Caenorhabditis elegans Bağırsak Mikrobiyomunun Miktar Tayini ve Analizi için Akış Vermimetrisinin Uygulanması

Özet

Caenorhabditis elegans , konakçı-mikrobiyom etkileşimlerini yönlendiren moleküler belirleyicileri incelemek için güçlü bir modeldir. C. elegans fizyolojisinin temel yönleriyle birlikte bağırsak mikrobiyom kolonizasyonunun tek hayvan seviyelerinin profilini çıkaran yüksek verimli bir boru hattı sunuyoruz.

Özet

Bağırsak mikrobiyomunun bileşimi, hayvanın gelişimi ve yaşamı boyunca konakçı fizyolojisi üzerinde dramatik bir etkiye sahip olabilir. Mikrobiyomdaki bileşimsel değişikliklerin ölçülmesi, bu fizyolojik değişiklikler arasındaki fonksiyonel ilişkilerin belirlenmesinde çok önemlidir. Caenorhabditis elegans , konak-mikrobiyom etkileşimlerinin moleküler itici güçlerini incelemek için güçlü bir konak sistemi olarak ortaya çıkmıştır. Şeffaf vücut planı ve floresan etiketli doğal mikropları ile, tek bir C. elegans hayvanının bağırsak mikrobiyomundaki nispi mikrop seviyeleri, büyük bir partikül ayırıcı kullanılarak kolayca ölçülebilir. Burada, bir mikrobiyomun deneysel kurulumu, C. elegans popülasyonlarının istenen yaşam evresinde toplanması ve analizi, ayıklayıcının çalıştırılması ve bakımı ve elde edilen veri kümelerinin istatistiksel analizleri için prosedürleri açıklıyoruz. Ayrıca, ilgilenilen mikroplara dayalı olarak sıralayıcı ayarlarını optimize etmeye yönelik hususları, C. elegans yaşam evreleri için etkili geçit stratejilerinin geliştirilmesini ve bağırsak mikrobiyom bileşimine dayalı hayvan popülasyonlarını zenginleştirmek için sıralayıcı yeteneklerinin nasıl kullanılacağını tartışıyoruz. Yüksek verimli uygulamalara ölçeklenebilirlik potansiyeli de dahil olmak üzere protokolün bir parçası olarak potansiyel uygulama örnekleri sunulacaktır.

Giriş

Hayvan evrimi sürekli mikrobiyal etki altındadır¹. Çevredeki çeşitli mikroplardan, hayvan konakçıları, konakçının yeteneklerini genişleten ve fizyolojisini ve hastalığa duyarlılığını^{artıran belirli} ortaklar² edinir 3. Örneğin, bağırsak mikrobiyomunun metagenomik analizleri, çoğu insan bağırsak mikrobiyomunda 5 bulunan obez farelerde⁴ daha fazla enerji hasadı ve depolanması sağlayabilecek zenginleştirilmiş metabolik mikrobiyal gen sınıflarını ortaya^çıkardı. Nedensel ilişkiler kurmak ve mikrobiyom etkisinin moleküler belirleyicile....

Protokol

1. Mikrobiyom karışımının hazırlanması

1. Bir gliserol dondurucu stoğundaki bakterileri bir lizojen et suyu (LB) plakasına veya uygun büyüme ortamına damgalayın veya çizin ve ilgilenilen bakteri suşlarına (tipik olarak 25 ° C) dayalı olarak optimum sıcaklıkta gece boyunca büyütün C . elegans doğal mikroplar).
2. LB plakasından, her bir bakteri izolatından tek bir koloni kullanın (ör., CeMbio koleksiyonunun 12 bakterisi) 800 μL LB ortamını 1 mL derin kuyucuklu bir plakanın ayrı kuyucuklarına aşılamak için. 250 rpm'de çalkalayarak gece boyunca optimum sıcaklıkta inkübe edin.
   NOT: Bu protokol, tanımlanmış doğal mikrobiyomlarla (....

Sonuçlar

Ergin ve larva popülasyon kapılarının tanımlanması
Burada, senkronize C. elegans L1'ler, standart bir laboratuvar diyeti olan E. coli OP50 (Eco) ile tohumlanmış bir NGM plakası üzerinde büyütüldü. C. elegans popülasyonları, 20 ° C'de 96 saat veya 120 saat büyümeden sonra LPS analizi için toplanmıştır (Şekil 2A). Yok oluşun nokta grafiği (EXT, vücut yoğunluğunun bir temsilcisi) ve uçuş süresi (TOF, vücut uzunluğu.......

Tartışmalar

Akış vermimetrisi, çeşitli çalışmalarda C. elegans genlerini ve patojen kolonizasyonuna ve toksisitesine karşı yolakları karakterize etmek için kullanılmıştır^21,22. Burada, bağırsak mikrobiyomlarının konakçı fizyolojisini nasıl modüle ettiğini araştırmak için C. elegans'ı kullanan yüksek verimli bir yaklaşım sunulmaktadır. Koloni oluşturan birimler (CFU) veya 16S rRNA amplikon dizilimi 9,16,17,23,24 k.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL conical bottom centrifuge tubes	VWR	10026-076
96 deep-well plates (1 mL)	Axygen	P-DW-11-C
96 deep-well plates (2 mL)	Axygen	P-DW-20-C
96-well Costar plate	Corning	3694
Agar	Millipore Sigma		Standard bacteriology agar is also sufficient.
Aspirating manifold	V&P scientific	VP1171A
Bleach	Clorox
Bleach solution			Mix Bleach with 5M Sodium hypochlorite 2:1 (v/v)
Cell Imaging Multimode Reader	Biotek	Cytation 5	Bacterial OD measurement
Centrifuge	Thermo scientific	Sorvall Legend XTR	For 96 well plate and conical tubes
Fluorescent Microscope	Nikon	TiE
ggplot: Various R Programming Tools for Plotting Data.	R package	Version 3.3.2
Large Particle Autosampler	Union Biometrica	LP Sampler
Large Particle Sorter	Union Biometrica	COPAS Biosorter
Levamisole	Fisher	AC187870100
Lysogeny Broth (LB)	RPI	L24066	Standard LB home-made recipes using Bacto-tryptone, yeast extract, and NaCl are also sufficient.
M9 solution			22 mM KH2PO4 monobasic, 42.3 mM Na2HPO4, 85.6 mM NaCl, 1 mM MgSO4
Nematode Growth Medium	RPI	N81800-1000.0	1 mM CaCl2, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4 added after autoclaving.
RStudio	GNU	Version 1.3.1093
Sodium hypochlorite	Sigma-Aldrich		5M NaOH
Stereo Microscope	Nikon	SMZ745
Sterile 10 cm diameter petri dishes	Corning	351029
Sterile 12-well plates	VWR	10062-894
Sterile 24-well plates	VWR	10062-896
Sterile 6 cm diameter petri dishes	Corning	351007
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787