감염성 단핵구증이 있는 어린이의 말초 혈액 샘플에서 면역 세포 하위 집단 분리

요약

면역자기 비드와 형광 활성화 세포 분류를 결합하여 말초 혈액 단핵 세포(단핵구, CD4+ T 세포, CD8⁺ T 세포, B 세포 및 자연 살해 세포)의 정의된 면역 세포 하위 집단을 분리하고 분석하는 방법을 설명합니다. 이 방법을 사용하여 자기 및 형광 표지 된 세포를 정제하고 분석 할 수 있습니다.

초록

전염성 단핵구증(IM)은 주로 원발성 엡스타인-바 바이러스(EBV) 감염과 관련된 급성 증후군입니다. 주요 임상 증상으로는 불규칙한 발열, 림프절 병증 및 말초 혈액의 림프구 증가가 있습니다. IM의 병원성 메커니즘은 아직 명확하지 않습니다. 효과적인 치료 방법은 없으며 주로 증상 치료법을 사용할 수 있습니다. EBV 면역생물학의 주요 질문은 왜 감염된 개인의 소수만이 심각한 임상 증상을 보이고 심지어 EBV 관련 악성 종양이 발생하는 반면, 대부분의 개인은 바이러스에 감염된 평생 동안 무증상입니다.

B 세포는 EBV 수용체가 표면에 제시되기 때문에 IM에 먼저 관여합니다. 자연 살해(NK) 세포는 EBV 감염 세포를 죽이는 데 중요한 세포독성 선천 림프구입니다. 급성 EBV 감염 동안 CD4+ T 세포의 비율은 감소하는 반면 CD8+ T 세포의 비율은 극적으로 확장되며, CD8⁺ T 세포의 지속성은 IM의 평생 제어에 중요합니다. 이러한 면역 세포는 IM에서 중요한 역할을 하며 그 기능은 별도로 식별해야 합니다. 이러한 목적을 위해, 단핵구는 먼저 CD14 마이크로비드, 컬럼 및 자기 분리기를 사용하여 IM 개체의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 분리된다.

나머지 PBMC는 페리디닌-클로로필 단백질 (PerCP)/시아닌 5.5 항-CD3, 알로피코시아닌 (APC)/시아닌 7 항-CD4, 피코에리트린 (PE) 항-CD8, 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC) 항-CD19, APC 항-CD56 및 APC 항-CD16 항체로 염색되어 유동 세포계를 사용하여 CD4+ T 세포, CD8⁺ T 세포, B 세포 및 NK 세포를 분류합니다. 또한, 5 개의 하위 집단의 전사체 시퀀싱을 수행하여 IM에서 기능과 병원성 메커니즘을 탐색했습니다.

서문

인간 헤르페스 바이러스 4형으로도 알려진 γ 헤르페스 바이러스인 엡스타인-바 바이러스(EBV)는 인간 인구에서 어디에나 있으며^{성인 인구의} 90% 이상에서 평생 잠복 감염을 확립합니다1. 대부분의 EBV 1차 감염은 소아기 및 청소년기에 발생하며, 일부 환자는 감염성 단핵구증(IM)²을 나타내며, 혈액 내 CD8⁺ T 세포에 의한 면역 반응 활성화 및 구인두에서 EBV에 감염된 B 세포의 일시적인 증식을 포함한 특징적인 면역병리를^{보입니다3.} IM의 과정은 2-6 주 동안 지속될 수 있으며 대부분의 환자는 잘 회복됩니다⁴. 그러나 일부 개인은 이환율과 사망률이 높은 지속적이거나 재발적인 IM 유사 증상을 나타내며, 이는 만성 활동성 EBV 감염(CAEBV^)으로 분류됩니다5. 또한 EBV는 중요한 발암 바이러스로, 비인두암, 버킷 림프종, 호지킨 림프종(HL) 및 T/NK 세포 림프종⁶과 같은 상피 및 림프성 악성 종양을 포함한 다양한 악성 종양과 밀접한 관련이 있습니다. EBV는 50년 넘게 연구되어 왔지만 그 발병 기전과 림프구의 증식을 유도하는 메커니즘은 완전히 밝혀지지 않았습니다.

여러 연구에서 전사체 시퀀싱에 의한 EBV 감염의 면역병리학에 대한 분자 서명을 조사했습니다. Zhong 등은 IM 또는 CAEBV가 있는 중국 어린이의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 전체 전사체 프로파일링을 분석하여 CD8+ T 세포 확장이 IM 그룹⁷에서 주로 발견되어 CD8⁺ T 세포가 IM에서 중요한 역할을 할 수 있음을 시사합니다. 유사하게, 또 다른 연구에서는 EBV 재활성화 및^{기타 약제 모두에} 의해 유발된 IM 환자보다 1차 EBV 감염으로 인한 IM 환자에서 EBV 특이적 세포독성 T 및 CD19+ B 세포의 비율이 낮고 CD8⁺ T 세포의 비율이 더 높다는 것을 발견했습니다8. B 세포는 EBV 수용체가 표면에 제시되기 때문에 IM에 먼저 관여합니다. Al Tabaa 등은 IM⁹ 동안 B 세포가 다클론으로 활성화되고 분화된 원형질모세포(CD19+, CD27⁺ 및 CD20- 및 CD138- 세포) 및 형질 세포(CD19+, ^CD27+ 및 CD20^- 및 CD138⁺)를 발견했습니다. 또한, Zhong et al. 단핵구 마커 CD14 및 CD64가 CAEBV에서 상향 조절된다는 것을 발견했으며, 이는 단핵구가 항체 의존성 세포 세포 독성 (ADCC) 및 과민성 식균 작용을 통해 CAEBV의 세포 면역 반응에 중요한 역할을 할 수 있음을 시사합니다⁷. ALKA 등은 IM 또는 HL 환자 4 명으로부터 분류 된 MACS CD56^희미한 CD16 ⁺ NK 세포의 전사체를 특성화하고 IM 및 HL의 NK 세포가 선천성 면역 및 케모카인 신호 전달 유전자를 하향 조절하여 NK 세포의 저 반응성을 담당 할 수 있음을 발견했습니다¹⁰. 또한, 그리노 등은 IM을 가진 개인의 10개의 PBMC로부터 분류된 CD8⁺ T 세포의 유전자 발현을 분석하였다. 그들은 IM에서 CD8⁺ T 세포의 상당 부분이 바이러스 특이적이고, 활성화되고, 분열하고, 이펙^{터 활성을} 발휘할 준비가 되어 있다고 보고했습니다11. T 세포 매개 EBV 특이적 반응과 NK 세포 매개 비특이적 반응은 모두 1차 EBV 감염 동안 필수적인 역할을 합니다. 그러나 이러한 연구는 다양한 면역 세포 혼합물 또는 림프구의 특정 하위 집단의 전사체 결과만을 조사했으며, 이는 동일한 질병 상태의 IM 소아에서 다른 면역 세포 하위 집단의 분자 특성 및 기능을 포괄적으로 비교하기에 충분하지 않습니다.

이 논문은 면역자기 비드와 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 결합하여 PBMC(단핵구, CD4+ T 세포, CD8⁺ T 세포, B 세포 및 NK 세포)의 정의된 면역 세포 하위 집단을 분리하고 분석하는 방법을 설명합니다. 이 방법을 사용하여, 자기 및 형광 표지된 세포를 자기 분리기 및 FACS를 사용하여 정제하거나 유세포분석에 의해 분석할 수 있다. RNA는 전사체 시퀀싱을 위해 정제된 세포로부터 추출될 수 있다. 이 방법은 IM 환자의 동일한 질병 상태에서 서로 다른 면역 세포의 특성화 및 유전자 발현을 가능하게 하여 EBV 감염의 면역병리학에 대한 이해를 넓힐 것입니다.

프로토콜

혈액 샘플은 IM 환자(n=3), 건강한 EBV 보균자(n=3) 및 EBV에 감염되지 않은 어린이(n=3)로부터 얻었다. 베이징 어린이 병원, 수도 의과 대학에서 자원 봉사자를 모집했으며 모든 연구는 윤리적으로 승인되었습니다. 수도의과대학 베이징 아동병원 윤리위원회에서 윤리적 승인을 받았습니다(승인 번호: [2021]-E-056-Y). 이 연구는 임상 테스트를 위해 나머지 샘플 만 사용했기 때문에 환자의 정보에 입각 한 동의가 면제되었습니다. 모든 데이터는 환자의 개인 정보를 보호하기 위해 완전히 익명화되고 익명화되었습니다.

1. 말초 혈액에서 PBMC의 분리

1. 표준 정맥 천자로 IM 환자의 신선한 말초 혈액 (2mL)을 K₃EDTA 튜브로 수집합니다.
   참고: 세포 생존력을 유지하려면 프로세스가 빨라야 합니다.
2. 인산염 완충 식염수(PBS)로 말초 혈액을 2배 부피로 희석하고 15mL 원심분리 튜브에서 인간 림프구 분리 배지(밀도: 1.077 ± 0.001g/mL) 위에 놓습니다.
   참고: 혈액, PBS 및 분리 배지의 부피비는 1:1:1이었습니다. 혈액을 분리 매체에 천천히 추가하고 혈액이 분리 매체에 침전되지 않도록 즉시 원심 분리하십시오.
3. 실온에서 20 분 동안 800 ×g에서 원심 분리합니다. 중간 층(농축 PBMC)을 다른 15mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.
   참고: 원심분리 후에, 관의 바닥에 적혈구가 있고, 중간 층은 분리 매체이고, 최상층은 혈장이고, 플라스마 층과 별거 액체 층 사이에는 PBMC (림프구 및 단핵구 포함)가 있었습니다.
4. PBMC를 10mL의 PBS로 세척하고 실온에서 20분 동안 800× g 에서 원심분리합니다. 상청액을 조심스럽게 폐기하십시오.
5. 세척 및 원심분리(단계 1.4)를 2 x 반복한다. 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 1mL의 PBS로 PBMC를 재현탁하고 트리판 블루 기반의 자동 카운터로 세포를 계수합니다.

2. CD14 마이크로비드를 사용하여 PBMC로부터 CD14^{+ 단핵} 구의 분리

1. PBS (pH 7.2) 중 0.5% 소 태아 혈청 (FBS) 및 2 mM EDTA를 함유하는 완충 용액을 준비한다. 버퍼를 차갑게 유지하십시오 (2-8 ° C).
   알림: 기포가 컬럼을 막을 수 있으므로 사용하기 전에 버퍼를 탈기하십시오. 세포 표면의 항체 캡핑 및 비특이적 세포 표지를 방지하기 위해 세포를 차갑게 유지하십시오.
2. PBMC를 실온에서 10 분 동안 300×g으로 원심분리합니다. 상청액을 조심스럽게 폐기하십시오. 세포를 80 μL의 완충액으로 재현탁시킨다. 20μL의 CD14 마이크로비드를 세포 현탁액에 추가합니다.
   참고: ≤10⁷ PBMC가 있는 경우 위에 표시된 볼륨을 사용하십시오. >10^{7 PBMC} 가 있는 경우 모든 시약 부피와 총 부피를 비례적으로 늘립니다.
3. CD14 마이크로비드와 세포를 1.5mL 마이크로원심분리 튜브에서 웰 혼합하고 4°C 냉장고에서 15분 동안 배양합니다. PBMC를 1mL의 완충액으로 세척하고 실온에서 10분 동안 300× g 에서 원심분리합니다. 상청액을 완전히 폐기하십시오. 500 μL의 완충액으로 세포를 재현탁시킨다.
   참고: ≤10⁸ PBMC가 있는 경우 위에 표시된 볼륨을 사용하십시오. >10^{8 PBMC} 가 있는 경우 비례적으로 버퍼 볼륨을 늘립니다.
4. 기둥이있는 자기 분리 :
   1. 컬럼을 마그네틱 비드 분리기 위에 놓고 3mL의 완충액으로 컬럼을 세척합니다. 세포 현탁액(2.3단계에서)을 컬럼에 추가합니다.
   2. 컬럼을 통과하는 라벨링되지 않은 세포를 15mL 원심분리 튜브에 수집하고 3mL의 완충액으로 컬럼을 세척합니다. 3 x 3 mL의 완충액으로 컬럼을 세척합니다. 15mL 원심분리 튜브에 총 유출물을 수집합니다.
   3. 컬럼을 새 15mL 원심분리 튜브에 넣습니다. 컬럼에 완충액 5mL를 추가합니다. 플런저를 컬럼에 단단히 밀어 넣어 자기적으로 표지된 셀을 15mL 원심분리 튜브로 즉시 플러시합니다.
   4. 자기적으로 표지된 세포를 300 × g 에서 5분 동안 원심분리하고 상청액을 제거한다. 후속 전사체 시퀀싱에 사용하기 위해 1.5mL 미세 원심분리 튜브에 500μL의 PBS에 세포를 재현탁합니다.

3. 형광 표지된 항체 염색 및 FACS에 의한 PBMC로부터 림프구 집단의 분리

1. 표지되지 않은 세포를 300 × g 에서 5분 동안 원심분리하고(단계 2.4.2) 상청액을 제거한다. 세포를 1.5mL 미세 원심분리 튜브에 100μL의 PBS에 재현탁시킵니다.
2. 100μL의 세포 현탁액에 2μL의 각 표지된 항체(CD3, CD4, CD8, CD16, CD19, CD56)를 추가하고(항체의 부피 및 접합된 형광단 정보는 표 1에 표시됨), 30분 동안 얼음에서 배양하고 빛으로부터 보호합니다.
3. PBS 1mL를 첨가하고 실온에서 5분 동안 300× g 에서 원심분리하여 세포를 2배 세척합니다. 세포를 1.5mL 마이크로원심분리 튜브에 500μL의 PBS에 재현탁시킨다. 유동 세포 분류기 세포분석기에서 데이터를 수집하기 전에 세포 현탁액을 부드럽게 소용돌이합니다.

4. 유세포 분석 파라미터 설정

1. 필요에 따라 1.5mL 미세 원심분리 튜브에서 100μL의 세포 현탁액(섹션 1 참조)을 취하고 음성 대조군 샘플, CD3 단일 염색 샘플, CD4 단일 염색 샘플, CD8 단일 염색 샘플, CD19 단일 염색 샘플 및 CD56/CD16 염색 샘플을 설정합니다.
2. 세포 현탁액 및 와류의 100 μL 당 상응하는 형광 표지된 항체 2 μL를 첨가한다. 어둠 속에서 30 분 동안 얼음 위에서 배양하십시오. 300 × g 에서 5분 동안 원심분리하고 상청액을 흡인한다. 500μL의 PBS와 와류로 펠릿을 재현탁합니다.
3. 분류 스트림을 시운전하고 다음과 같이 형광 비드를 사용하여 액적을 지연시킵니다.
   1. 셀 분류 시스템을 열고 전원 켜기 프로그램을 실행하고 85μm 노즐을 설치하고 분류 스트림을 엽니다. 정렬 전압을 4,500V로 설정하고 주파수 를 47로 설정합니다.
   2. 주로 제조업체의 지침에 따라 주 흐름 액적 중단점과 액적 지연을 조정하여 매개변수를 조정합니다¹². 브레이크 오프 창에서 첫 번째 드롭릿 중단점 위치(Drop1)를 275로 설정하고 간격을 8로 설정합니다. Sweet Spot 자동 정렬 모드를 켜서 세포분석이 자동으로 액적 진폭 값을 결정하여 스트림을 안정화할 수 있도록 합니다.
   3. 형광 비드를 로드하여 사이드 스트림 창에서 액적 지연을 30.31로 조정하여 비드가 초기 또는 미세 조정 모드에서 >99%의 측면 흐름 편향을 달성하도록 합니다.
4. 그림 1에 표시된 게이팅 전략을 참조하여 다음과 같이 게이팅을 수행합니다.
   1. 전방 산란 영역(FSC-A)/측면 산란 영역(SSC-A) 점도표를 사용하여 다각형 게이트(P1) 를 그려 온전한 림프구 집단을 식별합니다.
   2. FSC-A/FSC-높이(FSC-H) 점도표를 사용하여 다각형 게이트(P2)를 그려 단일 셀을 식별하고 이중선을 제외합니다(그림 1A).
   3. CD19 FITC-A/CD3 PerCP-Cy5.5-A 점도표를 사용하여 직사각형 게이트(P3)를 그려 CD3+ T 세포와 CD19⁺ B 세포를 선택합니다(그림 1A,B).
   4. CD4 APC-Cy7-A/CD8 PE-A 점도표를 사용하여 직사각형 게이트를 그려 CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포(각각 이러한 마커에 대해 형광이 높은 세포)를 선택합니다.
   5. CD56/CD16 APC-A/SSC-A 점도표를 사용하여 직사각형 게이트를 그려 CD56+/CD16⁺ NK 세포를 선택합니다(그림 1C).
5. 음성 대조군 샘플을 사용하여 기기 파라미터를 조정합니다.
   1. 네거티브 컨트롤 튜브를 로딩 포트에 설치하고 획득 대시보드에서 로드(Load)를 클릭합니다. 소프트웨어에서 세포분석기 설정을 선택합니다.
   2. 인스펙터 창에서 매개 변수 탭을 클릭하고 FSC, SSC 및 다양한 형광 염료의 전압을 조정합니다. FSC : 231, SSC : 512, PE : 549, APC : 615, APC- 시아닌 7 : 824, FITC : 555, PerCP- 시아닌 5.5 : 663.
6. 단일 염색 샘플을 사용하여 보정^{조정 13}.
   1. 단일 염색 튜브를 세포분석에 순차적으로 로드하고 소프트웨어에서 세포분석기 설정을 선택합니다. 보정 탭을 클릭하여 보정을 조정합니다.
      참고: 유세포분석의 보상 기준은 표 2에 나와 있습니다.

5. 유세포분석을 통한 세포 분류 및 데이터 수집

1. 세포 현탁액(섹션 1-3에 따라 분리된 PBMCs)을 잠시 와동시켜 튜브를 세포분석기에 넣기 전에 세포를 재현탁합니다. 나머지 튜브를 얼음 위에 보관하십시오.
2. 4개의 수집 흐름 튜브에 200μL의 FBS를 추가하여 분류된 세포가 튜브 벽에 달라붙지 않도록 하고 세포분석기 수집 챔버에 넣습니다.
3. 4개의 유동 튜브에서 IM 환자의 샘플과 별도로 CD3+CD4+ T 세포, ^CD3+CD8+ T 세포, ^CD3-CD19+ B 세포 및 CD3^- CD56+/CD16⁺ NK 세포를 수집합니다(그림 2A).
4. 분리된 세포를 300×g에서 5 분 동안 원 심분리하고 상층액을 제거한다. 전사체 시퀀싱을 위해 200μL의 RNA 분리 시약을 세포에 추가합니다.
5. 위의 단계에 따라 건강한 EBV 보균자와 EBV에 감염되지 않은 어린이로부터 샘플의 면역 세포 하위 집단을 분리합니다(그림 2B, C).

결과

게이팅 전략의 참조
4개의 림프구 하위 집단을 분류하는 데 사용되는 게이팅 전략은 그림 1에 나와 있습니다. 간략하게, 림프구는 세분도 (SSC-A) 대 크기 (FSC-A)를 보여주는 점도표에서 선택됩니다 (P1). 그런 다음 크기(FSC-A) 대 전방 산란(FSC-H)을 보여주는 점도표에서 단일 셀(P2)을 선택하고 이중선 셀은 제외합니다. CD3+ T 세포(P3) 및 CD19⁺ B 세포(

토론

이 프로토콜은 말초 혈액 면역 세포 하위 집단을 분류하는 효율적인 방법을 나타냅니다. 이 연구에서는 IM 환자, 건강한 EBV 보균자 및 EBV에 감염되지 않은 어린이의 정맥혈 샘플을 연구 목표로 선택했습니다. IM 환자의 말초 혈액을 사용하는이 작업은 주로 다색 유세포 분석을 통해 다양한 세포 하위 집합의 비율을 분석하고 결정하는 데 중점을 둡니다. 전사체 시퀀싱은 주로 동일한 질병 상태에서 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
APC anti-human CD16	Biolegend	302012	Fluorescent antibody
APC anti-human CD56 (NCAM)	Biolegend	362504	Fluorescent antibody
APC/Cyanine7 anti-human CD4	Biolegend	344616	Fluorescent antibody
Automated cell counter	BIO RAD	TC20	Cell count
BD FACSAria fluorescence-activated flow cell sorter-cytometer (BD FACSAria II)	Becton, Dickinson and Company	644832	Cell sort
CD14 MicroBeads, human	Miltenyi Biotec	130-050-201	microbeads
Cell ctng slides	BIO RAD	1450016	Cell count
Centrifuge tubes	Falcon	35209715	15 mL centrifuge tube
EDTA (≥99%, BioPremium)	Beyotime	ST1303	EDTA
Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) anticoagulant tubes	Becton, Dickinson and Company	367862	EDTA anticoagulant tubes
FITC anti-human CD19	Biolegend	302206	Fluorescent antibody
Gibco Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	16000-044	Fetal Bovine Serum
High-speed centrifuge	Sigma	3K15	Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube
High-speed centrifuge	Eppendorf	5424R	Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube
Human lymphocyte separation medium	Dakewe	DKW-KLSH-0100	Ficoll-Paque
LS Separation columns	Miltenyi Biotec	130-042-401	Separation columns
Microcentrifuge tubes	Axygen	MCT-150-C	1.5 mL microcentrifuge tube
MidiMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-302	Magnetic bead separator
PE anti-human CD8	Biolegend	344706	Fluorescent antibody
PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD3	Biolegend	344808	Fluorescent antibody
Phosphate Buffered Saline (PBS)	BI	02-024-1ACS	PBS
Polystyrene round bottom tubes	Falcon	352235	5 mL tube for FACS flow cytometer
TRIzol reagent	Ambion	15596024	Lyse cells for RNA extraction
Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit	Beyotime	C0011	Trypan Blue Staining