Trennung von Immunzellsubpopulationen in peripheren Blutproben von Kindern mit infektiöser Mononukleose

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine Methode, die immunmagnetische Beads und fluoreszenzaktivierte Zellsortierung kombiniert, um definierte Immunzellsubpopulationen peripherer mononukleärer Blutzellen (Monozyten, CD4+ T-Zellen, CD8⁺ T-Zellen, B-Zellen und natürliche Killerzellen) zu isolieren und zu analysieren. Mit dieser Methode können magnetisch und fluoreszierend markierte Zellen gereinigt und analysiert werden.

Zusammenfassung

Die infektiöse Mononukleose (IM) ist ein akutes Syndrom, das meist mit einer primären Infektion mit dem Epstein-Barr-Virus (EBV) einhergeht. Die wichtigsten klinischen Symptome sind unregelmäßiges Fieber, Lymphadenopathie und signifikant erhöhte Lymphozyten im peripheren Blut. Der pathogene Mechanismus von IM ist noch unklar; Es gibt keine wirksame Behandlungsmethode dafür, da hauptsächlich symptomatische Therapien zur Verfügung stehen. Die Hauptfrage in der EBV-Immunbiologie ist, warum nur eine kleine Untergruppe infizierter Personen schwere klinische Symptome zeigt und sogar EBV-assoziierte Malignome entwickelt, während die meisten Personen für das Leben mit dem Virus asymptomatisch sind.

B-Zellen sind zuerst an IM beteiligt, da EBV-Rezeptoren auf ihrer Oberfläche präsentiert werden. Natürliche Killerzellen (NK) sind zytotoxische angeborene Lymphozyten, die für die Abtötung von EBV-infizierten Zellen wichtig sind. Der Anteil der CD4+ T-Zellen nimmt ab, während der Anteil der CD8+ T-Zellen während einer akuten EBV-Infektion dramatisch zunimmt, und die Persistenz von CD8⁺ T-Zellen ist wichtig für die lebenslange Kontrolle von IM. Diese Immunzellen spielen eine wichtige Rolle bei IM, und ihre Funktionen müssen separat identifiziert werden. Zu diesem Zweck werden Monozyten zuerst von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) von IM-Individuen mit CD14-Mikroperlen, einer Säule und einem Magnetabscheider getrennt.

Die restlichen PBMCs werden mit Peridinin-Chlorophyll-Protein (PerCP)/Cyanin 5.5 Anti-CD3, Allophycocyanin (APC)/Cyanin 7 Anti-CD4, Phycoerythrin (PE) Anti-CD8, Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) Anti-CD19, APC Anti-CD56 und APC Anti-CD16 Antikörpern gefärbt, um CD4+ T-Zellen, CD8⁺ T-Zellen, B-Zellen und NK-Zellen mit einem Durchflusszytometer zu sortieren. Darüber hinaus wurde eine Transkriptomsequenzierung von fünf Subpopulationen durchgeführt, um deren Funktionen und pathogene Mechanismen in IM zu untersuchen.

Einleitung

Das Epstein-Barr-Virus (EBV), ein γ-Herpesvirus, das auch als humanes Herpesvirus Typ 4 bekannt ist, ist in der menschlichen Bevölkerung allgegenwärtig und etabliert eine lebenslange latente Infektion bei mehr als 90% der erwachsenen Bevölkerung¹. Die meisten EBV-Primärinfektionen treten im Kindes- und Jugendalter auf, wobei sich ein Teil der Patienten mit infektiöser Mononukleose (IM)² manifestiert und eine charakteristische Immunpathologie aufweist, einschließlich einer aktivierten Immunantwort mit CD8⁺ T-Zellen im Blut und einer vorübergehenden Proliferation von EBV-infizierten B-Zellen im Oropharynx³. Der Verlauf der IM kann 2-6 Wochen dauern und die Mehrheit der Patienten erholt sich gut⁴. Einige Personen entwickeln jedoch persistierende oder wiederkehrende IM-ähnliche Symptome mit hoher Morbidität und Mortalität, die als chronisch aktive EBV-Infektion (CAEBV) eingestuft ^wird5. Darüber hinaus ist EBV ein wichtiges onkogenes Virus, das eng mit einer Vielzahl von Malignomen verwandt ist, darunter epithelioide und lymphatische Malignome wie Nasopharynxkarzinom, Burkitt-Lymphom, Hodgkin-Lymphom (HL) und T/NK-Zell-Lymphom⁶. Obwohl EBV seit über 50 Jahren untersucht wird, sind seine Pathogenese und der Mechanismus, durch den es die Proliferation von Lymphozyten induziert, nicht vollständig aufgeklärt.

Mehrere Studien haben die molekularen Signaturen für die Immunpathologie der EBV-Infektion durch Transkriptomsequenzierung untersucht. Zhong et al. analysierten das Whole-Transkriptom-Profiling von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) von chinesischen Kindern mit IM oder CAEBV, um festzustellen, dass CD8+ T-Zellexpansion überwiegend in der IM-Gruppe⁷ gefunden wurde, was darauf hindeutet, dass CD8⁺ T-Zellen eine wichtige Rolle bei IM spielen könnten. In ähnlicher Weise fand eine andere Studie niedrigere Anteile an EBV-spezifischen zytotoxischen T- und CD19+ B-Zellen und höhere Prozentsätze von CD8⁺ T-Zellen bei Patienten mit IM, die durch eine primäre EBV-Infektion verursacht wurden, als bei Patienten mit IM, die sowohl durch EBV-Reaktivierung als auch durch andere Wirkstoffe verursacht wurden⁸. B-Zellen sind zuerst an IM beteiligt, da EBV-Rezeptoren auf ihrer Oberfläche präsentiert werden. Al Tabaa et al. fanden heraus, dass B-Zellen während IM⁹ polyklonisch aktiviert und in Plasmablasten (CD19+, CD27+ und CD20− sowie CD138⁻-Zellen) und Plasmazellen (CD19+, CD27+ und CD20⁻ und CD138⁺) differenziert wurden. Darüber hinaus fanden Zhong et al. heraus, dass die Monozytenmarker CD14 und CD64 bei CAEBV hochreguliert waren, was darauf hindeutet, dass Monozyten eine wichtige Rolle bei der zellulären Immunantwort von CAEBV durch Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC) und hyperaktive Phagozytose spielen könnten⁷. Alka et al. charakterisierten das Transkriptom von MACS sortierten CD56^dim CD16⁺ NK-Zellen von vier Patienten von IM oder HL und fanden heraus, dass NK-Zellen sowohl aus IM als auch aus HL eine herunterregulierte angeborene Immunität und Chemokin-Signalgene aufwiesen, die für die Hyporeagibilität von NK-Zellen verantwortlich sein könnten¹⁰. Darüber hinaus analysierten Greenough et al. die Genexpression von sortierten CD8⁺ T-Zellen von 10 PBMCs von Personen mit IM. Sie berichteten, dass ein großer Teil der CD8⁺ T-Zellen in IM virusspezifisch war, aktiviert, sich teilte und darauf vorbereitet war, Effektoraktivitäten auszuüben¹¹. Sowohl T-Zell-vermittelte, EBV-spezifische Reaktionen als auch NK-Zell-vermittelte, unspezifische Reaktionen spielen eine wesentliche Rolle während der primären EBV-Infektion. Diese Studien untersuchten jedoch nur die Transkriptomergebnisse der vielfältigen Mischung von Immunzellen oder nur eine bestimmte Subpopulation von Lymphozyten, was für den umfassenden Vergleich der molekularen Eigenschaften und Funktionen verschiedener Immunzellsubpopulationen bei Kindern mit IM im gleichen Krankheitszustand nicht ausreicht.

Dieser Artikel beschreibt eine Methode, die immunmagnetische Beads und fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) kombiniert, um definierte Immunzellsubpopulationen von PBMCs (Monozyten, CD4+ T-Zellen, CD8⁺ T-Zellen, B-Zellen und NK-Zellen) zu isolieren und zu analysieren. Mit dieser Methode können magnetisch und fluoreszenzmarkierte Zellen mit einem Magnetabscheider und FACS gereinigt oder mittels Durchflusszytometrie analysiert werden. RNA kann aus den gereinigten Zellen für die Transkriptomsequenzierung extrahiert werden. Diese Methode wird die Charakterisierung und Genexpression verschiedener Immunzellen in den gleichen Krankheitszuständen von Personen mit IM ermöglichen, was unser Verständnis der Immunpathologie der EBV-Infektion erweitern wird.

Protokoll

Blutproben wurden von Patienten mit IM (n = 3), gesunden EBV-Trägern (n = 3) und EBV-nicht infizierten Kindern (n = 3) entnommen. Freiwillige wurden vom Beijing Children's Hospital der Capital Medical University rekrutiert und alle Studien wurden ethisch genehmigt. Die ethische Genehmigung wurde von der Ethikkommission des Beijing Children's Hospital, Capital Medical University, erhalten (Zulassungsnummer: [2021]-E-056-Y). Auf die Einwilligung der Patienten nach Aufklärung wurde verzichtet, da in der Studie nur die verbleibenden Proben für klinische Tests verwendet wurden. Alle Daten wurden vollständig anonymisiert, um die Privatsphäre der Patienten zu schützen.

1. Isolierung von PBMCs aus peripherem Blut

1. Sammeln Sie frisches peripheres Blut (2 ml) von Patienten mit IM in K₃EDTA-Röhrchen durch Standardvenenpunktion.
   HINWEIS: Der Prozess muss schnell sein, um die Zelllebensfähigkeit zu erhalten.
2. Verdünnen Sie peripheres Blut mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf ein zweifaches Volumen und schichten Sie es in einem 15-ml-Zentrifugenröhrchen auf das menschliche Lymphozyten-Trennmedium (Dichte: 1,077 ± 0,001 g / ml).
   HINWEIS: Das Volumenverhältnis von Blut, PBS und Trennmedium betrug 1:1:1. Geben Sie das Blut langsam in das Trennmedium und zentrifugieren Sie es sofort, um zu vermeiden, dass sich Blut im Trennmedium absetzt.
3. Bei 800 × g 20 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Übertragen Sie die mittlere Schicht (angereicherte PBMCs) in ein anderes 15-ml-Zentrifugenröhrchen.
   HINWEIS: Nach der Zentrifugation befinden sich am Boden des Röhrchens Erythrozyten, die mittlere Schicht ist das Trennmedium, die oberste Schicht ist Plasma und zwischen der Plasmaschicht und der Trennflüssigkeitsschicht befanden sich die PBMCs (einschließlich Lymphozyten und Monozyten).
4. Die PBMCs mit 10 ml PBS waschen und bei 800 × g 20 min bei Raumtemperatur zentrifugieren; Verwerfen Sie den Überstand vorsichtig.
5. Wiederholen Sie das Waschen und Zentrifugieren (Schritt 1.4) 2 x. Resuspendieren Sie die PBMCs mit 1 ml PBS in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und zählen Sie die Zellen mit einem Trypanblau-basierten, automatisierten Zähler.

2. Isolierung von CD14 ⁺ -Monozyten aus PBMCs mit CD14-Mikroperlen

1. Bereiten Sie eine Pufferlösung vor, die 0,5% fetales Rinderserum (FBS) und 2 mM EDTA in PBS (pH 7,2) enthält. Den Puffer kalt halten (2−8 °C).
   HINWEIS: Entgasen Sie den Puffer vor der Verwendung, da Luftblasen die Säule blockieren könnten. Halten Sie die Zellen kalt, um ein Verschließen der Antikörper auf der Zelloberfläche und eine unspezifische Zellmarkierung zu verhindern.
2. Zentrifugieren Sie die PBMCs bei 300 × g für 10 min bei Raumtemperatur. Verwerfen Sie den Überstand vorsichtig. Resuspendieren Sie die Zellen mit 80 μL des Puffers. 20 μL CD14-Mikrokügelchen in die Zellsuspension geben.
   HINWEIS: Wenn ≤10⁷ PBMCs vorhanden sind, verwenden Sie das oben angegebene Volume. Wenn >10⁷ PBMCs vorhanden sind, erhöhen Sie proportional alle Reagenzienvolumina und das Gesamtvolumen.
3. Mischen Sie die CD14-Mikrokügelchen und die Zellen gut in der 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhre und inkubieren Sie sie 15 Minuten in einem 4 °C-Kühlschrank. Die PBMCs mit 1 ml Puffer waschen und bei 300 × g 10 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand vollständig. Resuspendieren Sie die Zellen mit 500 μL des Puffers.
   HINWEIS: Wenn ≤10⁸ PBMCs vorhanden sind, verwenden Sie das oben angegebene Volume. Wenn >10⁸ PBMCs vorhanden sind, erhöhen Sie das Puffervolumen proportional.
4. Magnetische Trennung mit Säulen:
   1. Stellen Sie die Säule auf den magnetischen Perlenabscheider und waschen Sie die Säule mit 3 ml Puffer. Fügen Sie die Zellsuspension (aus Schritt 2.3) zur Spalte hinzu.
   2. Sammeln Sie die unbeschrifteten Zellen, die durch die Säule gehen, in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen und waschen Sie die Säule mit 3 ml Puffer. Waschen Sie die Säule mit 3 x 3 ml Puffer. Sammeln Sie das gesamte Abwasser in der 15-ml-Zentrifugenröhre.
   3. Legen Sie die Säule in ein neues 15-ml-Zentrifugenröhrchen. Fügen Sie der Spalte 5 ml Puffer hinzu. Drücken Sie den Kolben fest in die Säule, um die magnetisch markierten Zellen sofort in das 15-ml-Zentrifugenröhrchen auszuspülen.
   4. Zentrifugieren Sie die magnetisch markierten Zellen bei 300 × g für 5 min und entfernen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie die Zellen in 500 μL PBS in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen zur Verwendung in der nachfolgenden Transkriptomsequenzierung.

3. Trennung von Lymphozytenpopulationen aus PBMCs durch fluoreszenzmarkierte Antikörperfärbung und FACS

1. Die nicht markierten Zellen (Schritt 2.4.2) werden bei 300 × g 5 min lang zentrifugiert und der Überstand entfernt. Resuspendieren Sie die Zellen in 100 μL PBS in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
2. 2 μL jedes markierten Antikörpers (CD3, CD4, CD8, CD16, CD19, CD56) zu den 100 μL Zellsuspension geben (die Volumina und konjugierten Fluorophorinformationen der Antikörper sind in Tabelle 1 aufgeführt), 30 min auf Eis inkubieren und vor Licht schützen.
3. Waschen Sie die Zellen 2 x durch Zugabe von 1 ml PBS und Zentrifugieren bei 300 × g für 5 min bei Raumtemperatur. Resuspendieren Sie die Zellen in 500 μL PBS im 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Wirbeln Sie die Zellsuspension sanft an, bevor Sie Daten auf einem Durchflusszellensortierer-Zytometer erfassen.

4. Einstellung der Durchflusszytometrie-Parameter

1. Nehmen Sie 100 μL der Zellsuspension (siehe Abschnitt 1) nach Bedarf in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und stellen Sie eine Negativkontrollprobe, eine CD3-Einzelfärbeprobe, eine CD4-Einzelfärbeprobe, eine CD8-Einzelfärbeprobe, eine CD19-Einzelfärbeprobe und eine CD56/CD16-Färbeprobe ein.
2. Geben Sie 2 μL des entsprechenden fluoreszenzmarkierten Antikörpers pro 100 μL der Zellsuspension und des Wirbels hinzu. 30 min im Dunkeln auf Eis brüten. 5 min bei 300 × g zentrifugieren und den Überstand absaugen. Resuspendieren Sie die Pellets mit 500 μL PBS und Vortex.
3. Beauftragen Sie den Sortierstrom und verzögern Sie die Tröpfchen mit den fluoreszierenden Perlen wie folgt:
   1. Öffnen Sie das Zellsortiersystem, führen Sie das Einschaltprogramm aus, installieren Sie die 85-μm-Düse und öffnen Sie den Sortierstrom. Stellen Sie die Sortierspannung auf 4.500 V und die Freq auf 47 ein.
   2. Passen Sie die Parameter hauptsächlich an, indem Sie den Bruchpunkt des Hauptstromtropfens und die Tröpfchenverzögerung gemäß den Anweisungen des Herstellers^{einstellen 12}. Richten Sie die erste Droplet-Breakpoint-Position (Drop1) auf 275 und die Lücke auf 8 im Breakoff-Fenster ein. Aktivieren Sie den automatischen Sortiermodus Sweet Spot , damit die Zytometrie automatisch den Tröpfchenamplitudenwert bestimmen kann, um den Stream zu stabilisieren.
   3. Stellen Sie die Tröpfchenverzögerung im Seitenstromfenster auf 30,31 ein, indem Sie die fluoreszierenden Perlen laden, um sicherzustellen, dass die Perlen eine Seitenstromablenkung von >99% entweder im Anfangs- oder Feinabstimmungsmodus erreichen.
4. Beziehen Sie sich auf die in Abbildung 1 dargestellte Gating-Strategie, um das Gating wie folgt durchzuführen:
   1. Zeichnen Sie mithilfe eines Vorwärtsstreuflächen- (FSC-A)/Seitenstreuflächen-Punktdiagramms (SSC-A) das Polygongatter (P1), um die intakte Lymphozytenpopulation zu identifizieren.
   2. Zeichnen Sie mithilfe eines FSC-A/FSC-height (FSC-H)-Punktdiagramms das Polygongatter (P2), um die einzelnen Zellen zu identifizieren und Dubletten auszuschließen (Abbildung 1A).
   3. Zeichnen Sie mit einem CD19 FITC-A/CD3 PerCP-Cy5.5-A-Punktdiagramm das rechteckige Tor (P3), um CD3+ T-Zellen und CD19⁺ B-Zellen auszuwählen (Abbildung 1A,B).
   4. Zeichnen Sie mit einem CD4 APC-Cy7-A/CD8 PE-A-Punktdiagramm ein rechteckiges Tor, um CD4+ T-Zellen und CD8+ T-Zellen (Zellen mit einer hohen Fluoreszenz für diese Marker) auszuwählen.
   5. Zeichnen Sie mit einem CD56/CD16 APC-A/SSC-A-Punktdiagramm ein rechteckiges Tor, um CD56+/CD16⁺ NK-Zellen auszuwählen (Abbildung 1C).
5. Passen Sie die instrumentellen Parameter anhand der Negativkontrollprobe an:
   1. Installieren Sie das Negativkontrollrohr am Ladeanschluss und klicken Sie im Erfassungs-Dashboard auf Laden. Wählen Sie die Zytometereinstellungen in der Software.
   2. Klicken Sie im Informationsfenster auf die Registerkarte Parameter und passen Sie die Spannungen von FSC, SSC und verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen an. FSC: 231, SSC: 512, PE: 549, APC: 615, APC-Cyanin 7: 824, FITC: 555, PerCP-Cyanin 5.5: 663.
6. Passen Sie die Kompensation mit den einzeln gefärbten Proben^{an 13}.
   1. Laden Sie die einzeln gefärbten Röhrchen nacheinander auf das Zytometrie und wählen Sie Zytometereinstellungen in der Software. Klicken Sie auf die Registerkarte Vergütung, um die Vergütung anzupassen.
      HINWEIS: Die Kompensationsreferenz der Durchflusszytometrie ist in Tabelle 2 dargestellt.

5. Zellsortierung und Datenerhebung mittels Durchflusszytometrie

1. Vortex die Zellsuspension (getrennte PBMCs gemäß Abschnitte 1-3) kurz, um die Zellen zu resuspendieren, bevor das Röhrchen in das Zytometer geladen wird. Bewahren Sie die restlichen Röhrchen auf Eis auf.
2. Geben Sie 200 μL FBS in vier Sammelflussröhrchen, um ein Anhaften der sortierten Zellen an der Röhrchenwand zu vermeiden, und legen Sie sie in die Zytometer-Sammelkammer.
3. Sammeln Sie CD3+CD4+ T-Zellen, CD3⁺CD8+ T-Zellen, CD3⁻CD19+ B-Zellen und CD3⁻ CD56+/CD16⁺ NK-Zellen getrennt von der Probe eines Patienten mit IM in den vier Durchflussröhrchen (Abbildung 2A).
4. Zentrifugieren Sie die getrennten Zellen bei 300 × g für 5 min und entfernen Sie den Überstand. Fügen Sie den Zellen 200 μL RNA-Isolationsreagenz für die Transkriptomsequenzierung hinzu.
5. Trennen Sie die Immunzellsubpopulationen von Proben von gesunden EBV-Trägern und EBV-nicht infizierten Kindern gemäß den obigen Schritten (Abbildung 2B, C).

Ergebnisse

Referenz der Gating-Strategie
Die Gating-Strategie, die zur Sortierung der vier Lymphozyten-Subpopulationen verwendet wird, ist in Abbildung 1 dargestellt. Kurz gesagt, werden Lymphozyten (P1) in einem Punktdiagramm ausgewählt, das die Granulosität (SSC-A) im Vergleich zur Größe (FSC-A) zeigt. Dann werden einzelne Zellen (P2) in einem Punktdiagramm ausgewählt, das die Größe (FSC-A) im Vergleich zur Vorwärtsstreuung (FSC-H) zeigt, während Dublettenzellen ausgeschl...

Diskussion

Dieses Protokoll stellt eine effiziente Methode dar, um periphere Blutimmunzellsubpopulationen zu sortieren. In dieser Studie wurden venöse Blutproben von Patienten mit IM, gesunden EBV-Trägern und EBV-nicht infizierten Kindern als Forschungsziel ausgewählt. Diese Arbeit mit dem peripheren Blut von IM-Patienten konzentriert sich hauptsächlich auf die Analyse und Bestimmung der Anteile verschiedener Zelluntergruppen durch Mehrfarben-Durchflusszytometrie. Die Transkriptomsequenzierung wird hauptsächlich für den Nachw...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
APC anti-human CD16	Biolegend	302012	Fluorescent antibody
APC anti-human CD56 (NCAM)	Biolegend	362504	Fluorescent antibody
APC/Cyanine7 anti-human CD4	Biolegend	344616	Fluorescent antibody
Automated cell counter	BIO RAD	TC20	Cell count
BD FACSAria fluorescence-activated flow cell sorter-cytometer (BD FACSAria II)	Becton, Dickinson and Company	644832	Cell sort
CD14 MicroBeads, human	Miltenyi Biotec	130-050-201	microbeads
Cell ctng slides	BIO RAD	1450016	Cell count
Centrifuge tubes	Falcon	35209715	15 mL centrifuge tube
EDTA (≥99%, BioPremium)	Beyotime	ST1303	EDTA
Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) anticoagulant tubes	Becton, Dickinson and Company	367862	EDTA anticoagulant tubes
FITC anti-human CD19	Biolegend	302206	Fluorescent antibody
Gibco Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	16000-044	Fetal Bovine Serum
High-speed centrifuge	Sigma	3K15	Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube
High-speed centrifuge	Eppendorf	5424R	Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube
Human lymphocyte separation medium	Dakewe	DKW-KLSH-0100	Ficoll-Paque
LS Separation columns	Miltenyi Biotec	130-042-401	Separation columns
Microcentrifuge tubes	Axygen	MCT-150-C	1.5 mL microcentrifuge tube
MidiMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-302	Magnetic bead separator
PE anti-human CD8	Biolegend	344706	Fluorescent antibody
PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD3	Biolegend	344808	Fluorescent antibody
Phosphate Buffered Saline (PBS)	BI	02-024-1ACS	PBS
Polystyrene round bottom tubes	Falcon	352235	5 mL tube for FACS flow cytometer
TRIzol reagent	Ambion	15596024	Lyse cells for RNA extraction
Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit	Beyotime	C0011	Trypan Blue Staining