Enfeksiyöz Mononükleozlu Çocuklardan Periferik Kan Örneklerinde İmmün Hücre Alt Popülasyonlarının Ayrılması

Özet

Periferik kan mononükleer hücrelerinin (monositler, CD4 + T hücreleri, ^{CD8 +} T hücreleri, B hücreleri ve doğal öldürücü hücreler) tanımlanmış bağışıklık hücresi alt popülasyonlarını izole etmek ve analiz etmek için immünomanyetik boncukları ve floresan ile aktive edilmiş hücre sıralamasını birleştiren bir yöntem tanımladık. Bu yöntemi kullanarak, manyetik ve floresan olarak etiketlenmiş hücreler saflaştırılabilir ve analiz edilebilir.

Özet

Enfeksiyöz mononükleoz (IM), çoğunlukla primer Epstein-Barr virüsü (EBV) enfeksiyonu ile ilişkili akut bir sendromdur. Başlıca klinik semptomlar düzensiz ateş, lenfadenopati ve periferik kanda önemli ölçüde artmış lenfositlerdir. IM'nin patojenik mekanizması hala belirsizdir; bunun için etkili bir tedavi yöntemi yoktur, esas olarak semptomatik tedaviler mevcuttur. EBV immünobiyolojisindeki ana soru, enfekte bireylerin sadece küçük bir alt kümesinin neden ciddi klinik semptomlar gösterdiği ve hatta EBV ile ilişkili maligniteler geliştirdiği, çoğu bireyin virüsle yaşam boyu asemptomatik olduğudur.

B hücreleri ilk önce IM'ye dahil olurlar, çünkü EBV reseptörleri yüzeylerinde sunulur. Doğal öldürücü (NK) hücreler, EBV ile enfekte olmuş hücreleri öldürmek için önemli olan sitotoksik doğuştan gelen lenfositlerdir. CD4 + T hücrelerinin oranı azalırken, CD8 + T hücrelerinin oranı akut EBV enfeksiyonu sırasında dramatik olarak genişler ve CD8 ⁺ T hücrelerinin kalıcılığı IM'nin yaşam boyu kontrolü için önemlidir. Bu bağışıklık hücreleri IM'de önemli roller oynar ve işlevlerinin ayrı ayrı tanımlanması gerekir. Bu amaçla, monositler önce CD14 mikroboncukları, bir sütun ve manyetik bir ayırıcı kullanılarak IM bireylerinin periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC'ler) ayrılır.

Kalan PBMC'ler, CD4 ⁺ T hücrelerini, CD8 + T hücrelerini, B hücrelerini ve NK hücrelerini bir akış sitometresi kullanarak sıralamak için peridinin-klorofil-protein (PerCP) / Siyanin 5.5 anti-CD3, allofikokosyanin (APC) / Siyanin 7 anti-CD4, fikoeritrin (PE) anti-CD8^, floresan izotiyosiyanat (FITC) anti-CD19, APC anti-CD56 ve APC anti-CD16 antikorları ile boyanır. Ayrıca, IM'deki fonksiyonlarını ve patojenik mekanizmalarını araştırmak için beş alt popülasyonun transkriptom dizilimi yapıldı.

Giriş

İnsan herpes virüsü tip 4 olarak da bilinen bir γ-herpes virüsü olan Epstein-Barr virüsü (EBV), insan popülasyonunda her yerde bulunur ve yetişkin nüfusun% 90'ından fazlasında yaşam boyu gizli enfeksiyon oluşturur¹. EBV primer enfeksiyonunun çoğu çocukluk ve ergenlik döneminde ortaya çıkar, hastaların bir kısmı enfeksiyöz mononükleoz (IM)² ile kendini gösterir, kandaki CD8 ⁺ T hücreleri ile aktive olmuş bir immün yanıt ve orofarenks^3'te EBV ile enfekte B hücrelerinin geçici proliferasyonu dahil olmak üzere karakteristik immünopatoloji gösterir. IM'nin seyri 2-6 hafta sürebilir ve hastaların çoğunluğu^{iyileşir 4}. Bununla birlikte, bazı bireylerde kronik aktif EBV enfeksiyonu (CAEBV)⁵ olarak sınıflandırılan yüksek morbidite ve mortalite ile kalıcı veya tekrarlayan IM benzeri semptomlar gelişir. Ek olarak, EBV, nazofaringeal karsinom, Burkitt lenfoma, Hodgkin lenfoma (HL) ve T / NK hücreli lenfoma⁶ gibi epiteloid ve lenfoid maligniteler de dahil olmak üzere çeşitli malignitelerle yakından ilişkili olan önemli bir onkojenik virüstür. EBV 50 yılı aşkın süredir çalışılmasına rağmen, patogenezi ve lenfositlerin proliferasyonunu indüklediği mekanizma tam olarak aydınlatılamamıştır.

Birçok çalışmada transkriptom dizilimi ile EBV enfeksiyonunun immünopatolojisi için moleküler imzalar araştırılmıştır. Zhong ve ark., CD8 + T hücre genişlemesinin ağırlıklı olarak IM grubu^7'de bulunduğunu bulmak için IM veya CAEBV'li Çinli çocuklardan periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC'ler) tüm transkriptom profillemesini analiz ettiler ve CD8 ⁺ T hücrelerinin IM'de önemli bir rol oynayabileceğini düşündürdüler. Benzer şekilde, başka bir çalışmada, birincil EBV enfeksiyonunun neden olduğu IM'li hastalarda, hem EBV reaktivasyonunun hem de diğer ajanların neden olduğu IM'li hastalara göre daha düşük oranda EBV'ye özgü sitotoksik T ve ^{CD19 +} B hücrelerinin daha düşük oranları ve^{CD8 +} T hücrelerinin daha yüksek yüzdeleri bulunmuştur. B hücreleri ilk önce IM'ye dahil olurlar, çünkü EBV reseptörleri yüzeylerinde sunulur. Al Tabaa ve ark., IM⁹ sırasında B hücrelerinin poliklonal olarak aktive olduğunu ve intoplazmablastlar (CD19+, CD27+ ve CD20− ve CD138− hücreleri) ve plazma hücrelerinin (CD19+, CD27⁺ ve CD20⁻ ve CD138⁺) farklılaştığını bulmuşlardır. Ayrıca, Zhong ve ark. monosit belirteçleri CD14 ve CD64'ün CAEBV'de yukarı regüle olduğunu bulmuşlardır, bu da monositlerin antikora bağımlı hücresel sitotoksisite (ADCC) ve hiperaktif fagositoz⁷ yoluyla CAEBV'nin hücresel immün yanıtında önemli bir rol oynayabileceğini düşündürmektedir. Alka ve ark., dört IM veya HL hastasından CD56^dim CD16 ⁺ NK hücrelerini sıralayan MACS'nin transkriptomunu karakterize ettiler ve hem IM hem de HL'den NK hücrelerinin, NK hücrelerinin hipoyanıtlılığından sorumlu olabilecek doğuştan gelen bağışıklık ve kemokin sinyal genlerini aşağı regüle ettiğini bulmuşlardır¹⁰. Ek olarak, Greenough ve ark., IM'li bireylerin 10 PBMC'sinden sıralanmış CD8 ⁺ T hücrelerinin gen ekspresyonunu analiz ettiler. IM'deki CD8 ⁺ T hücrelerinin büyük bir kısmının virüse özgü, aktive edilmiş, bölünen ve efektör aktivitelerini uygulamak için astarlanmış olduğunu bildirmişlerdir¹¹. Hem T hücresi aracılı, EBV'ye özgü yanıtlar hem de NK hücre aracılı, spesifik olmayan yanıtlar primer EBV enfeksiyonu sırasında önemli roller oynamaktadır. Bununla birlikte, bu çalışmalar sadece immün hücrelerin çeşitli karışımının veya sadece belirli bir lenfosit alt popülasyonunun transkriptom sonuçlarını araştırmıştır; bu, aynı hastalık durumundaki IM'li çocuklarda farklı immün hücre alt popülasyonlarının moleküler özelliklerinin ve fonksiyonlarının kapsamlı bir şekilde karşılaştırılması için yeterli değildir.

Bu yazıda, PBMC'lerin (monositler, CD4 + T hücreleri, ^{CD8 +} T hücreleri, B hücreleri ve NK hücreleri) tanımlanmış immün hücre alt popülasyonlarını izole etmek ve analiz etmek için immünomanyetik boncukları ve floresan ile aktive edilmiş hücre sıralamayı (FACS) birleştiren bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntemi kullanarak, manyetik ve floresan olarak etiketlenmiş hücreler manyetik bir ayırıcı ve FACS kullanılarak saflaştırılabilir veya akış sitometrisi ile analiz edilebilir. RNA, transkriptom dizilimi için saflaştırılmış hücrelerden ekstrakte edilebilir. Bu yöntem, IM'li bireylerin aynı hastalık durumlarında farklı bağışıklık hücrelerinin karakterizasyonunu ve gen ekspresyonunu sağlayacak ve bu da EBV enfeksiyonunun immünopatolojisi hakkındaki anlayışımızı genişletecektir.

Protokol

IM'li hastalardan (n=3), sağlıklı EBV taşıyıcılarından (n=3) ve EBV ile enfekte olmayan çocuklardan (n=3) kan örnekleri alındı. Gönüllüler Pekin Çocuk Hastanesi, Capital Medical Üniversitesi'nden işe alındı ve tüm çalışmalar etik olarak onaylandı. Etik onay, Başkent Tıp Üniversitesi Pekin Çocuk Hastanesi Etik Kurulu tarafından alınmıştır (Onay Numarası: [2021]-E-056-Y). Hastaların bilgilendirilmiş onamından feragat edildi, çünkü çalışma sadece klinik testler için kalan örnekleri kullandı. Hasta gizliliğini korumak için tüm veriler tamamen kimliksizleştirildi ve anonimleştirildi.

1. PBMC'lerin periferik kandan izolasyonu

1. IM'li hastalardan standart venipunktur ile_K3EDTA tüplerine taze periferik kan (2 mL) toplayın.
   NOT: Hücre canlılığını korumak için işlemin hızlı olması gerekir.
2. Periferik kanı fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki kat hacme kadar seyreltin ve 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde insan lenfosit ayırma ortamının (yoğunluk: 1.077 ± 0.001 g / mL) üzerine yerleştirin.
   NOT: Kan, PBS ve ayırma ortamının hacim oranı 1: 1: 1 idi. Kanı yavaşça ayırma ortamına ekleyin ve kanın ayırma ortamına yerleşmesini önlemek için hemen santrifüj yapın.
3. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 800 × g'da santrifüj. Orta tabakayı (zenginleştirilmiş PBMC'ler) başka bir 15 mL santrifüj tüpüne aktarın.
   NOT: Santrifüjlemeden sonra, tüpün dibinde eritrositler, orta tabaka ayırma ortamı, üst tabaka plazma ve plazma tabakası ile ayırma sıvı tabakası arasında PBMC'ler (lenfositler ve monositler dahil) bulunur.
4. PBMC'leri 10 mL PBS ile yıkayın ve oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 800 × g'da santrifüj yapın; süpernatantı dikkatlice atın.
5. Yıkama ve santrifüjlemeyi tekrarlayın (adım 1.4) 2 x. PBMC'leri 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde 1 mL PBS ile yeniden askıya alın ve hücreleri tripan mavisi tabanlı, otomatik bir sayaçla sayın.

2. CD14 mikroboncukları kullanılarak CD14 ⁺ monositlerin PBMC'lerden izolasyonu

1. PBS'de (pH 7.2) %0.5 fetal sığır serumu (FBS) ve 2 mM EDTA içeren bir tampon çözeltisi hazırlayın. Tamponu soğuk tutun (2-8 °C).
   NOT: Hava kabarcıkları sütunu tıkayabileceğinden kullanmadan önce tamponun gazını çözün. Hücre yüzeyindeki antikorların kapanmasını ve spesifik olmayan hücre etiketlemesini önlemek için hücreleri soğuk tutun.
2. PBMC'leri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 × g'da santrifüj yapın. Süpernatantı dikkatlice atın. Hücreleri 80 μL tampon ile yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonuna 20 μL CD14 mikroboncuk ekleyin.
   NOT: ≤10⁷ PBMC varsa, yukarıda belirtilen birimi kullanın. >10⁷ PBMC varsa, tüm reaktif hacimlerini ve toplam hacmi orantılı olarak artırın.
3. CD14 mikroboncuklarını ve hücreleri 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünde iyice karıştırın ve 4 ° C'lik bir buzdolabında 15 dakika boyunca kuluçkaya yatırın. PBMC'leri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 × g'da 1 mL tampon ve santrifüj ile yıkayın. Süpernatantı tamamen atın. Hücreleri 500 μL tampon ile yeniden askıya alın.
   NOT: ≤10⁸ PBMC varsa, yukarıda belirtilen birimi kullanın. >10⁸ PBMC varsa, arabellek birimini orantılı olarak artırın.
4. Sütunlarla manyetik ayırma:
   1. Kolonu manyetik boncuk ayırıcıya yerleştirin ve sütunu 3 mL tamponla yıkayın. Hücre askıya alma özelliğini (adım 2.3'ten itibaren) sütuna ekleyin.
   2. Kolondan geçen etiketsiz hücreleri 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne toplayın ve sütunu 3 mL tamponla yıkayın. Kolonu 3 x 3 mL tamponla yıkayın. Toplam atık suyu 15 mL santrifüj tüpünde toplayın.
   3. Kolonu yeni bir 15 mL santrifüj tüpüne yerleştirin. Sütuna 5 mL arabellek ekleyin. Manyetik olarak etiketlenmiş hücreleri derhal 15 mL santrifüj tüpüne boşaltmak için pistonu sıkıca sütuna itin.
   4. Manyetik olarak etiketlenmiş hücreleri 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüj edin ve süpernatanı çıkarın. Sonraki transkriptom dizilemesinde kullanılmak üzere 500 μL PBS'deki hücreleri 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde yeniden askıya alın.

3. Floresan etiketli antikor boyama ve FACS ile lenfosit popülasyonlarının PBMC'lerden ayrılması

1. Etiketlenmemiş hücreleri (adım 2.4.2) 5 dakika boyunca 300 × g'de santrifüj edin ve süpernatanı çıkarın. 100 μL PBS'deki hücreleri 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde yeniden askıya alın.
2. 100 μL hücre süspansiyonuna her etiketli antikorun (CD3, CD4, CD8, CD16, CD19, CD56) 2 μL'sini ekleyin (antikorların hacimleri ve konjuge florofor bilgileri Tablo 1'de gösterilmiştir), 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin ve ışıktan koruyun.
3. 1 mL PBS ekleyerek ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüj yaparak hücreleri 2 x yıkayın. 1.5 mL mikrosantrifüj tüpünde 500 μL PBS'deki hücreleri yeniden askıya alın. Bir akış hücresi sıralayıcı sitometresinde veri elde etmeden önce hücre süspansiyonunu yavaşça vorteksleyin.

4. Akış sitometrisi parametre ayarı

1. Gerektiğinde 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerinde hücre süspansiyonunun 100 μL'sini (bkz. bölüm 1) alın ve negatif kontrol numunesi, CD3 tek boyama örneği, CD4 tek boyama örneği, CD8 tek boyama örneği, CD19 tek boyama örneği ve CD56/CD16 boyama örneği ayarlayın.
2. Hücre süspansiyonunun ve girdabının 100 μL'si başına karşılık gelen floresan etiketli antikorun 2 μL'sini ekleyin. Karanlıkta 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatın. 300 × g'da 5 dakika santrifüj yapın ve süpernatanı aspire edin. Peletleri 500 μL PBS ve vorteks ile yeniden askıya alın.
3. Sıralama akışını devreye alın ve floresan boncukları kullanarak damlacıkları aşağıdaki gibi geciktirin:
   1. Hücre sıralama sistemini açın, açma programını çalıştırın, 85 μm nozulu takın ve sıralama akışını açın. Sıralama voltajını 4.500 V'a ve Freq'i 47 V'a ayarlayın.
   2. Ana akış damlacık kesme noktasını ve damlacık gecikmesini üreticinin talimatlarına göre ayarlayarak parametreleri ayarlayın¹². İlk damlacık kesme noktası konumunu (Drop1) 275'e ve Breakoff penceresinde Gap'i 8'e ayarlayın. Sitometrinin akışı stabilize etmek için damlacık genlik değerini otomatik olarak belirlemesine izin vermek için Sweet Spot otomatik sıralama modunu açın.
   3. Floresan boncukları yükleyerek damlacık gecikmesini Yan Akış penceresinde 30,31'e ayarlayın ve boncukların başlangıç veya ince ayar modunda %>99'luk bir yan akış sapması elde etmesini sağlayın.
4. Geçitlemeyi aşağıdaki gibi gerçekleştirmek için Şekil 1'de gösterilen geçit stratejisine bakın:
   1. İleri saçılma alanı (FSC-A)/yan saçılma alanı (SSC-A) nokta grafiği kullanarak, bozulmamış lenfosit popülasyonunu tanımlamak için çokgen kapısını (P1) çizin.
   2. FSC-A/FSC yüksekliği (FSC-H) nokta grafiği kullanarak, tek hücreleri tanımlamak ve çiftleri dışlamak için çokgen kapısını (P2) çizin (Şekil 1A).
   3. CD19 FITC-A/CD3 PerCP-Cy5.5-A nokta grafiği kullanarak, CD3+ T hücrelerini ve CD19⁺ B hücrelerini seçmek için dikdörtgen geçidi (P3) çizin (Şekil 1A,B).
   4. CD4 APC-Cy7-A/CD8 PE-A nokta grafiği kullanarak, CD4 + T hücrelerini ve CD8 ⁺ T hücrelerini (sırasıyla bu belirteçler için yüksek floresanslı hücreler) seçmek için dikdörtgen bir kapı çizin.
   5. CD56/CD16 APC-A/SSC-A nokta grafiği kullanarak, CD56+/CD16⁺ NK hücrelerini seçmek için dikdörtgen bir kapı çizin (Şekil 1C).
5. Negatif kontrol örneğini kullanarak enstrümantal parametreleri ayarlayın:
   1. Negatif kontrol tüpünü yükleme portuna takın ve Edinme Kontrol Paneli'nde Yükle'ye tıklayın. Yazılımda Sitometre Ayarları'nı seçin.
   2. Denetçi penceresinde, Parametreler sekmesini tıklatın ve FSC, SSC ve farklı floresan boyaların voltajlarını ayarlayın; FSC: 231, SSC: 512, PE: 549, APC: 615, APC-Siyanin 7: 824, FITC: 555, PerCP-Siyanin 5.5: 663.
6. Tek lekeli numuneleri kullanarak kompanzasyonu ayarlayın¹³.
   1. Tek lekeli tüpleri sitometriye sırayla yükleyin ve yazılımda Sitometre Ayarları'nı seçin. Tazminatı ayarlamak için Ücret sekmesini tıklatın.
      NOT: Akış sitometrisinin kompanzasyon referansı Tablo 2'de gösterilmiştir.

5. Akış sitometrisi ile hücre sıralama ve veri toplama

1. Tüpü sitometreye yüklemeden önce hücreleri kısa bir süre için hücre süspansiyonunu (bölüm 1-3'e göre ayrılmış PBMC'ler) vorteksleyin. Kalan tüpleri buz üzerinde tutun.
2. Sıralanmış hücrelerin tüp duvarına yapışmasını önlemek için dört toplama akış tüpüne 200 μL FBS ekleyin ve sitometre toplama odasına yerleştirin.
3. CD3 + CD4 + T hücrelerini, CD3 + CD8 + T hücrelerini, CD3 − CD19 + B hücrelerini ve CD3 ⁻ CD56 ⁺ / CD16 ⁺ NK hücrelerini, dört akış tüpünde IM'li bir hastanın örneğinden ayrı olarak toplayın (Şekil 2A).
4. Ayrılan hücreleri 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüj yapın ve süpernatanı çıkarın. Transkriptom dizilimi için hücrelere 200 μL RNA izolasyon reaktifi ekleyin.
5. Örneklerin immün hücre alt popülasyonlarını sağlıklı EBV taşıyıcılarından ve EBV ile enfekte olmamış çocuklardan yukarıdaki adımlara göre ayırın (Şekil 2B, C).

Sonuçlar

Geçit stratejisinin referansı
Dört lenfosit alt popülasyonunu sıralamak için kullanılan geçit stratejisi Şekil 1'de gösterilmiştir. Kısaca, lenfositler, granüloziteye (SSC-A) karşı boyutu (FSC-A) gösteren bir nokta grafiği üzerinde seçilir (P1). Ardından, boyutu (FSC-A) ve ileri dağılımı (FSC-H) gösteren bir nokta grafiğinde tek hücreler (P2) seçilirken, çift hücreler hariç tutulur. CD3+ T hücreleri (P3) ve CD19⁺ B hü...

Tartışmalar

Bu protokol, periferik kan bağışıklık hücresi alt popülasyonlarını sıralamanın etkili bir yolunu temsil eder. Bu çalışmada IM'li hastalardan, sağlıklı EBV taşıyıcılarından ve EBV ile enfekte olmamış çocuklardan alınan venöz kan örnekleri araştırma amacı olarak seçilmiştir. IM hastalarının periferik kanını kullanan bu çalışma, esas olarak çok renkli akış sitometrisi yoluyla farklı hücre alt kümelerinin oranlarını analiz etmeye ve belirlemeye odaklanmaktadır. Transkriptom di...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
APC anti-human CD16	Biolegend	302012	Fluorescent antibody
APC anti-human CD56 (NCAM)	Biolegend	362504	Fluorescent antibody
APC/Cyanine7 anti-human CD4	Biolegend	344616	Fluorescent antibody
Automated cell counter	BIO RAD	TC20	Cell count
BD FACSAria fluorescence-activated flow cell sorter-cytometer (BD FACSAria II)	Becton, Dickinson and Company	644832	Cell sort
CD14 MicroBeads, human	Miltenyi Biotec	130-050-201	microbeads
Cell ctng slides	BIO RAD	1450016	Cell count
Centrifuge tubes	Falcon	35209715	15 mL centrifuge tube
EDTA (≥99%, BioPremium)	Beyotime	ST1303	EDTA
Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) anticoagulant tubes	Becton, Dickinson and Company	367862	EDTA anticoagulant tubes
FITC anti-human CD19	Biolegend	302206	Fluorescent antibody
Gibco Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	16000-044	Fetal Bovine Serum
High-speed centrifuge	Sigma	3K15	Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube
High-speed centrifuge	Eppendorf	5424R	Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube
Human lymphocyte separation medium	Dakewe	DKW-KLSH-0100	Ficoll-Paque
LS Separation columns	Miltenyi Biotec	130-042-401	Separation columns
Microcentrifuge tubes	Axygen	MCT-150-C	1.5 mL microcentrifuge tube
MidiMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-302	Magnetic bead separator
PE anti-human CD8	Biolegend	344706	Fluorescent antibody
PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD3	Biolegend	344808	Fluorescent antibody
Phosphate Buffered Saline (PBS)	BI	02-024-1ACS	PBS
Polystyrene round bottom tubes	Falcon	352235	5 mL tube for FACS flow cytometer
TRIzol reagent	Ambion	15596024	Lyse cells for RNA extraction
Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit	Beyotime	C0011	Trypan Blue Staining