cinsel sağlık riskleri de dahil olmak üzere birçok sağlık komplikasyonu ile ilişkilendirilmiştir. İnsan vajinal sağlığındaki mikrobiyal etkileşimlerin karmaşık doğasını gösteren artan kanıtlar olsa da, bu farklı anaerobik bakterilerin bireysel rolleri tam olarak anlaşılamamıştır. Bu, anaerobik olarak yetiştirilen vajinal bakterileri incelemek için yeterli modellerin bulunmaması nedeniyle karmaşıktır. Fare modelleri, bu organizmaların biyolojisini ve virülansını in vivo olarak araştırmamıza izin verir. Vajinal bakteriyel aşılamanın diğer fare modelleri daha önce tanımlanmıştır. Burada, anaerobik olarak yetiştirilen bakterilerin aşılanması ve geleneksel olarak yetiştirilmiş C57Bl / 6 farelerde uygulanabilir iyileşmeleri için yöntemleri açıklıyoruz. Vajinal aşılama ve yıkama için yeni, daha az stresli bir prosedürel yöntem de tanımlanmıştır. Gardnerella'nın aşılanması ve uygulanabilir geri kazanımı ayrıntılı olarak özetlenmiş ve Prevotella bivia ve Fusobacterium nucleatum gibi ek anaeroblar için stratejiler tartışılmıştır.

Giriş

Memelilerde, vajina bakteri türlerinden oluşan bir konsorsiyuma ev sahipliği yapar. İnsan vajinal mikrobiyomu, Lactobacillus cinsinin üyelerinin bolluğu ve buna karşılık gelen düşük vajinal pH (3.8-4.5) 1,2,3,4 ile memeliler arasında benzersizdir. Bu Lactobacillus baskınlığının bozulması, çeşitli olumsuz sağlık sonuçları ile ilişkilidir.

Bakteriyel vajinoziste (BV) daha az laktobasil ve Gardnerella vaginalis ve Prevotella bivia ^5,6 gibi çeşitli anaerobik bakterilerin bolluğu artar. BV'li kadınlar cinsel yolla bulaşan enfeksiyonlar ^7,8,9, kısırlık 10, gebelik kayıpları 11, erken doğum^12,13,14, rahim içi enfeksiyonlar 15, servikal enfeksiyonlar 16 ve kanser ^16,17,18 riski altındadır. . BV ayrıca, amniyotik sıvı enfeksiyonlarından ortak bir izole olan Fusobacterium nucleatum ^1,19,20 gibi potansiyel olarak patojenik bakteriler tarafından vajinal kolonizasyon olasılığının daha yüksek olması ile ilişkilidir ²¹.

Anaerobik bakterilerin insan vajinal sağlığındaki önemi nedeniyle, bu organizmaların biyolojisini ve patogenezini araştırmak için kullanılabilecek hayvan modellerine ihtiyaç vardır. Burada, östrojenize farelerde vajinal aşılama ve Gardnerella vaginalis'in canlı iyileşmesi için yöntemleri tarif ediyoruz ve Prevotella bivia ve Fusobacterium nucleatum için ek stratejiler öneriyoruz. Murin vajinal kolonizasyonunun diğer modelleri daha önce tanımlanmıştır, ancak bunlar aerobik olarak kültürlenen Grup B Streptococcus²² ve Neisseria gonorrhoeae²³ gibi fakültatif anaerobik bakterilerin aşılanması ve geri kazanılmasına odaklanmıştır. Zorunlu anaerobların aşılanması ve geri kazanımı uygun deneysel stratejilerle başarılı bir şekilde gerçekleştirilebilir. Birkaç bakteri taksonunun uygulanabilir geri kazanımı için yaklaşımları tartışıyoruz ve ilgilenilen ek türlerin / suşların yaşayabilirliği için koşulların ampirik olarak değerlendirilmesini öneriyoruz.

Canlı bakteriler tarafından kolonizasyonu tahmin etmenin klasik yöntemi, koloni oluşturan birimlerin (CFU'lar) geri kazanılmasıdır. Geleneksel olarak yetiştirilen ve kendi endojen mikrobiyotaları olan farelerde, bu, endojenöz vajinal mikrobiyotanın üyelerine karşı seçim yapan ve aynı zamanda aşılanmış bakteri suşunun büyümesine izin veren agar ortamında iyileşme gerektirir. Burada, streptomisin içeren bir agar ortamında seçici olarak geri kazanılabilen G. vaginalis^24'ün streptomisin'e dirençli bir izolatını kullanıyoruz. Ortamın yeterince seçici olduğundan ve tersine, streptomisin'e dirençli bakterilerin endojen mikrobiyomda bulunmadığından emin olmak için, aşılamadan hemen önce toplanan vajinal lavajlar seçici (streptomisin içeren) agar üzerine kaplanmalıdır.

İnokulum hazırlığı için en iyi yöntem, bakteri türleri ve suşları arasında değişebilir. Farelerde deneylerin başlamasından önce, kültür ortamı, büyüme bitiş noktası ve inokulumun hazırlanması için tercih edilen koşulları ve ayrıca PBS'de oksijene duyarlılığı ve yaşayabilirliği belirlemek için ön çalışma yapılmalıdır. Daha fazla oksijene duyarlı bakteri olması durumunda, inokulumun alternatif preparatları düşünülebilir (örneğin, uygun bir araç kontrol grubuna sahip anaerobik bir kültür ortamında)^25,26.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, kurumsal kılavuzlara ve California San Diego Üniversitesi Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na (UCSD, Protokol Numarası: S20057, 2020'den itibaren) ve bundan önce Washington Üniversitesi, St. Louis'de (Protokol 20110149, 2020'ye kadar) uygun olarak onaylanmış ve yürütülmüştür.

NOT: Aşağıdaki protokol, aşılama sırasında 6-11 hafta yaşları arasında geleneksel olarak yetiştirilmiş dişi C57Bl / fareleri kullanır. Lütfen satıcı bilgilerini ve daha önce atıfta bulunulan ilgili çalışmada kullanılan belirli yaş aralıklarını dikkate alın.

1. β-estradiol 17-valeratın hazırlanması ve uygulanması

NOT: β-östradiol 17-valerat bir kanserojen ve deri yoluyla emilebilen bir üreme toksinidir^27,28. Toz ve sıvı çözeltinin işlenmesi sırasında uygun KKD kullanın. Aynı zamanda bir su toksini²⁹; uygun şekilde kapatılmış ve etiketlenmiş bir kaba uygun şekilde atın.

1. Filtre, 50 mL konik tüp vakum filtre sistemi kullanarak 0,22 μm filtre ile 50 mL'ye kadar susam yağını sterilize eder. Steriliteyi korumak için sadece bir biyogüvenlik kabininde açın.
2. Deney için gereken β-östradiol valerat çözeltisinin hacmini hesaplayın: fare başına 200 μL artı şırınga doldurma sırasında numune kaybını hesaba katmak için ekstra 2-3 mL (örneğin; 10 farelik bir deney toplamda 4 mL gerektirir). 5 mg / mL'lik bir çözelti yapmak için gereken β-östradiol valerat miktarını hesaplayın ve doğrudan 14 mL'lik yuvarlak tabanlı bir tüpte tartın.
3. 14 mL tüpü sıkıca kapatın ve tozdaki kümeleri parçalamak için vorteks yapın (bu, β-estradiol valeratın daha hızlı çözünmesini sağlayacaktır). 14 mL tüpe steril filtrelenmiş susam yağı ekleyin, böylece β-estradiol valeratın son konsantrasyonu 5 mg / mL olur.
4. Sıkıca kapatılmış 14 mL tüpü, katı toz tamamen çözünene kadar 37 ° C'de 30-40 dakika boyunca bir rotatör üzerine yerleştirin. Farelere enjeksiyondan önce çözeltinin homojenliğini görsel olarak onaylayın. 37 °C'de inkübasyon, susam yağının viskozitesini azaltarak enjekte edilmesini kolaylaştırır.
5. β-estradiol valerat çözeltisini 1 mL'lik bir şırıngaya (iğnesiz) hazırlayın. Bunu kabarcıklar sokmadan yapmak için, önce çözeltinin bir kısmını çekin, ardından şırınganın ucunu susam yağında tutarken yavaşça dışarı atın. Çözeltiyi tekrar yavaşça hazırlayın, 100 μL işaretini biraz geçin.
6. Şırınganın üzerine iğne içinde 25 G x 5/8 yerleştirin. Daha sonra, susam yağı çözeltisini iğne ucundan çıkmaya başlayana kadar yavaşça dışarı atarak iğneyi hazırlayın. Şırınga 100 μL işaretine gelene kadar çözeltiyi dışarı atın. Fare başına bir şırınga hazırlayın.
7. β-estradiol 17-valeratı aşılamadan önce 48 saat veya 72 saatte intraperitoneal enjeksiyonla uygulayın. Her fareye, daha^{önce açıklandığı gibi} 5 mg / mL β-estradiol valerat çözeltisinin (0.5 mg β-estradiol valerat / fare) ^{100 μL'sini} enjekte edin. Kalan çözeltiyi bir sonraki enjeksiyona kadar 72 saat boyunca 4 ° C'de saklayın.
8. β-estradiol valerat çözeltisini, farelerin vajinal aşılamasından hemen önce, aşılama gününde tekrar uygulayın. Çözeltiyi 4 °C'den çıkarın ve susam yağının ısınmasına ve daha az viskoz hale gelmesine izin vermek için enjeksiyondan önce 30 dakika boyunca 37 ° C'de bir rotatöre yerleştirin. Adım 1.7'de açıklandığı gibi enjeksiyonlara devam edin.

2. İnokulum hazırlanması

NOT: Bu bölüm, anaerobik olarak yetiştirilen streptomisin'e dirençli Gardnerella vaginalis JCP8151B-SmR^{24,25,31,32'den} inoküla hazırlanması için genel adımları içermektedir. Bu bölümdeki tüm adımlar anaerobik bir odada yapılmalıdır.

1. Hazırlanan NYC III et suyu, agar ve PBS dahil olmak üzere herhangi bir reaktifi, kullanımdan en az 24 saat önce dengelemek için anaerobik bir odaya döngüleyin.
   NOT: Burada,% 5 hidrojen gazı karışımı ile dengelenmiş bir vinil anaerobik oda kullanılmıştır. İç oksijen konsantrasyonu tipik olarak 0 ppm'de durur, ancak malzemeleri odaya çevirirken düşük seviyeli geçici artışlar (10-25 ppm) olabilir.
2. Vajinal aşılamadan iki gün önce, Gardnerella'yı dondurulmuş bir gliserol stoğundan anaerobik odadaki bir NYC III agar plakasına yerleştirin. Gliserol stoğunu haznenin içine ve dışına taşıma sırasında donmuş halde tutmak için kuru buzla doldurulmuş küçük bir kap (boş bir pipet ucu kutusu gibi) kullanın.
3. Vajinal aşılamadan 1 gün önce, 10 mL NYC III suyu aşılamak için plakadan 5-10 bireysel Gardnerella kolonisi kullanın. Sıvı kültürün 37 ° C'de 16 saat boyunca gece boyunca büyümesine izin verin. Kültür ortamının aşılamadan bırakılan ikinci bir 1 mL aliquot'unu ekleyin ve ortamın kirlenmemiş olduğunu doğrulamak için aşılanmış kültürün yanında inkübe edin.
4. İnokulumu, aşağıda açıklandığı gibi sıvı kültürden hazırlayın. İnokulum preparatını anaerobik odada mümkün olduğunca yapın.
   1. 1,5 mL'lik bir küvette (1:5 seyreltme) 800 μL taze ortama 200 μL kültür ekleyerek kültür optik yoğunluğunu (OD) belirleyin. Seyreltilmiş kültürün yoğunluğunu (OD) 600 nm dalga boyunda ölçmek için bir spektrofotometre kullanın (boş olarak yalnızca taze ortam içeren ayrı bir küvet kullanın). 16 saat kültürünün gerçek OD_600'ünü elde etmek için OD okumasını 5 ile çarpın.
   2. Deney için gereken inokulum hacmini hesaplayın. Örneğin, 15 fareyi fare başına 20 μL'lik bir inokulum ile enfekte etmek için, 15 x 20 μL = 300 μL inokülum gereklidir. Gerekenden yaklaşık% 25 daha fazla inokülum hazırlayın, bu nedenle 15 fare için 300 μL + (0.25 x 300 μL) = 375 μL inokülum hazırlayın.
   3. Adım 2.4.1.'de belirlenen OD 600'ü kullanarak, adım 2.4.2'de hesaplanan hacimde bir OD₆₀₀ = 5.0 inokulum elde etmek için döndürülmesi ve yeniden askıya alınması gereken₁₆ saatlik kültürün hacmini hesaplayın. Örneğin, kültürün OD_600'ü 1.5 ise ve ihtiyaç duyulan inokülum hacmi 375 μL ise, döndürülecek kültürün hacmi (375 μL x 5) / 1.5 = 1250 μL'dir.
   4. Pipet, adım 2.4.3'te hesaplanan kültür hacmi. steril bir mikrosantrifüj tüpüne. 1-3 dakika boyunca 16.000 x g'da santrifüj yaparak bakterileri topaklayın.
   5. Süpernatantı çıkarın ve peleti adım 2.4.2'de hesaplanan hacimde anaerobik PBS'de yeniden askıya alın. İnokulum şimdi hesaplanan OD_{600 / 5.0'da} olacaktır. Mümkünse, enfekte olmamış kontrol grubundaki fareler için bir araç kontrolü görevi görecek bir PBS tüpü hazırlayın.
5. İnokulum tüpünü anaerobik odadan çıkarmadan önce, PBS'de 1:10 ila 1:10 x 10⁶ arasında bir seri seyreltme serisi hazırlayın. Spot plaka 5, inokulumun CFU'sunu belirlemek için çok kanallı bir pipet kullanarak her seyreltmenin bir agar plakasına kopyalanır. Bu aşılama öncesi CFU'dur.

3. Gardnerella ile vajinal pre-lavaj ve aşılama

1. Anaerobik odada vajinal lavaj / yıkama tüpleri hazırlayın (bu, adım 2.4'te inokülum hazırlığı ile aynı anda yapılabilir). Pipet, fare numaralarıyla etiketlenmiş 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine 70 μL steril, anaerobik PBS'dir. Fare başına bir yıkama tüpü hazırlayın. Tüpleri sıkıca kapatın ve anaerobik odadan dışarı doğru çevirin.
2. Adım 3.1'de hazırlanan ayrı tüplerden 50 μL anaerobik PBS ile her fareye vajinal lavaj yapın. Bu vajinal lavajlar aşılama öncesi yıkamalardır ve aşağı akış ölçümleri ve tahlilleri için kullanılabilir.
   1. İkinci β-östradiol valerat enjeksiyonunun uygulanmasından sonra (adım 1.8), her fareyi bir kafesin üstüne veya ön pençeleriyle kavrayabileceği temiz ve sert bir yüzeye yerleştirin. Kuyruğun orta kısmını yavaşça tutun ve kaldırın, böylece arka kısımlar hafifçe yükseltilir ve vajinal açıklık açığa çıkar.
   2. Bir pipet ve p-200 filtre ucu kullanarak, uygun fareye karşılık gelen yıkama tüpünden 50 μL PBS çekin. Pipet ucunu yavaşça vajinal lümene ~2-3 mm yerleştirin ve 50 μL hacmini 3x-4x yavaşça içeri ve dışarı pipetleyin.
   3. Toplanan yıkama malzemesini (~ 50 μL) geldiği aynı yıkama tüpüne geri aktarın, kalan 20 μL PBS'yi hala içeren yıkama tüpünde yukarı ve aşağı pipetleme yapın. Aşırı mukus varsa ve uç tıkanırsa, kalan malzemeyi toplamak ve aynı yıkama tüpüne yerleştirmek için temiz bir p-200 ucu kullanın.
3. Konsantre bakteriyel süspansiyonun 20 μL'sini veya araç kontrolünü vajinal olarak her farenin vajinasına uygulayın. Her fareyi, o fare için vajinal lavajdan hemen sonra aşılayın (yani, bir sonrakine geçmeden önce her fare için sırayla lavaj ve aşılama yapın). Bu işlemi basitleştirmek için, biri lavajlar için 50 μL'ye, diğeri aşılamalar için 20 μL'ye ayarlanmış iki p200 pipet kullanın.
   1. Fareyi adım 3.2.1'de açıklandığı gibi kısıtlayın. Bir p-200 ucu kullanarak, vajinaya 20 μL bakteriyel süspansiyon pipetin. İki farklı bakteri türü / suşu kullanan ko-aşılama deneyleri için, her bakteriyel süspansiyonun 10 μL'sini kullanın ve aşılamadan önce iki suşu karıştırmaktan kaçının.
      NOT: Vajinadan dışarı dökülmeyi önlemek için toplam aşılama hacmi 20 μL'yi geçmemelidir.
   2. Uygulanan hacmin vajinal introitusta hemen birikmesini önlemek için her farenin arka ucunu 10-20 s tutmaya devam edin. Ardından, fareyi yeni bir kafese/kaba veya daha önce aşılanmış kafes arkadaşlarına yerleştirin.
   3. 3.2 adımını yineleyin. ve adım 3.3. her fare için. Fareleri asla henüz aşılanmamış hayvanların bulunduğu bir kafese geri koymayın. Bu, aşılamadan önce farelerin yanlışlıkla streptomisin'e dirençli bakterilere maruz kalmasını önler.
4. Tüm fareler aşılandıktan sonra, inokülum tüpünü anaerobik odaya geri döndürün. Adım 2.5'te açıklandığı gibi başka bir seri seyreltme hazırlayın ve plakalayın. Bu aşılama sonrası CFU'dur. Hayvanların aşılaması sırasında anaerobik odanın dışındayken inokulumun canlılığının azalıp azalmadığını belirlemek için aşılama sonrası ve aşılama öncesi plakalardan CFU'ları karşılaştırın.
5. Adım 3.2'de toplanan vajinal lavajları plakalayın. seçici agar üzerinde (bu durumda, 1 mg / mL streptomisin). Plakaları 37 ° C'de anaerobik bir odada 1-2 gün boyunca inkübe edin ve büyümeyi inceleyin.
   NOT: Büyüme, mikrobiyomun endojen üyelerinin seçim belirtecine dirençli olduğunu ve bu nedenle hedef organizmanın CFU sayımını gizleyebileceğini gösterir.

4. Uygulanabilir Gardnerella kolonizasyonunu belirlemek için vajinal lavajların toplanması

1. Vajinal kolonizasyonu analiz etmek için vajinal yıkamaları belirli zaman noktalarında toplayın. Adım 3.2'de açıklandığı gibi toplayın.
2. Toplandıktan hemen sonra, vajinal lavajları anaerobik bir odaya çevirin. Adım 2.5'te açıklandığı gibi seçici agar üzerine seri seyreltme ve kaplama yapmak için her lavajın 10 μL'sini kullanın. CFU sayımlarını Gardnerella (veya ilgi çekici başka bir anaerob) tarafından vajinal kolonizasyonun bir ölçüsü olarak kullanın.

5. Kurban, diseksiyon ve doku homojenizasyonu

1. Her fareden toplanan her organ için 5 mL'lik bir tüp hazırlayın (örneğin, vajina, serviks ve uterusun hepsi toplanıyorsa, fare başına üç tüp hazırlayın). Her tüpü anaerobik haznede steril anaerobik 1x PBS (veya başka bir homojenizasyon ortamı) ile doldurun. Vajinaları ve serviksleri toplamak için kullanılan tüpler için 1 mL PBS ve uterus boynuzlarını toplamak için kullanılan tüpler için 750 μL kullanın.
2. PBS eklendikten sonra, her bir tüpü tartın (bu, toplama öncesi ağırlıktır ve hasat edilen her dokunun toplam ağırlığını belirlemek için kullanılacaktır). Anaerobik odada bir kantar yoksa, tüpleri sıkıca kapatın ve tartılacak odadan dışarı doğru çevirin, ardından tekrar içeri sikletin.
   NOT: Tüp hazırlama ve ağırlık toplama fedakarlıktan 1 gün önce yapılabilir, ancak tüpler buharlaşmayı önlemek için kapakları sıkıca kapatılmış olarak anaerobik odada tutulmalıdır.
3. Adım 3.1'de açıklandığı gibi bir dizi vajinal lavaj tüpü hazırlayın. kurban keserken son lavajı toplamak. Ayrıca, kurban sırasında standart çelik diseksiyon aletlerinin durulanması ve sterilize edilmesinde kullanılmak üzere 50 mL'lik bir deiyonize (DI) su kabı ve% 70-90 etanolden oluşan ikinci bir 50 mL beher hazırlayın.
4. PBS dolu organ toplama tüplerini anaerobik odadan dışarı çıkarın. Dokular eklenmeye hazır olana kadar tüpleri sıkıca kapalı tutun.
5. IACUC onaylı yöntemleri kullanarak her fareyi feda edin. Son lavajı adım 3.2.2'de açıklandığı gibi gerçekleştirin. ve 3.2.3. ya kurban edilmeden hemen önce ya da hemen sonra.
6. Diseksiyon ve doku toplamaya başlayın. Her farenin karnını ve sırtını% 70 etanol ile püskürtün. Makası bir etanol kabında sterilize edin, kurumasını bekleyin ve ardından fare abdominopelvik boşluğunu tek bir dikey kesim yapın.
7. Cildi geri çekmek için steril forseps kullanın ve bağırsakları vücut boşluğundan ve üreme sistemini açığa çıkaracak açık alanın kenarına hafifçe itin.
   NOT: Bağırsakları delmemeye veya delmemeye dikkat edin, çünkü deneysel sonuçları karıştırabilecek streptomisin'e dirençli bakterileri barındırabilirler.
8. Maksimum vajinal dokuyu toplamak için, nekropsi sırasında kasık kemiğini kırın. Steril makas kullanarak, vajinayı kesmemeye dikkat ederken kasık kemiğinin merkezini (kasık simfizi) kırpın. İki set steril forseps kullanarak, pelvisin her iki tarafını tutun ve pelvisi yanal olarak çekerek vajinanın alt kısmını altına maruz bırakın.
9. Serviksi nazikçe kavramak için forseps kullanın (çevreleyen dokuya kıyasla daha sert bir yapı). Vajinanın arkasına gizlenmiş ve yakından bağlı olan kolonu ortaya çıkarmak için rahim ağzını yavaşça yukarı çekin.
10. Vajinayı dış bağ dokularından serbest bırakmak için küçük makas kullanın. Vajinayı kolondan dikkatlice ayırın ve bağırsak sistemini delmekten kaçının. Tamamen serbest bırakıldığında, vajinayı introitusa makasla yaklaştırın ve fare gövdesinden serbest bırakmak için kırpın.
11. Rahim boynuzlarını daha görünür hale getirmek için hafifçe yukarı çekerken rahim ağzı üzerinde nazik bir tutuş sağlayın. Öte yandan, uterus boynuzlarını serbest bırakmak için sağ ve sol taraftaki yumurtalıkların hemen altından kesin. Şimdi bağlantısı kesilmiş üreme sistemini vücut boşluğundan çıkarın ve steril bir Petri plakasına yerleştirin.
12. Bir tıraş bıçağı kullanarak, uterus boynuzlarını, serviksi ve vajinayı ayırın. Her dokuyu kendi etiketli toplama tüpüne yerleştirin. Sitokinler toplanacaksa, doku ilavesinden sonra tüpleri buzun üzerine yerleştirin.
13. Doku eklendikten sonra her tüpü tekrar tartın. Bu, koleksiyon sonrası ağırlıktır. Dokunun toplam ağırlığını elde etmek için toplama öncesi ağırlığı toplama sonrası ağırlıktan çıkarın.
14. Toplama tüplerindeki organları homojenize etmek için elde taşınan bir homojenizatör kullanın. Gardnerella JCP8151B için, bu adımı biyogüvenlik kabininde (aerobik olarak) veya anaerobik odada gerçekleştirin.
    1. Numuneler arasında el tipi homojenizatörün yıkanması ve aseptik olarak işlenmesi için birkaç tüp seti hazırlayın. Her setin üç adet 50 mL konik tüpe sahip olduğundan emin olun: biri DI suyuyla, biri %70 etanol ve üçüncüsü 1x PBS ile doldurulur. Her fare tedavi grubu için ayrı bir yıkama tüpü seti hazırlayın.
    2. Homojenizatörü temizlemek için, bıçakları her yıkama tüpündeki sıvıya indirin ve cihazı maksimum hıza getirin. Homojenizatörü üç tüpün her birinde yaklaşık 3 saniye tutun. Yıkama sırası DI suyu (fiziksel kalıntıları gidermek için), daha sonra etanol (sterilize etmek için) ve son olarak 1x PBS'dir (nötralize etmek için). Her durulama arasındaki fazla sıvıyı gidermek için probu bir kağıt havlu veya tek kullanımlık tezgah pedi üzerine çalkalayın.
    3. İlk durulamayı takiben, homojenizatör probunu toplama tüpünün altına indirerek dokuları homojenleştirin ve dokuyu altındaki dokuyu hapsedin. Dokuyu öğütmek için homojenizatörü açın, suya batırılmış kalırken probu yaklaşık 5 kat yukarı ve aşağı hareket ettirin. Her organı yaklaşık 15-30 s homojenize edin.
    4. Homojenizatörü kapatıp tüpten çıkardıktan sonra, doku bozulmasının tam olarak sağlanması için içeriği görsel olarak inceleyin. Bu, bazen sonda tarafından yakalanamayan serviks ve vajina için özellikle önemlidir.
       NOT: Rahim boynuzlarındaki fazla yağların tamamen homojenleşmemesi sorun değildir.
    5. 5.14.1.-5.14.4. adımlarını tekrarlayın, probu her numune arasında yıkayın ve sterilize edin. Her deney grubu için yeni bir yıkama tüpü setine geçin.
15. Homojenize numuneler içeren tüpleri anaerobik odaya taşıyın. Her dokunun bakteri yükünü belirlemek için, karıştırmak için numunenin kısa nazik vorteksini uygulayın, ardından seri seyreltme için 100 μL doku homojenatını çıkarın ve CFU tayini için seçici agar üzerine kaplama yapın (ilk seyreltme 1 x 10^0'dır). Daha düşük bir algılama sınırı gerekiyorsa, 200-250 μL seyreltilmemiş homojenatın yayılma kaplamasını gerçekleştirin.

Sonuçlar

Örnek bir deneyin şematik bir gösterimi, açıklanan protokolün gerçekleştirilebileceği bazı yolları gösterir (Şekil 1).

Bazı hayvanlar, vajinal mikrobiyomlarında, seçici olmayan ortamlarda büyüyecek endojen mikroplar taşıyacaktır. Burada tarif edilen yöntemler, endojen bakterilere karşı seçim yapmak için, çalışılan bakteri suşlarının streptomisin'e dirençli izolatlarına, streptomisin içeren seçici ortamlarla birlikte dayanır (Şekil 2A, B). Streptomisin direncinin kendiliğinden gelişmesi mümkündür, bu nedenle enfeksiyondan önce fareleri kontrol etmek (0. gün yıkamaları) bunun bir sorun olup olmadığını belirlemeye yardımcı olabilir.

Vajinal yıkamalardan canlı bakterilerin geri kazanımı, agar ortamında seri seyreltme ve kaplama ile gerçekleştirilir. Standart bir petri kabı, 6 x 6 diziye kadar 5 μL nokta tutabilir ve 10 kat seri seyreltme kullanılıyorsa, her numune için altı büyüklük sırası boyunca altı replika noktasından bakteri titrelerinin numaralandırılmasına izin verir (Şekil 3A). Bu yöntem, Gardnerella'dan Prevotella ve Fusobacterium'a kadar değişen bakteri titrelerini numaralandırmak için kullanılabilir (Şekil 3B-D).

Birlikte, bu yöntemler hipotezleri test etmeye ve kadın üreme sisteminin bakteriyel kolonizasyonu / enfeksiyonu hakkında yorumlar yapmaya izin verir. Örneğin, vajinal yıkamalarda ve vajinal doku homojenatlarında Gardnerella titrelerinin karşılaştırılması, bu yöntemler arasında uyum olduğunu göstermiştir (Şekil 4A). Benzer şekilde, vajinal ko-aşılama modelinde, uterus dokusundaki Prevotella titreleri, Prevotella mono-enfeksiyonuna kıyasla Gardnerella ko-enfeksiyonu sırasında anlamlı derecede daha yüksekti (yaklaşık 20 kat) (Şekil 4B). Son olarak, üreme sistemi kolonizasyonu / enfeksiyonu süreçlerinde spesifik genlerin ve ürünlerinin oynadığı rolleri belirlemek için bu modellerde vahşi tipe karşı mutant bakteri suşları karşılaştırılabilir. Örneğin, karbonhidrat sialik asidi taşıma ve tüketme kabiliyetinden yoksun bir mutant Fusobacterium suşu, aşılamadan 3 gün sonra daha düşük kolonizasyon seviyelerine yol açmıştır (Şekil 4C).

Şekil 1: Örnek bir deneyin şeması³³. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Endojen murin vajinal mikroplarının seçici ve seçici olmayan agar üzerinde büyümesi. Beş dişi C57Bl / 6 fareden (1-5) vajinal lavajlar iki farklı NYC III agar plakasına dizildi ve anaerobik olarak inkübe edildi. (A) Soldaki plaka herhangi bir antibiyotik içermez ve murin vajinal yoldan endojen anaerobik bakterilerin büyümesine izin verir. (B) Sağdaki plaka 1 mg/mL streptomisin içerir ve endojen bakterilerin büyümesine karşı seçim yapar. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Vajinal yıkamalardan canlı G. vaginalis, P. bivia ve F. nucleatum CFU'ların geri kazanılması. (A) NYC III AGAR'da seyreltme serisi olarak çoğaltılmış G. vaginalis JCP8151B-SmR inokulumunun CFU'ları. (B-D) Mono-enfekte hayvanların vajinal lavajlarından canlı (B) G. vaginalis²⁴, (C) P. bivia²⁵ ve (D) F. nucleatum^26'nın geri kazanılması. Her grafik (B-D) için, veriler iki bağımsız deneyden birleştirilir ve deney başına 10-15 fare^{24,25,26 olur}. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Bir murin vajinal aşılama modelinde anaerobik bakteriyel kolonizasyonun daha ileri analizi. (A) Vajinal yıkamalardaki G. vaginalis titreleri, aşılama sonrası 24 saat ve 72 saat vajinal doku homojenatlarından elde edilen G. vajinalis titreleri ile ilişkilidir (her biri n = 10 saat olmak üzere iki bağımsız deneyin kombinasyonu). Spearman'ın rütbe korelasyon testi ile belirlenen anlamlılık)²⁴. (B) G. vaginalis ile birlikte enfeksiyon, aşılama sonrası 48 saatte P. bivia mono-enfekte hayvanlarla karşılaştırıldığında uterus boynuz dokusunda P. bivia titrelerinin artmasına neden olur (her biri grup başına 6-10 fare ile iki bağımsız deneyin kombinasyonu. Mann-Whitney U-testi tarafından belirlenen anlamlılık, **p = 0.0017)²⁵. (C) Bozulmuş sialik asit taşıyıcılı F. nucleatum mutantı (Ω SiaT), mono-enfekte farelerin vajinal lavajlarındaki titreleri, aşılama sonrası 72 saatte F. nucleatum vahşi tipine kıyasla azaltmıştır (her biri grup başına 10 fareye sahip iki bağımsız deneyin kombinasyonu). Mann-Whitney U-testi tarafından belirlenen anlamlılık, **p < 0.01)²⁶. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Anaerobik koşullar altında yetiştirilen farklı vajinal bakteriler için kullanılan yöntemlere örnekler. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Tartışmalar

Burada açıklanan modelin daha önce yayınlanmış vajinal aşılama modellerinden farklı olmasının en önemli yolu, canlı inokülumun hazırlanması ve bakterilerin farelerden geri kazanılması için özel hususlar gerektiren anaerobik olarak kültürlenmiş bakterilerin kullanılmasıdır. Yukarıdaki protokoldeki belirli adımlar, Ek Dosya 1'de önerildiği gibi, kullanılan bakteri türüne / suşuna bağlı olarak biraz değişebilir. Ek olarak, bu makale, araştırmacı tarafından daha az deneyim gerektiren bakteri ve vajinal yıkamaların uygulanması için yeni bir prosedürel yöntemi ve fareler için daha az kısıtlama gerektirmektedir. Deneyci, adım 3.2'de açıklanan kısıtlama biçiminden memnun değilse. ve adım 3.3., fareler bunun yerine deneysel tasarıma ve kurumsal IACUC kılavuzlarına göre anestezi ile veya anestezi olmadan daha önce tarif edildiği gibi³⁴ olarak karıştırılabilir.

Murin modellerinde anaerobik olarak kültürlenmiş bakterilerin kullanımına ilişkin önemli bir uyarı, belirli adımların (canlı hayvanları içeren herhangi biri gibi) anaerobik odanın dışında yapılması gerektiğidir. Bu nedenle, bu protokoldeki en kritik adımlar, ilgilenilen bakterilerin, farelerin aşılanması sırasında olduğu gibi aerobik bir ortama maruz kalacağı adımlardır. Bu modelde herhangi bir yeni anaerobun kullanılması, oksijene maruz kaldıktan sonra canlılığını sürdürme kabiliyeti hakkında ön araştırma gerektirecektir (örneğin, adım 2.5. ve adım 3.4'te açıklandığı gibi aşılama öncesi ve sonrası CFU'ların karşılaştırılması gibi). Organizmanın oksijen derecesine ve PBS duyarlılığına bağlı olarak, farklı inokulum hazırlama yöntemleri düşünülmelidir (Ek Dosya 1, adım 2.4.5.). G. vaginalis JCP8151B kullanan aşılar için, PBS'de tek bir inokülum tüpünün hazırlanabileceğini ve tüm fareleri enfekte etmek için kullanılabileceğini bulduk. Oksijene daha duyarlı farklı bir anaerobik bakteri kullanılıyorsa, inokülum bunun yerine her fare için ayrı tüplerde hazırlanabilir, böylece tüpün tekrar tekrar açılması / kapatılması gerekmez. Aynı şekilde, ilgilenilen bakteri türleri PBS'de G. vaginalis'ten daha titiz / daha az hayatta kalabiliyorsa, aşılama bunun yerine kültür ortamında hazırlanabilir. Kullanılan ortam, Prevotella bivia'yı kültürlemek için kullanılan CDC anaerobe ortamı gibi indirgeyici maddeler içeriyorsa (Ek Dosya 1, adım 2.1. ve adım 2.2.), bakteriler ayrıca oksijene maruz kalmaya karşı daha fazla korumaya sahip olacaktır.

Homojenizasyon için, tüp kapağı kapalıyken yapılan ve bu nedenle el tipi homojenizatörden daha az oksijen sağlayabilen boncuk çırpma^22,35 gibi alternatif yöntemler de düşünülebilir. Ek olarak, daha oksijene duyarlı organizmalar, ortam için daha uzun bir denge süresi gerektirebilir. Anaerobik koşullara ulaşıldığını kontrol etmek için resazurin gibi bir oksijen göstergesi kullanılabilir (adım 2.1.). Anaerobik kavanozlar gibi alternatif yöntemler sonuçları etkileyebilir ve kullanımdan önce bakteriyel canlılık açısından incelenmelidir.

Deneysel organizmanın oksijen duyarlılığı ve titizliği, lavajlar / homojenizasyon sırasında canlı bakterilerin fareden başarılı bir şekilde geri kazanılmasında da rol oynayabilir (Ek Dosya 1, adım 3.2. ve adım 5.1.). Son derece hassas organizmalar için, alınan ve kaplanan lavaj arasındaki süre, canlılık kaybına yol açabilir ve yapay olarak düşük bir bakteriyel vajinal kolonizasyon tahminine neden olabilir. Bu etkiyi hafifletmek için, toplanan lavajlar derhal taze anaerobik kültür ortamına (indirgeyici madde ile) seyreltilebilir. Benzer şekilde, organ homojenizasyonu, bakteriyel canlılığı artırmak için PBS yerine taze kültür ortamında yapılabilir ve ayrıca oksijen maruziyetini en aza indirmek için anaerobik odanın kendisinde de yapılabilir.

Belirli bir deneyin amacına bağlı olarak, deneyci kontrol gruplarına dikkat etmelidir. Hipotezleri test etmek için, sadece araçla alay edilen enfekte olmamış kontrol farelerinin temel ölçümleri, kemokinlerin / sitokinlerin indüksiyonunun veya enfeksiyonun diğer spesifik sonuçlarının olup olmadığını belirlemeye yardımcı olacaktır. Kullanılan kontrol aracı, aşılama için kullanılan araçla aynı olmalıdır, bu nedenle bakteriler kültür ortamında aşılanmışsa, aşılanmamış kültür ortamı kontrol olarak kullanılmalıdır (Ek Dosya 1, adım 2.4.5.).

Bu protokolde açıklanan yöntemler, anaerobik olarak büyüyebilen ancak geleneksel olarak aerobik kültür koşulları ( Escherichia coli veya Grup B Streptococcus gibi) kullanılarak incelenen fakültatif bakterilere de uygulanabilir. Bu, özellikle serviks gibi düşük oksijen seviyeleri içerdiğine inanılan vücut bölgelerindeki bu organizmaların enfeksiyonları için geçerli olabilir. Fakültatif bir organizmanın, inokülum aerobik olarak aerobik olarak aerobik olarak hazırlandığında bölgeleri daha az oksijenle daha başarılı bir şekilde enfekte etmesi olabilir. Böyle bir deneyde, CFU sayımı için canlı bakterilerin geri kazanımı anaerobik koşullar gerektirmeyebilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
β-estradiol 17-valerate	Sigma	E1631	estrogenization of mice
0.22 µm, 50 mL Steriflip vacuum filter	Fisher	SCGP00525	sterile filtering sesame oil
14 mL tube	Falcon	352059	estrogenization of mice
190-proof ethanol	Koptec	V1105M	dissection, tissue homogenization, CDC and Columbia media
1x PBS	Fisher	MT21040CM	vaginal lavage, G. vaginlalis inoculum prep, tissue collection and homogenization
25 G × 5/8 -in needle	BD	305122	estrogenization of mice
5 mL tube	Falcon	352063	Tissue collection and homogenization
Anaerobic chamber	Coy	7200000	Growth of anaerobic bacteria
Bacto agar	Fisher	DF0140074	G. vaginalis, F. nucleatum, and P. bivia agar plates
Bacto peptone	Fisher	DF0118170	CDC anaerobic media for P. bivia growth
Columbia broth	Fisher	DF0944170	Columbia media for F. nucleatum growth
Defibrinated sheep blood	Hemostat	DSB500	CDC anaerobic media for P. bivia growth
Forceps	Fine Science Tools	11008-13	mouse/tissue dissection
Glucose	Sigma	G7528	NYCIII media for G. vaginalis growth
Handheld homogenizer	ISC Bio	3305500	Tissue homogenization
Hemin	Sigma	51280	CDC anaerobic media for P. bivia growth, Columbia media for F. nucleatum growth
HEPES	Cellgro	25-060-Cl	NYCIII media for G. vaginalis growth
Horse serum	Hemostat	SHS500	NYCIII media for G. vaginalis growth
Hydrogen gas mix (5% hydrogen, 10% CO2, 85% nitrogen)	Matheson		Gas for anaerobic chamber
Isofluorane	VetOne	502017	mouse anaethesia at sacrifice
L-cysteine	Sigma	C1276	CDC anaerobic media for P. bivia growth
L-glutamate	Sigma	G1626	CDC anaerobic media for P. bivia growth
Milli-Q Water Purifier	Millipore	IQ-7000	for making media and homogenization
NaCl	Sigma	S3014	NYCIII media for G. vaginalis growth
NaOH tablets	Sigma	S5881	CDC anaerobic media for P. bivia growth
Nitrogen gas	Airgas		Gas for anaerobic chamber
p-200 filter tips	ISC Bio	P-1237-200	vaginal lavages and bacterial inoculations
pancreatic digest of casein	Sigma	70169	CDC anaerobic media for P. bivia growth
Proteose peptone #3	Fisher	DF-122-17-4	NYCIII media for G. vaginalis growth
Scissors	Fine Science Tools	14084-08	mouse/tissue dissection
Sesame oil	Fisher	ICN15662191	estrogenization of mice
Single edge surgical carbon steel razor blades	VWR	55411-050	tissue dissection
Sodium chloride	Sigma	S3014	CDC anaerobic media for P. bivia growth
Spectrophotometer	BioChrom	80-3000-45	measuring bacterial OD600
Streptomycin	Gibco	11860038	add to agar media to make selective plates
Tuberculin slip tip 1ml syringe	BD	309659	estrogenization of mice
Vitaim K3	Sigma	M5625	Columbia media for F. nucleatum growth
Vitamin K1	Sigma	95271	CDC anaerobic media for P. bivia growth
Yeast extract	Fisher	DF0127-17-9	NYCIII media for G. vaginalis growth