Separazione delle sottopopolazioni di cellule immunitarie nei campioni di sangue periferico da bambini con mononucleosi infettiva

Riepilogo

Descriviamo un metodo che combina sfere immunomagnetiche e selezione cellulare attivata dalla fluorescenza per isolare e analizzare sottopopolazioni definite di cellule mononucleate del sangue periferico (monociti, cellule T CD4 +, cellule T CD8 ⁺, cellule B e cellule natural killer). Utilizzando questo metodo, le cellule magnetiche e fluorescenti possono essere purificate e analizzate.

Abstract

La mononucleosi infettiva (IM) è una sindrome acuta per lo più associata all'infezione primaria da virus di Epstein-Barr (EBV). I principali sintomi clinici includono febbre irregolare, linfoadenopatia e linfociti significativamente aumentati nel sangue periferico. Il meccanismo patogenetico della IM non è ancora chiaro; Non esiste un metodo di trattamento efficace per questo, con terapie principalmente sintomatiche disponibili. La domanda principale nell'immunobiologia dell'EBV è perché solo un piccolo sottogruppo di individui infetti mostra gravi sintomi clinici e sviluppa persino tumori maligni associati a EBV, mentre la maggior parte degli individui è asintomatica per tutta la vita con il virus.

Le cellule B sono coinvolte per la prima volta nell'IM perché i recettori EBV sono presentati sulla loro superficie. Le cellule natural killer (NK) sono linfociti innati citotossici che sono importanti per uccidere le cellule infette da EBV. La proporzione di cellule T CD4+ diminuisce mentre quella delle cellule T CD8+ si espande drammaticamente durante l'infezione acuta da EBV e la persistenza delle cellule T CD8⁺ è importante per il controllo permanente della IM. Queste cellule immunitarie svolgono un ruolo importante nella IM e le loro funzioni devono essere identificate separatamente. A tale scopo, i monociti vengono separati prima dalle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) di individui IM utilizzando microsfere CD14, una colonna e un separatore magnetico.

Le restanti PBMC sono colorate con peridinina-clorofilla-proteina (PerCP)/cianina 5.5 anti-CD3, alloficocianina (APC)/cianina 7 anti-CD4, ficoeritrina (PE) anti-CD8, fluoresceina isotiocianato (FITC) anti-CD19, APC anti-CD56 e anticorpi APC anti-CD16 per ordinare le cellule T CD4 +, le cellule T CD8 ⁺, le cellule B e le cellule NK utilizzando un citometro a flusso. Inoltre, è stato eseguito il sequenziamento del trascrittoma di cinque sottopopolazioni per esplorare le loro funzioni e meccanismi patogenetici nella IM.

Introduzione

Il virus di Epstein-Barr (EBV), un γ-herpesvirus noto anche come herpes virus umano di tipo 4, è onnipresente nella popolazione umana e stabilisce un'infezione latente permanente in oltre il 90% della popolazione adulta¹. La maggior parte dell'infezione primaria da EBV si verifica durante l'infanzia e l'adolescenza, con una frazione di pazienti che manifesta mononucleosi infettiva (IM)², che mostra immunopatologia caratteristica, tra cui una risposta immunitaria attivata con cellule T CD8⁺ nel sangue e una proliferazione transitoria di cellule B infette da EBV nell'orofaringe³. Il decorso della IM può durare 2-6 settimane e la maggior parte dei pazienti guarisce ben⁴. Tuttavia, alcuni individui sviluppano sintomi IM-simili persistenti o ricorrenti con elevata morbilità e mortalità, che è classificata come infezione cronica attiva da EBV (CAEBV)⁵. Inoltre, l'EBV è un importante virus oncogeno, che è strettamente correlato a una varietà di tumori maligni, tra cui tumori maligni epitelioidi e linfoidi come il carcinoma nasofaringeo, il linfoma di Burkitt, il linfoma di Hodgkin (HL) e il linfoma a cellule T / NK⁶. Sebbene l'EBV sia stato studiato per oltre 50 anni, la sua patogenesi e il meccanismo con cui induce la proliferazione dei linfociti non sono stati completamente chiariti.

Diversi studi hanno studiato le firme molecolari per l'immunopatologia dell'infezione da EBV mediante sequenziamento del trascrittoma. Zhong et al. hanno analizzato il profilo dell'intero trascrittoma delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) di bambini cinesi con IM o CAEBV per scoprire che l'espansione delle cellule T CD8 + è stata trovata prevalentemente nel gruppo IM⁷, suggerendo che le cellule T CD8 ⁺ possono svolgere un ruolo importante nella IM. Allo stesso modo, un altro studio ha rilevato percentuali più basse di cellule T citotossiche e ^CD19+ B specifiche per EBV e percentuali più elevate di cellule T CD8⁺ nei pazienti con IM causata da infezione primaria da EBV rispetto ai pazienti con IM causata sia dalla riattivazione dell'EBV che da altri agenti⁸. Le cellule B sono coinvolte per la prima volta nell'IM perché i recettori EBV sono presentati sulla loro superficie. Al Tabaa et al. hanno scoperto che le cellule B erano attivate policlonalmente e differenziate in plasmablasti (cellule CD19+, CD27+ e CD20− e CD138−) e plasmacellule (CD19+, CD27+ e CD20⁻ e CD138⁺) durante IM⁹. Inoltre, Zhong et al. hanno scoperto che i marcatori monocitari CD14 e CD64 erano sovraregolati in CAEBV, suggerendo che i monociti possono svolgere un ruolo importante nella risposta immunitaria cellulare di CAEBV attraverso citotossicità cellulare anticorpo-dipendente (ADCC) e fagocitosi iperattiva⁷. Alka et al. hanno caratterizzato il trascrittoma delle cellule NK CD56 CD56 ^{CD16+ selezionate} da quattro pazienti di IM o HL e hanno scoperto che le cellule NK di IM e HL avevano una sottoregolazione dell'immunità innata e dei geni di segnalazione delle chemochine, che potrebbero essere responsabili dell'iporeattività delle cellule NK¹⁰. Inoltre, Greenough et al. hanno analizzato l'espressione genica delle cellule T CD8 ⁺ ordinate da 10 PBMC di individui con IM. Hanno riferito che una grande percentuale di cellule T CD8 ⁺ in IM erano specifiche del virus, attivate, divise e innescate per esercitare attività effettrici¹¹. Sia le risposte mediate dalle cellule T, specifiche per l'EBV, sia le risposte non specifiche mediate dalle cellule NK svolgono un ruolo essenziale durante l'infezione primaria da EBV. Tuttavia, questi studi hanno studiato solo i risultati del trascrittoma della diversa miscela di cellule immunitarie o solo una certa sottopopolazione di linfociti, il che non è sufficiente per il confronto completo delle caratteristiche molecolari e delle funzioni di diverse sottopopolazioni di cellule immunitarie nei bambini con IM allo stesso stato di malattia.

Questo articolo descrive un metodo che combina sfere immunomagnetiche e selezione cellulare attivata da fluorescenza (FACS) per isolare e analizzare sottopopolazioni definite di cellule immunitarie di PBMC (monociti, cellule T CD4 +, cellule T CD8 ⁺, cellule B e cellule NK). Utilizzando questo metodo, le cellule magnetiche e fluorescenti possono essere purificate utilizzando un separatore magnetico e FACS o analizzate mediante citometria a flusso. L'RNA può essere estratto dalle cellule purificate per il sequenziamento del trascrittoma. Questo metodo consentirà la caratterizzazione e l'espressione genica di diverse cellule immunitarie negli stessi stati di malattia di individui con IM, che amplierà la nostra comprensione dell'immunopatologia dell'infezione da EBV.

Protocollo

I campioni di sangue sono stati ottenuti da pazienti con IM (n = 3), portatori sani di EBV (n = 3) e bambini non infetti da EBV (n = 3). I volontari sono stati reclutati dall'ospedale pediatrico di Pechino, dalla Capital Medical University e tutti gli studi sono stati approvati eticamente. L'approvazione etica è stata ottenuta dal Comitato etico dell'ospedale pediatrico di Pechino, Capital Medical University (numero di approvazione: [2021]-E-056-Y). Il consenso informato dei pazienti è stato revocato in quanto lo studio ha utilizzato solo i campioni rimanenti per i test clinici. Tutti i dati sono stati completamente anonimizzati e resi anonimi per proteggere la privacy dei pazienti.

1. Isolamento delle PBMC dal sangue periferico

1. Raccogliere sangue periferico fresco (2 ml) da pazienti con IM in provette K₃EDTA mediante venipuntura standard.
   NOTA: Il processo deve essere rapido per mantenere la vitalità cellulare.
2. Diluire il sangue periferico a due volumi con soluzione salina tamponata fosfato (PBS) e sovrapporlo al mezzo di separazione dei linfociti umani (densità: 1,077 ± 0,001 g/ml) in una provetta da centrifuga da 15 ml.
   NOTA: Il rapporto volumetrico tra sangue, PBS e mezzo di separazione era 1:1:1. Aggiungere lentamente il sangue al mezzo di separazione e centrifugare immediatamente per evitare che il sangue si depositi nel mezzo di separazione.
3. Centrifugare a 800 × g per 20 minuti a temperatura ambiente. Trasferire lo strato intermedio (PBMC arricchiti) in un'altra provetta da centrifuga da 15 ml.
   NOTA: Dopo la centrifugazione, nella parte inferiore del tubo ci sono gli eritrociti, lo strato intermedio è il mezzo di separazione, lo strato superiore è il plasma e tra lo strato di plasma e lo strato liquido di separazione c'erano le PBMC (compresi i linfociti e i monociti).
4. Lavare le PBMC con 10 ml di PBS e centrifugare a 800 × g per 20 minuti a temperatura ambiente; Scartare il surnatante con attenzione.
5. Ripetere il lavaggio e la centrifugazione (punto 1.4) 2 x. Risospendere le PBMC con 1 mL di PBS in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL e contare le celle con un contatore automatico a base di tripano blu.

2. Isolamento di monociti CD14 ⁺ da PBMC utilizzando microsfere CD14

1. Preparare una soluzione tampone contenente siero bovino fetale allo 0,5% (FBS) e 2 mM di EDTA in PBS (pH 7,2). Mantenere il tampone freddo (2-8 °C).
   NOTA: degasare il buffer prima dell'uso poiché le bolle d'aria potrebbero bloccare la colonna. Mantenere le cellule fredde per prevenire la copertura degli anticorpi sulla superficie cellulare e l'etichettatura cellulare non specifica.
2. Centrifugare le PBMC a 300 × g per 10 minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante con attenzione. Risospendere le cellule con 80 μL di tampone. Aggiungere 20 μL di microsfere CD14 alla sospensione cellulare.
   NOTA: se sono presenti ≤10⁷ PBMC, utilizzare il volume sopra indicato. Se ci sono >10⁷ PBMC, aumentare proporzionalmente tutti i volumi di reagente e il volume totale.
3. Mescolare bene le microsfere CD14 e le cellule nel tubo di microcentrifuga da 1,5 mL e incubare per 15 minuti in frigorifero a 4 °C. Lavare le PBMC con 1 mL di tampone e centrifugare a 300 × g per 10 minuti a temperatura ambiente. Scartare completamente il surnatante Risospendere le celle con 500 μL di tampone.
   NOTA: se sono presenti ≤10⁸ PBMC, utilizzare il volume sopra indicato. Se sono presenti >10⁸ PBMC, aumentare proporzionalmente il volume del buffer.
4. Separazione magnetica con colonne:
   1. Posizionare la colonna sul separatore di sfere magnetiche e lavare la colonna con 3 ml di tampone. Aggiungere la sospensione della cella (dal passaggio 2.3) alla colonna.
   2. Raccogliere le cellule non etichettate che passano attraverso la colonna in una provetta da centrifuga da 15 ml e lavare la colonna con 3 ml di tampone. Lavare la colonna con 3 x 3 ml di tampone. Raccogliere l'effluente totale nella provetta da centrifuga da 15 ml.
   3. Posizionare la colonna in una nuova provetta da centrifuga da 15 ml. Aggiungere 5 mL di buffer alla colonna. Spingere saldamente lo stantuffo nella colonna per eliminare immediatamente le celle marcate magneticamente nel tubo della centrifuga da 15 ml.
   4. Centrifugare le cellule marcate magneticamente a 300 × g per 5 minuti e rimuovere il surnatante. Risospendere le cellule in 500 μL di PBS in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL per l'uso nel successivo sequenziamento del trascrittoma.

3. Separazione delle popolazioni di linfociti dalle PBMC mediante colorazione anticorpale marcata con fluorescenza e FACS

1. Centrifugare le cellule non marcate (punto 2.4.2) a 300 × g per 5 minuti e rimuovere il surnatante. Risospendere le cellule in 100 μL di PBS in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml.
2. Aggiungere 2 μL di ciascun anticorpo marcato (CD3, CD4, CD8, CD16, CD19, CD56) ai 100 μL di sospensione cellulare (i volumi e le informazioni sui fluorofori coniugati degli anticorpi sono mostrati nella Tabella 1), incubare su ghiaccio per 30 minuti e proteggere dalla luce.
3. Lavare le celle 2 volte aggiungendo 1 mL di PBS e centrifugando a 300 × g per 5 minuti a temperatura ambiente. Risospendere le cellule in 500 μL di PBS nella provetta da 1,5 mL di microcentrifuga. Vortice la sospensione cellulare delicatamente prima di acquisire i dati su un citometro a smistamento di cellule a flusso.

4. Impostazione dei parametri di citometria a flusso

1. Prelevare 100 μL della sospensione cellulare (vedere paragrafo 1) in provette da microcentrifuga da 1,5 mL come richiesto e impostare un campione di controllo negativo, un campione di colorazione singola CD3, un campione di colorazione singola CD4, un campione di colorazione singola CD8, un campione di colorazione singola CD19 e un campione di colorazione CD56/CD16.
2. Aggiungere 2 μL del corrispondente anticorpo marcato con fluorescenza per 100 μL della sospensione cellulare e del vortice. Incubare sul ghiaccio per 30 minuti al buio. Centrifugare per 5 min a 300 × g e aspirare il surnatante. Risospendere i pellet con 500 μL di PBS e vortice.
3. Commissionare il flusso di selezione e ritardare le goccioline utilizzando le sfere fluorescenti come segue:
   1. Aprire il sistema di smistamento delle celle, eseguire il programma di accensione, installare l'ugello da 85 μm e aprire il flusso di smistamento. Impostare la tensione di ordinamento su 4.500 V e la frequenza su 47.
   2. Regolare i parametri principalmente regolando il punto di rottura della goccia del flusso principale e il ritardo della goccia secondo le istruzioni del produttore¹². Impostate la prima posizione del punto di interruzione della goccia (Drop1) su 275 e la posizione dello spazio su 8 nella finestra di interruzione . Attivare la modalità di ordinamento automatico Sweet Spot per consentire alla citometria di determinare automaticamente il valore di ampiezza delle goccioline per stabilizzare il flusso.
   3. Regolate il ritardo delle gocce a 30,31 nella finestra Flusso laterale caricando le sfere fluorescenti, assicurandovi che le perle raggiungano una deflessione del flusso laterale del >99% in modalità iniziale o fine.
4. Fare riferimento alla strategia di gating illustrata nella Figura 1 per eseguire il gating come segue:
   1. Utilizzando un dot plot forward scatter-area (FSC-A)/area di dispersione laterale (SSC-A), disegnare il gate poligonale (P1) per identificare la popolazione di linfociti intatta .
   2. Utilizzando un dot plot FSC-A/FSC-height (FSC-H), disegnare la porta poligonale (P2) per identificare le singole celle ed escludere doppietti (Figura 1A).
   3. Utilizzando un diagramma a punti CD19 FITC-A/CD3 PerCP-Cy5.5-A, disegnare il gate rettangolare (P3) per selezionare le cellule T CD3+ e le cellule B CD19⁺ (Figura 1A,B).
   4. Utilizzando un diagramma a punti CD4 APC-Cy7-A/CD8 PE-A, disegnare un gate rettangolare per selezionare le cellule T CD4+ e le cellule T CD8⁺ (cellule con un'alta fluorescenza per questi marcatori, rispettivamente).
   5. Utilizzando un grafico a punti APC-A/SSC-A CD56/CD16, disegnare un gate rettangolare per selezionare le celle NK CD56+/CD16⁺ (Figura 1C).
5. Regolare i parametri strumentali utilizzando il campione di controllo negativo:
   1. Installare il tubo di controllo negativo sulla porta di carico e fare clic su Carica nel dashboard di acquisizione. Selezionare le impostazioni del citometro nel software.
   2. Nella finestra Impostazioni, fare clic sulla scheda Parametri e regolare le tensioni di FSC, SSC e diversi coloranti fluorescenti; FSC: 231, SSC: 512, PE: 549, APC: 615, APC-cianina 7: 824, FITC: 555, PerCP-cianina 5.5: 663.
6. Regolare la compensazione utilizzando i campioni monocolore¹³.
   1. Caricare i tubi monocolorati sulla citometria in sequenza e selezionare Impostazioni citometro nel software. Fai clic sulla scheda Retribuzione per modificare la retribuzione .
      NOTA: Il riferimento di compensazione della citometria a flusso è mostrato nella Tabella 2.

5. Selezione cellulare e raccolta di dati tramite citometria a flusso

1. Vortice la sospensione cellulare (PBMC separati secondo le sezioni 1-3) brevemente per risospendere le cellule prima di caricare il tubo nel citometro. Mantenere i tubi rimanenti sul ghiaccio.
2. Aggiungere 200 μL di FBS a quattro tubi di flusso di raccolta per evitare che le cellule selezionate si attacchino alla parete del tubo e posizionarle nella camera di raccolta del citometro.
3. Raccogliere le cellule T CD3+CD4+, le cellule T CD3⁺CD8+, le cellule B CD3⁻CD19+ e le cellule NK CD3⁻ CD56+/CD16⁺ separatamente dal campione di un paziente con IM nelle quattro provette a flusso (Figura 2A).
4. Centrifugare le cellule separate a 300 × g per 5 minuti e rimuovere il surnatante. Aggiungere 200 μL di reagente di isolamento dell'RNA alle cellule per il sequenziamento del trascrittoma.
5. Separare le sottopopolazioni di cellule immunitarie dei campioni dai portatori sani di EBV e dai bambini non infetti da EBV secondo i passaggi precedenti (Figura 2B, C).

Risultati

Riferimento della strategia di gating
La strategia di gating utilizzata per ordinare le quattro sottopopolazioni di linfociti è mostrata nella Figura 1. In breve, i linfociti sono selezionati (P1) su un dot plot che mostra la granulosità (SSC-A) rispetto alle dimensioni (FSC-A). Quindi, le singole celle vengono selezionate (P2) su un dot plot che mostra la dimensione (FSC-A) rispetto alla dispersione diretta (FSC-H), mentre le celle doppiette sono escluse. Le cellule T ...

Discussione

Questo protocollo rappresenta un modo efficace per ordinare le sottopopolazioni di cellule immunitarie del sangue periferico. In questo studio, campioni di sangue venoso di pazienti con IM, portatori sani di EBV e bambini non infetti da EBV sono stati selezionati come obiettivo della ricerca. Questo lavoro che utilizza il sangue periferico di pazienti di IM si concentra principalmente sull'analisi e la determinazione delle proporzioni di diversi sottogruppi cellulari attraverso la citometria a flusso multicolore. Il sequ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
APC anti-human CD16	Biolegend	302012	Fluorescent antibody
APC anti-human CD56 (NCAM)	Biolegend	362504	Fluorescent antibody
APC/Cyanine7 anti-human CD4	Biolegend	344616	Fluorescent antibody
Automated cell counter	BIO RAD	TC20	Cell count
BD FACSAria fluorescence-activated flow cell sorter-cytometer (BD FACSAria II)	Becton, Dickinson and Company	644832	Cell sort
CD14 MicroBeads, human	Miltenyi Biotec	130-050-201	microbeads
Cell ctng slides	BIO RAD	1450016	Cell count
Centrifuge tubes	Falcon	35209715	15 mL centrifuge tube
EDTA (≥99%, BioPremium)	Beyotime	ST1303	EDTA
Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) anticoagulant tubes	Becton, Dickinson and Company	367862	EDTA anticoagulant tubes
FITC anti-human CD19	Biolegend	302206	Fluorescent antibody
Gibco Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	16000-044	Fetal Bovine Serum
High-speed centrifuge	Sigma	3K15	Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube
High-speed centrifuge	Eppendorf	5424R	Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube
Human lymphocyte separation medium	Dakewe	DKW-KLSH-0100	Ficoll-Paque
LS Separation columns	Miltenyi Biotec	130-042-401	Separation columns
Microcentrifuge tubes	Axygen	MCT-150-C	1.5 mL microcentrifuge tube
MidiMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-302	Magnetic bead separator
PE anti-human CD8	Biolegend	344706	Fluorescent antibody
PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD3	Biolegend	344808	Fluorescent antibody
Phosphate Buffered Saline (PBS)	BI	02-024-1ACS	PBS
Polystyrene round bottom tubes	Falcon	352235	5 mL tube for FACS flow cytometer
TRIzol reagent	Ambion	15596024	Lyse cells for RNA extraction
Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit	Beyotime	C0011	Trypan Blue Staining