Modelos de colonização vaginal murina por bactérias cultivadas anaerobicamente

Resumo

O protocolo apresenta um modelo de rato de colonização vaginal com bactérias vaginais humanas cultivadas anaerobicamente. Nós nos concentramos em Gardnerella vaginalis, enquanto incluímos sugestões para Prevotella bivia e Fusobacterium nucleatum. Este protocolo também pode ser usado como um guia para inoculações vaginais e recuperação viável de outras bactérias cultivadas anaerobicamente.

Resumo

A vagina dos mamíferos pode ser colonizada por muitos táxons bacterianos. O microbioma vaginal humano é frequentemente dominado por espécies de Lactobacillus , mas uma em cada quatro mulheres experimenta vaginose bacteriana, na qual um baixo nível de lactobacilos é acompanhado por um crescimento excessivo de diversas bactérias anaeróbicas. Esta condição tem sido associada a muitas complicações de saúde, incluindo riscos para a saúde reprodutiva e sexual. Embora haja evidências crescentes mostrando a natureza complexa das interações microbianas na saúde vaginal humana, os papéis individuais dessas diferentes bactérias anaeróbicas não são totalmente compreendidos. Isso é complicado pela falta de modelos adequados para estudar bactérias vaginais cultivadas anaerobicamente. Modelos de camundongos nos permitem investigar a biologia e a virulência desses organismos in vivo. Outros modelos de camundongos de inoculação bacteriana vaginal foram previamente descritos. Aqui, descrevemos métodos para a inoculação de bactérias cultivadas anaerobicamente e sua recuperação viável em camundongos C57Bl/6 criados convencionalmente. Um novo método processual menos estressante para inoculação e lavagem vaginal também é descrito. A inoculação e a recuperação viável de Gardnerella são descritas em detalhes, e estratégias para anaeróbios adicionais, como Prevotella bivia e Fusobacterium nucleatum são discutidas.

Introdução

Nos mamíferos, a vagina é o lar de um consórcio de espécies bacterianas. O microbioma vaginal humano é único entre os mamíferos em sua abundância de membros do gênero Lactobacillus e correspondente baixo pH vaginal (3,8-4,5)1,2,3,4. Ruptura desta dominância de Lactobacillus está associada a uma variedade de resultados negativos para a saúde.

Na vaginose bacteriana (VB) há menos lactobacilos e maior abundância de diversas bactérias anaeróbias, como Gardnerella vaginalis e Prevotella bivia ^5,6. Mulheres com VB apresentam risco aumentado de infecções sexualmente transmissíveis ^7,8,9, infertilidade 10, perdas gestacionais 11, parto prematuro 12,13,14, infecções intrauterinas 15, infecções cervicais 16 e câncer^16,17,18 . A VB também está associada a uma maior probabilidade de colonização vaginal por bactérias potencialmente patogênicas, como Fusobacterium nucleatum 1,19,20^, um isolado comum de infecções por líquido amniótico ²¹.

Devido à importância das bactérias anaeróbias na saúde vaginal humana, há necessidade de modelos animais que possam ser usados para investigar a biologia e a patogênese desses organismos. Aqui, descrevemos métodos para inoculação vaginal e recuperação viável de Gardnerella vaginalis em camundongos estrogênicos e sugerimos estratégias adicionais para Prevotella bivia e Fusobacterium nucleatum. Outros modelos de colonização vaginal murina já foram descritos anteriormente, mas estes se concentraram na inoculação e recuperação de bactérias anaeróbias facultativas, como Streptococcus²² do Grupo B e Neisseria gonorrhoeae²³ , que foram cultivadas aerobicamente. A inoculação e a recuperação de anaeróbios obrigatórios podem ser realizadas com sucesso com estratégias experimentais apropriadas. Discutimos abordagens para a recuperação viável de vários táxons bacterianos e sugerimos avaliação empírica das condições para a viabilidade de espécies/cepas adicionais de interesse.

O método clássico de estimar a colonização por bactérias vivas é a recuperação de unidades formadoras de colônias (UFCs). Em camundongos criados convencionalmente com sua própria microbiota endógena, isso requer recuperação em meio de ágar que seleciona contra membros da microbiota vaginal endógena, enquanto ainda permite que a cepa inoculada de bactérias cresça. Aqui, usamos um isolado resistente à estreptomicina de G. vaginalis²⁴ que pode ser recuperado seletivamente em um meio de ágar contendo estreptomicina. Para garantir que o meio seja suficientemente seletivo e, inversamente, que as bactérias resistentes à estreptomicina não estejam presentes no microbioma endógeno, as lavagens vaginais coletadas imediatamente antes da inoculação devem ser banhadas em ágar seletivo (contendo estreptomicina).

O melhor método para a preparação de inóculo pode variar entre espécies e cepas de bactérias. Antes do início dos experimentos em camundongos, trabalhos preliminares devem ser realizados para determinar condições preferíveis para o meio de cultura, o desfecho de crescimento e a preparação do inóculo, bem como a suscetibilidade ao oxigênio e a viabilidade no PBS. No caso de bactérias mais sensíveis ao oxigênio, preparações alternativas do inóculo podem ser consideradas (por exemplo, em meio de cultura anaeróbia com grupo controle de veículo apropriado)^25,26.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram aprovados e conduzidos de acordo com as diretrizes institucionais e o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório da Universidade da Califórnia em San Diego (UCSD, Número de Protocolo: S20057, 2020-em diante) e antes disso na Washington University, St. Louis (Protocolo 20110149, até 2020).

NOTA: O protocolo abaixo utiliza fêmeas C57Bl/ criadas convencionalmente em camundongos, com idade entre 6 e 11 semanas no momento da inoculação. Observe as informações do fornecedor e as faixas etárias específicas usadas anteriormente no trabalho citado relevante.

1. Preparação e administração de β-estradiol 17-valerato

NOTA: β-estradiol 17-valerato é um carcinógeno e uma toxina reprodutiva que pode ser absorvida através da pele^27,28. Use EPI adequado durante o manuseio de pó e solução líquida. É também uma toxina aquática²⁹; elimine-o adequadamente num recipiente devidamente selado e rotulado.

1. O filtro esteriliza até 50 mL de óleo de gergelim através de um filtro de 0,22 μm usando um sistema de filtro de vácuo de tubo cônico de 50 mL. Aberto apenas em um armário de biossegurança para manter a esterilidade.
2. Calcule o volume de solução de valerato de β-estradiol necessário para o experimento: 200 μL por camundongo mais 2-3 mL extras para explicar a perda da amostra durante o enchimento da seringa (por exemplo, um experimento com 10 camundongos requer 4 mL no total). Calcule a quantidade de valerato de β-estradiol necessária para fazer uma solução de 5 mg/mL e pese-a diretamente em um tubo de fundo redondo de 14 mL.
3. Tampar o tubo de 14 mL firmemente e vórtice para quebrar aglomerados no pó (isso permitirá que o valerato de β-estradiol se dissolva mais rapidamente). Adicione óleo de gergelim filtrado estéril ao tubo de 14 mL para que a concentração final de valerato de β-estradiol seja de 5 mg/mL.
4. Coloque o tubo de 14 ml bem tampado num rotador a 37 °C durante 30-40 min, até que o pó sólido se dissolva completamente. Confirmar visualmente a homogeneidade da solução antes da injeção nos ratinhos. A incubação a 37 °C diminui a viscosidade do óleo de gergelim, facilitando a injeção.
5. Extraia a solução de valerato de β-estradiol numa seringa de 1 ml (sem agulha). Para fazer isso sem introduzir bolhas, primeiro, retire um pouco da solução, depois expulse suavemente, mantendo a ponta da seringa no óleo de gergelim. Voltar a retirar a solução lentamente, ligeiramente após a marca de 100 μL.
6. Coloque uma agulha de 25 G x 5/8 na seringa. Em seguida, prepare a agulha expelindo lentamente a solução de óleo de gergelim até que ela comece a sair da ponta da agulha. Expulsar a solução até que a seringa atinja a marca de 100 μL. Prepare uma seringa por rato.
7. Administrar o β-estradiol 17-valerato por injeção intraperitoneal a 48 h ou 72 h antes da inoculação. Injetar em cada rato 100 μL da solução de valerato de β-estradiol a 5 mg/ml (0,5 mg β-estradiol valerato/rato), conforme descrito anteriormente^22,30. Conservar a solução restante a 4 °C durante 72 h até à injeção seguinte.
8. Administrar a solução de valerato de β-estradiol novamente no dia da inoculação, imediatamente antes da inoculação vaginal dos camundongos. Retirar a solução de 4 °C e colocá-la num rotador a 37 °C durante 30 minutos antes da injecção, a fim de permitir que o óleo de sésamo aqueça e se torne menos viscoso. Prossiga com as injeções conforme descrito no passo 1.7.

2. Preparação do inóculo

NOTA: Esta seção contém as etapas gerais para a preparação de inóculos de Gardnerella vaginalis resistente à estreptomicina cultivada anaerobicamente JCP8151B-SmR 24,25,31,32. Todas as etapas desta seção devem ser feitas em uma câmara anaeróbica.

1. Recicle quaisquer reagentes, incluindo caldo, ágar e PBS NYC III preparados, em uma câmara anaeróbia para se equilibrar pelo menos 24 horas antes do uso.
   NOTA: Aqui, uma câmara anaeróbia de vinil equilibrada com mistura de gás hidrogênio a 5% foi usada. A concentração interna de oxigênio normalmente repousa em 0 ppm, embora possa haver aumentos transitórios de baixo nível (10-25 ppm) ao ciclar materiais para a câmara.
2. Dois dias antes da inoculação vaginal, risque Gardnerella de um estoque de glicerol congelado em uma placa de ágar NYC III na câmara anaeróbica. Use um recipiente pequeno (como uma caixa de ponta de pipeta vazia) cheio de gelo seco para manter o estoque de glicerol congelado durante o transporte dentro e fora da câmara.
3. 1 dia antes da inoculação vaginal, use 5-10 colônias individuais de Gardnerella da placa para inocular 10 mL de caldo NYC III. Deixar a cultura líquida crescer durante a noite durante 16 h a 37 °C. Incluir uma segunda alíquota de 1 mL do meio de cultura que não é inoculado e incubá-lo ao lado da cultura inoculada para confirmar que o meio não está contaminado.
4. Preparar o inóculo a partir de cultura líquida conforme descrito abaixo. Realize a preparação do inóculo na câmara anaeróbica, tanto quanto possível.
   1. Determinar a densidade óptica de cultura (OD) adicionando 200 μL de cultura a 800 μL de meio fresco em uma cubeta de 1,5 mL (diluição 1:5). Use um espectrofotômetro para medir a densidade (OD) da cultura diluída a um comprimento de onda de 600 nm (use uma cubeta separada com meios frescos sozinhos como o espaço em branco). Multiplique a leitura do OD por 5 para obter o OD₆₀₀ real da cultura de 16 h.
   2. Calcular o volume de inóculo necessário para o experimento. Por exemplo, para infectar 15 camundongos com um inóculo de 20 μL por rato, são necessários 15 x 20 μL = 300 μL de inóculo. Prepare aproximadamente 25% mais inóculo do que o necessário, portanto, para 15 camundongos, prepare 300 μL + (0,25 x 300 μL) = 375 μL de inóculo.
   3. Usando o OD₆₀₀ determinado na etapa 2.4.1., calcule o volume da cultura de 16 horas que precisa ser girado para baixo e ressuspenso para obter um inóculo OD₆₀₀ = 5,0 no volume calculado na etapa 2.4.2. Por exemplo, se o OD₆₀₀ da cultura é de 1,5 e o volume de inóculo necessário é de 375 μL, então o volume de cultura a ser fiado é (375 μL x 5)/1,5 = 1250 μL.
   4. Pipetar o volume de cultura calculado no passo 2.4.3. em um tubo de microcentrífuga estéril. Pellet as bactérias por centrifugação a 16.000 x g por 1-3 min.
   5. Retirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em PBS anaeróbio no volume calculado na etapa 2.4.2. O inóculo estará agora em um OD₆₀₀ calculado de 5,0. Se aplicável, prepare também um tubo de PBS para servir como um controle de veículo para camundongos no grupo de controle não infectado.
5. Antes de remover o tubo de inóculo da câmara anaeróbia, prepare uma série de diluição em série de 1:10 a 1:10 x 10⁶ em PBS. A placa spot 5 replica cada diluição numa placa de ágar utilizando uma pipeta multicanal para determinar a UFC do inóculo. Esta é a UFC pré-inoculação.

3. Pré-lavagem vaginal e inoculação com Gardnerella

1. Prepare tubos de lavagem / lavagem vaginal na câmara anaeróbica (isso pode ser feito ao mesmo tempo que a preparação do inóculo na etapa 2.4.). Pipetar 70 μL de PBS anaeróbio estéril em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL marcados com números de camundongos. Prepare um tubo de lavagem por rato. Feche firmemente os tubos e retire-os da câmara anaeróbica.
2. Realizar uma lavagem vaginal em cada rato com PBS anaeróbio de 50 μL a partir dos tubos individuais preparados no passo 3.1. Essas lavagens vaginais são as lavagens pré-inoculação e podem ser usadas para medições e ensaios a jusante.
   1. Após a administração da segunda injeção de valerato de β-estradiol (passo 1.8), coloque cada rato em cima de uma gaiola ou de uma superfície dura e limpa que possa agarrar com as patas dianteiras. Segure suavemente a parte do meio da cauda e levante de modo que os quartos traseiros estejam ligeiramente elevados e a abertura vaginal seja exposta.
   2. Usando uma pipeta e uma ponta de filtro p-200, retire 50 μL de PBS do tubo de lavagem correspondente ao mouse apropriado. Insira suavemente a ponta da pipeta no lúmen vaginal ~2-3 mm e pipete o volume de 50 μL para dentro e para fora suavemente, 3x-4x.
   3. Transfira o material de lavagem coletado (~50 μL) de volta para o mesmo tubo de lavagem de onde veio, pipetando para cima e para baixo no tubo de lavagem que ainda contém os 20 μL restantes de PBS. Se houver muco excessivo e a ponta ficar entupida, use uma ponta p-200 limpa para coletar o material restante e colocá-lo no mesmo tubo de lavagem.
3. Administrar por via vaginal 20 μL da suspensão bacteriana concentrada ou do controlo do veículo na vagina de cada rato. Inocular cada rato imediatamente após a lavagem vaginal para esse rato (ou seja, realizar lavagem e inoculação em sequência para cada rato antes de passar para o próximo). Para simplificar esse processo, use duas pipetas p200 - uma ajustada para 50 μL para lavagens e a outra para 20 μL para inoculações.
   1. Restrinja o mouse conforme descrito na etapa 3.2.1. Usando uma ponta p-200, pipete 20 μL de suspensão bacteriana para a vagina. Para experiências de co-inoculação utilizando duas espécies/estirpes bacterianas diferentes, utilizar 10 μL de cada suspensão bacteriana e evitar misturar as duas estirpes antes da inoculação.
      NOTA: O volume total de inoculação não deve exceder 20 μL para evitar o transbordamento para fora da vagina.
   2. Continue a segurar a extremidade traseira de cada rato por 10-20 s para evitar que o volume administrado se acumule imediatamente no introito vaginal. Em seguida, coloque o rato numa nova gaiola/recipiente ou com companheiros de gaiola que já tenham sido inoculados.
   3. Repita a etapa 3.2. e passo 3.3. para cada mouse. Nunca coloque ratos de volta em uma gaiola com animais que ainda não foram inoculados. Isso evita a exposição inadvertida de camundongos a bactérias resistentes à estreptomicina antes da inoculação.
4. Depois que todos os ratos tiverem sido inoculados, ciclo o tubo de inóculo de volta para a câmara anaeróbica. Preparar e chapear outra diluição em série, conforme descrito na etapa 2.5. Esta é a UFC pós-inoculação. Comparar as UFCs das placas pós-inoculação e pré-inoculação para determinar se a viabilidade do inóculo diminuiu enquanto estava fora da câmara anaeróbia durante a inoculação dos animais.
5. Placa as lavagens vaginais coletadas na etapa 3.2. em ágar seletivo (neste caso, 1 mg/mL de estreptomicina). Incubar as placas por 1-2 dias em uma câmara anaeróbia a 37 °C e examinar o crescimento.
   NOTA: O crescimento indica que os membros endógenos do microbioma são resistentes ao marcador de seleção e podem, portanto, obscurecer a enumeração da UFC do organismo alvo.

4. Coleta de lavagens vaginais para determinar a colonização viável de Gardnerella

1. Colete as lavagens vaginais em pontos de tempo selecionados para analisar a colonização vaginal. Coletar conforme descrito na etapa 3.2.
2. Imediatamente após a coleta, ciclo as lavagens vaginais em uma câmara anaeróbica. Utilizar 10 μL de cada lavagem para efectuar a diluição em série e o chapeamento em ágar selectivo, conforme descrito no passo 2.5. Use as contagens de UFC como uma medida de colonização vaginal por Gardnerella (ou outro anaeróbio de interesse).

5. Sacrifício, dissecação e homogeneização tecidual

1. Prepare um tubo de 5 mL para cada órgão que está sendo coletado de cada rato (por exemplo, se a vagina, o colo do útero e o útero estiverem sendo coletados, prepare três tubos por rato). Encha cada tubo com PBS anaeróbio estéril 1x (ou outro meio de homogeneização) na câmara anaeróbia. Use 1 mL de PBS para tubos usados para coletar vaginas e cervices e 750 μL para tubos usados para coletar chifres uterinos.
2. Uma vez adicionado o PBS, pese cada tubo individual (este é o peso pré-coleta e será usado para determinar o peso total de cada tecido colhido). Se uma balança não estiver disponível na câmara anaeróbica, tampe firmemente os tubos e retire-os da câmara a ser pesada e, em seguida, pedale-os de volta.
   NOTA: A preparação do tubo e a coleta de peso podem ser feitas 1 dia antes do sacrifício, mas os tubos devem ser mantidos na câmara anaeróbica com tampas bem seladas para evitar a evaporação.
3. Preparar um conjunto de tubos de lavagem vaginal, conforme descrito no passo 3.1. para coletar a lavagem final no sacrifício. Além disso, prepare um copo de 50 mL de água deionizada (DI) e um segundo copo de 50 mL de etanol de 70% a 90% para usar para enxaguar e esterilizar instrumentos de dissecção de aço padrão durante o sacrifício.
4. Ciclo para fora os tubos de coleta de órgãos cheios de PBS da câmara anaeróbia. Mantenha os tubos bem fechados até que os tecidos estejam prontos para serem adicionados.
5. Sacrifique cada rato usando métodos aprovados pela IACUC. Efectuar a lavagem final conforme descrito nos passos 3.2.2. e 3.2.3. imediatamente antes do sacrifício ou imediatamente depois.
6. Iniciar a dissecção e a coleta de tecidos. Pulverize o abdômen e as costas de cada rato com etanol a 70%. Esterilize a tesoura em um copo de etanol, deixe-as secar e, em seguida, faça um único corte vertical na cavidade abdominopélvica do rato.
7. Use pinças estéreis para puxar a pele para trás e empurrar suavemente os intestinos para fora da cavidade do corpo e para o lado do campo aberto, o que irá expor o trato reprodutivo.
   NOTA: Tenha cuidado para não perfurar ou perfurar os intestinos, pois eles podem abrigar bactérias resistentes à estreptomicina que podem confundir os resultados experimentais.
8. Para coletar o tecido vaginal máximo, quebre o osso púbico durante a necropsia. Usando tesouras estéreis, prenda o centro do osso púbico (a sínfise púbica), tendo cuidado para não cortar a vagina. Usando dois conjuntos de pinça estéril, agarre cada lado da pélvis e puxe a pélvis aberta lateralmente, expondo a porção inferior da vagina por baixo.
9. Use fórceps para segurar suavemente o colo do útero (uma estrutura mais dura em comparação com o tecido circundante). Puxe suavemente o colo do útero para expor o cólon, escondido atrás e intimamente ligado à vagina.
10. Use uma pequena tesoura para liberar a vagina dos tecidos conjuntivos externos. Separe cuidadosamente a vagina do cólon e evite perfurar o trato intestinal. Quando totalmente liberado, flanqueie a vagina no introito com uma tesoura e corte para liberar do corpo do rato.
11. Mantenha um aperto suave no colo do útero enquanto puxa ligeiramente para cima para tornar os chifres uterinos mais visíveis. Com a outra mão, corte diretamente abaixo dos ovários nos lados direito e esquerdo para liberar os chifres uterinos. Remova o trato reprodutivo agora desconectado da cavidade do corpo e coloque-o em uma placa de Petri estéril.
12. Usando uma navalha, separe os chifres uterinos, colo do útero e vagina. Coloque cada tecido em seu respectivo tubo de coleta rotulado. Se as citocinas forem coletadas, coloque os tubos no gelo após a adição de tecido.
13. Pesar cada tubo novamente após a adição do tecido. Este é o peso pós-coleta. Subtraia o peso pré-coleta do peso pós-coleta para obter o peso total do tecido.
14. Use um homogeneizador portátil para homogeneizar os órgãos em seus tubos de coleta. Para Gardnerella JCP8151B, execute esta etapa no gabinete de biossegurança (aerobicamente) ou na câmara anaeróbica.
    1. Preparar vários conjuntos de tubos para lavagem e tratamento asséptico do homogeneizador portátil entre as amostras. Certifique-se de que cada conjunto tenha três tubos cônicos de 50 mL: um cheio com água DI, um com etanol a 70% e o terceiro com 1x PBS. Prepare um conjunto separado de tubos de lavagem para cada grupo de tratamento de rato.
    2. Para limpar o homogeneizador, abaixe as lâminas no líquido em cada tubo de lavagem e gire o instrumento para a velocidade máxima. Segure o homogeneizador em cada um dos três tubos por cerca de 3 s. A ordem de lavagem é DI água (para remover detritos físicos), depois etanol (para higienizar) e, finalmente, 1x PBS (para neutralizar). Agite a sonda em uma toalha de papel ou almofada de bancada descartável para remover o excesso de líquido entre cada enxágue.
    3. Após o enxágue inicial, homogeneize os tecidos abaixando a sonda homogeneizadora para o fundo do tubo de coleta, prendendo o tecido por baixo. Ligue o homogeneizador para moer o tecido, movendo suavemente a sonda para cima e para baixo cerca de 5x enquanto permanece submersa. Homogeneizar cada órgão por cerca de 15-30 s.
    4. Depois de desligar e remover o homogeneizador do tubo, inspecione visualmente o conteúdo para garantir a ruptura completa do tecido. Isso é especialmente importante para o colo do útero e a vagina, que às vezes não conseguem ser pegos pela sonda.
       NOTA: Não há problema se algum excesso de gordura nos chifres uterinos não homogeneizar completamente.
    5. Repita as etapas 5.14.1.-5.14.4., lavando e esterilizando a sonda entre cada amostra. Mude para um novo conjunto de tubos de lavagem para cada grupo experimental.
15. Mova os tubos com amostras homogeneizadas para a câmara anaeróbia. Para determinar a carga bacteriana de cada tecido, realize um breve vórtice suave da amostra para misturar e, em seguida, remova 100 μL de homogeneizado tecidual para diluição em série e chapeamento em ágar seletivo para determinação de UFC (a primeira diluição é de 1 x 10⁰). Se for necessário um limite inferior de detecção, efectue a espalhação de 200-250 μL de homogeneizado não diluído.

Resultados

Uma representação esquemática de um experimento de exemplo mostra algumas das maneiras pelas quais se pode realizar o protocolo descrito (Figura 1).

Alguns animais carregarão micróbios endógenos em seus microbiomas vaginais que crescerão em meios não seletivos. Os métodos aqui descritos baseiam-se em isolados resistentes à estreptomicina das cepas bacterianas estudadas, juntamente com meios seletivos contendo estreptomicina, para selecionar contra bactérias endógenas (Figura 2A,B). É possível que a resistência à estreptomicina se desenvolva espontaneamente, portanto, verificar camundongos antes da infecção (lavagens do dia 0) pode ajudar a estabelecer se isso pode ser um problema.

A recuperação de bactérias viáveis de lavagens vaginais é realizada por diluição em série e chapeamento em meios de ágar. Uma placa de Petri padrão pode conter até uma matriz de 6 x 6 de pontos de 5 μL, permitindo a enumeração de títulos bacterianos de seis pontos de réplica em seis ordens de magnitude para cada amostra se usar diluições seriais de 10 vezes (Figura 3A). Este método pode ser usado para enumerar títulos de bactérias que variam de Gardnerella a Prevotella e Fusobacterium (Figura 3B-D).

Juntos, esses métodos permitem testar hipóteses e fazer interpretações sobre a colonização/infecção bacteriana do trato reprodutivo feminino. Por exemplo, uma comparação de títulos de Gardnerella em lavagens vaginais e homogeneizados de tecido vaginal demonstrou concordância entre esses métodos (Figura 4A). Da mesma forma, em um modelo de co-inoculação vaginal, os títulos de Prevotella no tecido uterino foram significativamente maiores (aproximadamente 20 vezes) durante a co-infecção por Gardnerella em comparação com a monoinfecção por Prevotella (Figura 4B). Finalmente, cepas bacterianas do tipo selvagem versus mutantes podem ser comparadas nesses modelos para estabelecer os papéis desempenhados por genes específicos e seus produtos nos processos de colonização/infecção do trato reprodutivo. Por exemplo, uma cepa mutante de Fusobacterium sem a capacidade de transportar e consumir o carboidrato ácido siálico levou a níveis mais baixos de colonização por 3 dias após a inoculação (Figura 4C).

Figura 1: Esquema de um experimento de exemplo³³. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Crescimento de micróbios vaginais murinos endógenos em ágar seletivo versus não seletivo. Lavagens vaginais de cinco camundongos fêmeas C57Bl/6 (1-5) foram riscadas em duas placas diferentes de ágar NYC III e incubadas anaerobicamente. (A) A placa à esquerda não contém antibióticos e permite o crescimento de bactérias anaeróbias endógenas do trato vaginal murino. (B) A placa à direita contém 1 mg/mL de estreptomicina e seleciona contra o crescimento de bactérias endógenas. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Recuperação de UFCs viáveis de G. vaginalis, P. bivia e F. nucleatum a partir de lavagens vaginais. (A) UFCs de inóculo de G. vaginalis JCP8151B-SmR, revestido a réplica como uma série de diluição em ágar NYC III. (B-D) Recuperação de (B) G. vaginalis²⁴, (C) P. bivia²⁵ e (D) F. nucleatum²⁶ viáveis a partir das lavagens vaginais de animais monoinfectados. Para cada gráfico (B-D), os dados são combinados a partir de dois experimentos independentes, com 10-15 camundongos por experimento^24,25,26. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Análise adicional da colonização bacteriana anaeróbia em um modelo de inoculação vaginal murina. (A) Os títulos de G. vaginalis em lavagens vaginais correlacionam-se com os títulos de G. vaginalis recuperados de homogeneizados de tecido vaginal em 24 h e 72 h pós-inoculação (combinação de dois experimentos independentes, n = 10 cada. Significância determinada pelo teste de correlação de postos de Spearman)²⁴. (B) A coinfecção com G. vaginalis leva ao aumento dos títulos de P. bivia no tecido do corno uterino quando comparado a animais mono-infectados por P. bivia em 48 h pós-inoculação (combinação de dois experimentos independentes, cada um com 6-10 camundongos por grupo). Significância determinada pelo teste U de Mann-Whitney, **p = 0,0017)²⁵. (C) F. nucleatum mutante com transportador de ácido siálico interrompido (Ω SiaT) diminuiu os títulos em lavagens vaginais de camundongos monoinfectados em comparação com F. nucleatum do tipo selvagem às 72 h pós-inoculação (combinação de dois experimentos independentes, cada um com 10 camundongos por grupo. Significância determinada pelo teste U de Mann-Whitney, **p < 0,01)²⁶. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Arquivo Suplementar 1: Exemplos de métodos utilizados para diferentes bactérias vaginais cultivadas em condições anaeróbias. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

A maneira mais significativa pela qual o modelo aqui descrito difere dos modelos de inoculação vaginal publicados anteriormente é o uso de bactérias cultivadas anaerobicamente, que requerem considerações especiais para a preparação de inóculo viável e a recuperação de bactérias dos camundongos. As etapas específicas do protocolo acima podem variar ligeiramente dependendo da espécie/cepa de bactérias utilizadas, conforme sugerido no Arquivo Suplementar 1. Além disso, este manuscrito descreve um novo método processual para a administração de bactérias e lavagens vaginais que requer menos experiência por parte do investigador e menos contenção para os camundongos. Se o experimentador não se sentir confortável com a forma de contenção descrita na etapa 3.2. e na etapa 3.3., os camundongos podem, em vez disso, ser desgrenhados como descrito anteriormente³⁴ com ou sem anestesia de acordo com o desenho experimental e as diretrizes institucionais da IACUC.

Uma ressalva importante para o uso de bactérias cultivadas anaerobicamente em modelos murinos é que certas etapas (como qualquer envolvimento de animais vivos) devem ser feitas fora da câmara anaeróbica. Portanto, as etapas mais críticas neste protocolo são aquelas em que as bactérias de interesse serão expostas a um ambiente aeróbio, como durante a inoculação dos camundongos. A utilização de qualquer novo anaeróbio neste modelo exigirá uma investigação preliminar sobre a sua capacidade de manter a viabilidade após a exposição ao oxigénio (tal como a comparação das UFC pré e pós-inoculação, conforme descrito nos passos 2.5 e 3.4.). Dependendo do grau de oxigénio e da sensibilidade ao PBS do organismo, devem ser considerados diferentes métodos de preparação do inóculo (Dossier Suplementar 1, passo 2.4.5.). Para inoculações usando G. vaginalis JCP8151B, descobrimos que um único tubo de inóculo pode ser preparado em PBS e usado para infectar todos os camundongos. Se estiver a ser utilizada uma bactéria anaeróbia diferente que seja mais sensível ao oxigénio, o inóculo pode ser preparado em tubos separados para cada rato, de modo a que não seja necessária uma abertura/fecho repetido do tubo. Da mesma forma, se a espécie bacteriana de interesse é mais fastidiosa/menos capaz de sobreviver em PBS do que G. vaginalis, a inoculação pode ser preparada em meios de cultura. Se o meio utilizado contiver agentes redutores, como o meio anaeróbio CDC usado para cultivar Prevotella bivia (Arquivo Suplementar 1, etapa 2.1. e etapa 2.2.), as bactérias também terão maior proteção contra a exposição ao oxigênio.

Métodos alternativos de homogeneização também podem ser considerados, como o batimento de esferas^22,35, que é feito com a tampa do tubo fechada e pode, portanto^, introduzir menos oxigênio do que o homogeneizador portátil. Além disso, organismos mais sensíveis ao oxigênio podem exigir um tempo de equilíbrio mais longo para a mídia. Um indicador de oxigénio, como a resazurina, pode ser utilizado para verificar se as condições anaeróbias foram atingidas (passo 2.1.). Métodos alternativos, como frascos anaeróbios, podem afetar os resultados e devem ser examinados quanto à viabilidade bacteriana antes do uso.

A sensibilidade ao oxigênio e a fastidiosidade do organismo experimental também podem desempenhar um papel na recuperação bem-sucedida de bactérias viáveis do camundongo durante lavagens/homogeneização (Arquivo Suplementar 1, etapa 3.2. e etapa 5.1.). Para organismos altamente sensíveis, o tempo entre a lavagem sendo tomada e banhada pode levar a uma perda de viabilidade e causar uma estimativa artificialmente baixa de colonização vaginal bacteriana. Para mitigar esse efeito, as lavagens coletadas podem ser imediatamente diluídas em meios de cultura anaeróbicos frescos (com agente redutor). Da mesma forma, a homogeneização de órgãos pode ser feita em meios de cultura frescos em vez de PBS para aumentar a viabilidade bacteriana e também pode ser feita na própria câmara anaeróbia para minimizar a exposição ao oxigênio.

Dependendo do propósito de um determinado experimento, o experimentador deve prestar atenção aos grupos de controle. Para testar hipóteses, as medidas basais de camundongos controle não infectados que são tratados com veículo sozinho ajudarão a estabelecer se há indução de quimiocinas/citocinas ou outros resultados específicos de infecção. O veículo de controlo utilizado deve ser o mesmo que o veículo utilizado para a inoculação, pelo que, se as bactérias forem inoculadas em meios de cultura, deve ser utilizado como comando o meio de cultura não inoculado (dossier suplementar 1, passo 2.4.5.).

Os métodos descritos neste protocolo também poderiam ser aplicados a bactérias facultativas capazes de crescer anaerobicamente, mas que são tradicionalmente estudadas usando condições de cultura aeróbia (como Escherichia coli ou Streptococcus do Grupo B). Isso pode ser especialmente relevante para infecções por esses organismos em locais do corpo que se acredita conter baixos níveis de oxigênio, como o colo do útero. Pode ser que um organismo facultativo infecte com mais sucesso locais com menos oxigênio quando o inóculo é preparado anaerobicamente em comparação com a aeróbia. Em tal experimento, a recuperação de bactérias viáveis para a enumeração de UFC pode não exigir condições anaeróbias.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
β-estradiol 17-valerate	Sigma	E1631	estrogenization of mice
0.22 µm, 50 mL Steriflip vacuum filter	Fisher	SCGP00525	sterile filtering sesame oil
14 mL tube	Falcon	352059	estrogenization of mice
190-proof ethanol	Koptec	V1105M	dissection, tissue homogenization, CDC and Columbia media
1x PBS	Fisher	MT21040CM	vaginal lavage, G. vaginlalis inoculum prep, tissue collection and homogenization
25 G × 5/8 -in needle	BD	305122	estrogenization of mice
5 mL tube	Falcon	352063	Tissue collection and homogenization
Anaerobic chamber	Coy	7200000	Growth of anaerobic bacteria
Bacto agar	Fisher	DF0140074	G. vaginalis, F. nucleatum, and P. bivia agar plates
Bacto peptone	Fisher	DF0118170	CDC anaerobic media for P. bivia growth
Columbia broth	Fisher	DF0944170	Columbia media for F. nucleatum growth
Defibrinated sheep blood	Hemostat	DSB500	CDC anaerobic media for P. bivia growth
Forceps	Fine Science Tools	11008-13	mouse/tissue dissection
Glucose	Sigma	G7528	NYCIII media for G. vaginalis growth
Handheld homogenizer	ISC Bio	3305500	Tissue homogenization
Hemin	Sigma	51280	CDC anaerobic media for P. bivia growth, Columbia media for F. nucleatum growth
HEPES	Cellgro	25-060-Cl	NYCIII media for G. vaginalis growth
Horse serum	Hemostat	SHS500	NYCIII media for G. vaginalis growth
Hydrogen gas mix (5% hydrogen, 10% CO2, 85% nitrogen)	Matheson		Gas for anaerobic chamber
Isofluorane	VetOne	502017	mouse anaethesia at sacrifice
L-cysteine	Sigma	C1276	CDC anaerobic media for P. bivia growth
L-glutamate	Sigma	G1626	CDC anaerobic media for P. bivia growth
Milli-Q Water Purifier	Millipore	IQ-7000	for making media and homogenization
NaCl	Sigma	S3014	NYCIII media for G. vaginalis growth
NaOH tablets	Sigma	S5881	CDC anaerobic media for P. bivia growth
Nitrogen gas	Airgas		Gas for anaerobic chamber
p-200 filter tips	ISC Bio	P-1237-200	vaginal lavages and bacterial inoculations
pancreatic digest of casein	Sigma	70169	CDC anaerobic media for P. bivia growth
Proteose peptone #3	Fisher	DF-122-17-4	NYCIII media for G. vaginalis growth
Scissors	Fine Science Tools	14084-08	mouse/tissue dissection
Sesame oil	Fisher	ICN15662191	estrogenization of mice
Single edge surgical carbon steel razor blades	VWR	55411-050	tissue dissection
Sodium chloride	Sigma	S3014	CDC anaerobic media for P. bivia growth
Spectrophotometer	BioChrom	80-3000-45	measuring bacterial OD600
Streptomycin	Gibco	11860038	add to agar media to make selective plates
Tuberculin slip tip 1ml syringe	BD	309659	estrogenization of mice
Vitaim K3	Sigma	M5625	Columbia media for F. nucleatum growth
Vitamin K1	Sigma	95271	CDC anaerobic media for P. bivia growth
Yeast extract	Fisher	DF0127-17-9	NYCIII media for G. vaginalis growth