Anwendung der Flow-Vermimetrie zur Quantifizierung und Analyse des Darmmikrobioms von Caenorhabditis elegans

Zusammenfassung

Caenorhabditis elegans ist ein leistungsfähiges Modell, um die molekularen Determinanten zu untersuchen, die Wirt-Mikrobiom-Interaktionen steuern. Wir präsentieren eine Hochdurchsatz-Pipeline, die die Ebenen der Darmmikrobiom-Kolonisierung einzelner Tiere zusammen mit Schlüsselaspekten der Physiologie von C. elegans profiliert.

Zusammenfassung

Die Zusammensetzung des Darmmikrobioms kann während der gesamten Entwicklung und des Lebens des Tieres einen dramatischen Einfluss auf die Physiologie des Wirts haben. Die Messung von Veränderungen der Zusammensetzung des Mikrobioms ist entscheidend, um die funktionellen Beziehungen zwischen diesen physiologischen Veränderungen zu identifizieren. Caenorhabditis elegans hat sich als leistungsfähiges Wirtssystem erwiesen, um die molekularen Treiber von Wirt-Mikrobiom-Interaktionen zu untersuchen. Mit seinem transparenten Körperplan und den fluoreszenzmarkierten natürlichen Mikroben können die relativen Konzentrationen von Mikroben im Darmmikrobiom eines einzelnen C. elegans-Tieres mit einem großen Partikelsortierer leicht quantifiziert werden . Hier beschreiben wir die Vorgehensweisen für den experimentellen Aufbau eines Mikrobioms, die Sammlung und Analyse von C. elegans-Populationen im gewünschten Lebensstadium, den Betrieb und die Wartung des Sortierers sowie statistische Analysen der resultierenden Datensätze . Wir diskutieren auch Überlegungen zur Optimierung der Sortierereinstellungen auf der Grundlage der interessierenden Mikroben, die Entwicklung effektiver Anschnittstrategien für die Lebensstadien von C. elegans und wie die Fähigkeiten von Sortierern genutzt werden können, um Tierpopulationen auf der Grundlage der Zusammensetzung des Darmmikrobioms anzureichern. Im Rahmen des Protokolls werden Beispiele für potenzielle Anwendungen vorgestellt, einschließlich des Potenzials für die Skalierbarkeit auf Anwendungen mit hohem Durchsatz.

Einleitung

Die Evolution von Tieren steht unter ständigem mikrobiellen Einfluss¹. Aus verschiedenen Mikroben in der Umwelt erwerben tierische Wirte spezifische Partner² , die die Fähigkeiten des Wirts erweitern und seine Physiologie und Anfälligkeit für Krankheiten³ vorantreiben. Metagenomische Analysen des Darmmikrobioms deckten beispielsweise angereicherte Stoffwechselklassen mikrobieller Gene auf, die bei adipösen Mäusen zu einer größeren Energiegewinnung und -speicherung führen können⁴, von denen viele auch im menschlichen Darmmikrobiom zu finden sind⁵. Es besteht immer noch ein großer Bedarf, kausale Zusammenhänge herzustellen und die molekularen Determinanten des Einflusses auf das Mikrobiom zu bestimmen, obwohl der Fortschritt durch die Komplexität des Mikrobioms und die Eignung von Wirtssystemen für ein groß angelegtes Screening behindert wurde.

Der Modellorganismus C. elegans bietet eine Plattform, um das molekulare Verständnis der Zusammenhänge zwischen Mikrobiom und Wirtsphysiologie zu verbessern. C. elegans besitzt 20 Darmzellen mit einer Schleimhautschicht und Zottenstrukturen. Diese Zellen sind mit reichlich Chemorezeptor-Genen ausgestattet, die mikrobielle Produkte erkennen und antimikrobielle Moleküle produzieren, die möglicherweise ihre Darmkolonisatoren regulieren ^6,7. Diese konservierte Biologie von C. elegans hat zu einer enormen Anzahl von Entdeckungen in der Wirtssignalisierung geführt, die Darmmikroben regulieren, einschließlich der Insulinsignalisierung, TGF-beta und der MAP-Kinase 8,9,10.

C. elegans nutzt Mikroben sowohl als Nahrung für das Wachstum während der Entwicklung als auch als Mikrobiom als Erwachsene. Mit zunehmendem Alter können sich einige Mikroben im Darmlumen übermäßig anreichern und die Wirt-Mikroben-Beziehung verschiebt sich von der Symbiose zur Pathogenese¹¹. In ihrem natürlichen Lebensraum trifft C. elegans auf eine Vielzahl von Bakterienarten^12,13. Die Sequenzierung von 16S rDNA aus repräsentativen Proben, die in natürlichen Lebensräumen (faule Früchte, Pflanzenstängel und tierische Vektoren) gesammelt wurden, ergab, dass das natürliche Mikrobiom von C. elegans von vier Bakterienstämmen dominiert wird: Proteobakterien, Bacteroidetes, Firmicutes und Actinobakterien. Innerhalb dieser Unterteilungen gibt es große Unterschiede in der Vielfalt und dem Reichtum der Bakterien, basierend auf dem Lebensraum^12,13,14,15. Es wurden mehrere definierte Gemeinschaften gegründet, darunter die 63-köpfigen (BIGbiome)¹⁶ und 12-köpfigen (CeMbio) Sammlungen, die die wichtigsten Mikrobiom-Gattungen repräsentieren, die für die C. elegans-Forschungsgemeinschaft geschaffen wurden¹⁷. Sowohl Mikrobiome als auch Komponentenstämme können einen vielfältigen Einfluss auf die Physiologie von C. elegans haben, wie z. B. Körpergröße, Wachstumsraten und Stressreaktionen 9,16,17. Diese Studien liefern Ressourcen und Beispiele, um C. elegans als Modell für die Mikrobiomforschung zu etablieren.

Hier wird ein auf Large Particle Sorter (LPS) basierender Arbeitsablauf (Abbildung 1) vorgestellt, der das C. elegans-System nutzt, um gleichzeitig die Zusammensetzung des Mikrobioms und grundlegende Messungen der Wirtsphysiologie auf Populationsebene zu messen. Von der mikrobiellen Seite aus ist der Arbeitsablauf anpassungsfähig, um ein definiertes Mikrobiom oder einzelne Mikroben zusammenzusetzen, um die Robustheit und Plastizität der Gemeinschaft mit zunehmenden mikrobiellen Interaktionen zu testen. Auf der Wirtsseite ermöglicht der Arbeitsablauf Hochdurchsatz-Assays zur Messung des Besiedlungsgrades fluoreszierender Mikroben im Mikrobiom und zur physiologischen Auslesung des Wirts in Bezug auf Entwicklung, Körpergröße und Fortpflanzung. Zusammenfassend ermöglicht das Mikrobiommodell von C. elegans Hochdurchsatz-Screenings, um die metabolischen und genetischen Determinanten zu bestimmen, die die Physiologie des Wirts modulieren.

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Protokoll

1. Vorbereitung der Mikrobiommischung

1. Stempeln oder streifen Sie Bakterien aus einem Glycerin-Gefrierschrank auf eine Lysogenese-Bouillon (LB)-Platte oder ein geeignetes Wachstumsmedium und lassen Sie sie über Nacht bei einer optimalen Temperatur wachsen, die auf den interessierenden Bakterienstämmen basiert (typischerweise 25 °C für natürliche Mikroben von C. elegans ).
2. Verwenden Sie von der LB-Platte eine einzelne Kolonie aus jedem Bakterienisolat (z. B. 12 Bakterien der CeMbio-Sammlung), um 800 μl LB-Medium in separaten Vertiefungen einer 1-ml-Deep-Well-Platte zu inokulieren. Über Nacht bei optimaler Temperatur unter Schütteln bei 250 U/min inkubieren.
   HINWEIS: Dieses Protokoll ist für die Verwendung mit definierten natürlichen Mikrobiomen (z. B. CeMbio) optimiert, kann aber durch Wachstum unter geeigneten Bedingungen oder anderen Kulturgefäßen (Röhrchen) leicht an einzelne Mikroben angepasst werden.
3. Beurteilen Sie das Wachstum jeder Mikrobe durch Spektrophotometrie. Ein 20-μl-Aliquot wird in 80 μl LB überführt und die Lösung auf eine durchsichtige, flache 96-Well-Platte gegeben. Messen Sie den OD₆₀₀ auf einem Plattenleser.
4. Nach dem Wachstum über Nacht zentrifugieren Sie die Tiefbrunnenkulturplatte bei 4.000 x g für 10 Minuten, um Bakterien zu pelletieren, und entfernen Sie den Überstand durch Aspiration mit einem 96-Well-Aspirationsverteiler oder einer Mehrkanalpipette.
5. Unter Verwendung von OD 600-Werten wird die Konzentration jeder Mikrobe unter Verwendung eines sterilen M9-Mediums auf einen endgültigen OD₆₀₀ von 1,0 normalisiert.
6. Wenn Sie Mikroben kombinieren, bestimmen Sie die Menge der Bakterienkultur, die für das Experiment benötigt wird, und erstellen Sie einen Mikrobiom-Mastermix, indem Sie gleiche Volumina jedes Bakterienstamms in ein Röhrchen ausreichender Größe (z. B. 5-ml- oder 15-ml-Röhrchen) kombinieren.
7. Platzieren Sie 30-50 μl der Mikroben mit einem endgültigen OD₆₀₀ von 1,0 auf der Mitte jeder Agar-haltigen Platte oder Vertiefung¹⁸ des Nematodenwachstumsmediums (NGM). Lassen Sie das ausgesäte Mikrobiom über Nacht bei optimaler Temperatur (hier 25 °C) wachsen.
   HINWEIS: Bereiten Sie NGM-Agarplatten im Voraus gemäß den Anweisungen im Wurmbuch oder mit vorgemischtem NGM-Pulver¹⁸ vor. Beispielsweise werden 3 ml NGM für 12-Well-Platten und 1,5 ml für 24-Well-Platten hinzugefügt.

2. Vorbereitung von synchronisierten C. elegans für das Wachstum auf dem Mikrobiom

1. Züchten Sie etwa 100 Würmer auf NGM-Platten (6 cm Durchmesser), die mit Escherichia coli OP50 besät sind, bis die Würmer das trächtige Erwachsenenalter erreicht haben. Für die Zwecke dieses Protokolls wurde der N2-Stamm von C. elegans verwendet, obwohl das Protokoll leicht an andere Nematodenstämme angepasst werden kann.
2. Fügen Sie 6 ml M9-Puffer hinzu (plus 0,01 % Triton X-100; M9-TX) auf die Platte pipettieren, um etwa 100 trächtige erwachsene Würmer in ein konisches 15-ml-Röhrchen abzuwaschen.
3. Bereiten Sie eine frisch hergestellte Bleichlösung vor, indem Sie zwei Teile Bleichmittel mit einem Teil 5 M NaOH mischen.
4. Zentrifugieren Sie die Würmer bei 3.000 x g für 30 Sekunden, um die Würmer zu pelletieren. Aspirieren, um das Volumen auf 4 ml zu reduzieren, und dann 2 ml Bleichlösung hinzufügen.
5. Schließen Sie den Deckel fest und schütteln Sie das Röhrchen. Überwachen Sie die erwachsenen Würmer in der Lösung unter einem Stereomikroskop mit 10-facher Vergrößerung. Wenn der Körper eines Erwachsenen auseinanderzubrechen beginnt, typischerweise nach 3,5 Minuten, hören Sie auf zu zittern und zentrifugieren Sie ihn 30 Sekunden lang bei 3.000 x g .
6. Mit einer Pipette auf ein minimales Volumen absaugen. Resuspendieren, zentrifugieren und viermal in M9-TX aspirieren, um das Bleichmittel auszuwaschen.
7. Resuspendieren Sie in 4-6 ml M9-TX und legen Sie das Röhrchen über Nacht auf einen Rotator, damit die Eier schlüpfen und sich im L1-Stadium synchronisieren können.
8. Nehmen Sie am nächsten Tag 10 μl L1-Würmer in M9-TX aus dem Röhrchen und geben Sie sie auf eine saubere Petrischale. Zählen Sie die Anzahl der lebenden L1-Würmer unter einem Stereomikroskop bei 20-facher Gesamtvergrößerung.
9. Basierend auf der L1-Dichte wird das entsprechende Volumen pipettiert, um ~50 synchronisierte L1-Larven auf den Rand der mit Mikrobiom besiedelten NGM-Platten zu legen und bei 20 °C zu inkubieren. Lassen Sie die Würmer bis zum gewünschten Alter (Tag 2 oder Tag 3 des Erwachsenenalters) wachsen.

3. Sammeln von Wurmpopulationen für Darmmikrobiomanalysen

1. Waschen Sie die Würmer vom Bakterienrasen mit 1-2 ml M9-TX auf eine sterilisierte 2-ml-96-Well-Tiefe.
   HINWEIS: Bei mikrobiellen Stämmen, die signifikante Biofilme erzeugen, schütteln Sie die Platte 5 Minuten lang mit Flüssigkeit, um mikrobielle Ablagerungen aufzubrechen.
2. Zentrifugieren Sie die Deep-Well-Platte bei 300 x g für 1 Minute, um die Schnecken zu pelletieren, und entfernen Sie dann die Flüssigkeit mit einem Ansaugverteiler.
   HINWEIS: Benutzer können eine Mehrkanalpipette verwenden, um die Flüssigkeit manuell zu entfernen, wenn kein Ansaugverteiler verfügbar ist. Achten Sie darauf, dass die Pipettenspitzen nicht den Boden der Vertiefungen berühren, um den Verlust von Wurmproben zu vermeiden.
3. Geben Sie 1,8 ml M9-TX mit einer 1,2-ml-Mehrkanalpipette in jede Vertiefung der Deep-Well-Platte. Durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren mischen und 1 Minute lang bei 300 x g zentrifugieren. Wiederholen Sie diesen Schritt viermal, um Bakterien in der Flüssigkeit zu entfernen.
4. Nach dem letzten Waschen wird das Volumen in jeder Vertiefung mit dem Ansaugverteiler auf 100 μl gebracht.
   HINWEIS: Um die erwachsenen Würmer mit Hilfe der Schwerkraft von den Larven zu trennen, lassen Sie die Platte 30-60 s lang auf der Bank liegen, damit die erwachsenen Würmer auf den Boden des Brunnens sinken können. Saugen Sie dann die Platte an, um die Larven aus der Suspension zu entfernen.
5. Geben Sie 100 μl 10 mM Levamisol in M9-TX in jede Vertiefung und lassen Sie die Würmer 5 Minuten lang lähmen. Nach der Levamisol-Behandlung 4 % der in Schritt 2.3 beschriebenen Bleichlösung 2 Minuten lang in jede Vertiefung geben, um Bakterienklumpen zu reduzieren. Nach der Bleichbehandlung zweimal mit M9-TX waschen und nach der zweiten Wäsche auf ein Endvolumen von 100 μl absaugen.
6. Die Würmer werden auf eine 96-Well-Platte mit flachem Boden übertragen, die 150 μl 10 mM Levamisol in M9-TX enthält. Halten Sie die Wurmdichte bei 50-100 pro Brunnen und teilen Sie die Würmer auf mehrere Brunnen auf, wenn die Population zu überfüllt ist.

4. Einrichten des Großpartikelsortierers und des Autosamplers

1. Schalten Sie den Luftkompressor, den Computer und das LPS-Instrument ein. Überprüfen und entleeren Sie den Fäkalientank. Geben Sie dann 500 ml Bleichmittel in den leeren Fäkalientank. Prüfen und füllen Sie die Mantel- und Wassertanks nach, wenn das Volumen gering ist. Stellen Sie sicher, dass die 250-μm-Fluidik- und optische Kernbaugruppe (FOCA) vorhanden ist.
2. Führen Sie die Kontrollpartikel für die Qualitätskontrolle aus. Öffnen Sie die LPS-Gerätesoftware. Aktivieren Sie im Softwarefenster die Option Laser aktivieren , um die 488-nm- und 561-nm-Laser einzuschalten.
   HINWEIS: Es ist möglich, die Schritte 4.2-4.5 zu überspringen, wenn die Kontrollpartikel innerhalb der letzten 2 Wochen durchgeführt wurden und das BAZL in dieser Zeit nicht geändert wurde.
3. Wählen Sie "Partikel > Kontrollpartikel einrichten" aus. Wählen Sie in der Eingabeaufforderung Nein aus, um zu den Standardeinstellungen zu wechseln. Die Kontrollpartikel (10 mL dH,₂O und 10 mL Kontrollpartikel in einem konischen 50 mL Röhrchen) vor jedem Gebrauch vortexen und in den Probenanschluss laden.
4. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf Erfassen , um 500 Ereignisse aufzuzeichnen. Stellen Sie sicher, dass die Ereignisrate zwischen 15 und 30 Ereignissen/s liegt.
   HINWEIS: Wenn die Ereignisrate nicht 15–30 Ereignisse/s beträgt, sollte ein Techniker kontaktiert werden, um die Maschineneinstellungen anzupassen.
5. Untersuchen Sie den Variationskoeffizienten (CV) für alle Parameter. Wenn CV 15% <, ist die Qualitätskontrolle bestanden und die LPS-Software kann geschlossen werden. Wenn die CV 15 % >, führen Sie die Mikrometer erneut aus und justieren Sie die Mikrometer mit frisch hergestellten Kontrollpartikeln, um den Laser auf die Durchflusszelle auszurichten.
6. Schließen Sie den Autosampler an und schalten Sie ihn ein. Öffnen Sie die Autosampler-Gerätesoftware. Dadurch werden der Autosampler und die LPS-Software geöffnet. Wechseln Sie im LPS-Softwarefenster zu Datei > neues Experiment und dann zu Datei > neuen Beispiel. Aktivieren Sie Laser aktivieren, um 488-nm- und 561-nm-Laser einzuschalten, falls dies noch nicht geschehen ist.
7. Erstellen Sie Vorlagen für Erfassungspunktdiagramme unter Verwendung von Laufzeit- (TOF), Extinktions- (EXT) und Fluoreszenzkanälen im LPS-Softwarefenster. Eine gute Ausgangsgröße, um alle Würmer zu fangen, ist 8.000 für TOF und EXT. Die Fluoreszenzskalen variieren je nach Mikrobe. Fügen Sie bei jedem Experiment Kontrollwurmproben hinzu, die auf nicht-fluoreszierenden Mikroben (z. B. OP50) gezüchtet wurden, und jede fluoreszierende Mikrobe allein (wenn Mikroben gemischt werden) als Kontrollen verwenden.
   1. Klicken Sie mit der rechten Maustaste in den Textkörper eines Diagramms, um die Skalierung zu ändern. Verwenden Sie Kontrolltiere, wie z. B. erwachsene Tiere von Tag 1 oder synchronisierte L1s (oder Population von Interesse), um die Auswahl von TOF- und EXT-Gating zu unterstützen.
8. Wählen Sie im Autosampler-Fenster die Option Prime aus. Gehen Sie zu Datei > Skript öffnen, um das richtige integrierte Skript auszuwählen, und klicken Sie dann auf OK.
   1. Wählen Sie das Skript nur für die Analyse mit Acquire aus. Für die Sortierung wählen Sie das Skript mit Dispense aus. Wählen Sie für die Erfassung von 96-Well-Platten das Skript mit 96-Wells aus. Für die Erfassung von 384-Well-Platten wählen Sie das Skript mit 384-Well-Platten aus. Wählen Sie für das Probenvolumen (40 oder 100 μl) das Skript mit dem entsprechenden Volumen aus.
9. Gehen Sie im Menü der Autosampler-Software zu Plattenvorlage , um die gewünschten Wells für die Analyse auszuwählen. Laden Sie die Kontrollproben. Nachdem die Platte auf den Autosampler-Tisch geladen und gesichert wurde, drücken Sie Run Plate im Autosampler-Fenster. Speichern Sie die Datei, wenn Sie dazu aufgefordert werden.
   HINWEIS: Kontrollproben und Einstellungen können mit einem konischen 50-ml-Röhrchen am LPS-Probenanschluss vorgenommen werden, bevor der LP-Sampler angeschlossen wird.
10. Wenn die Erfassung abgeschlossen ist, klicken Sie auf die Schaltfläche Daten speichern im oberen Menüband des LPS-Softwarefensters und speichern Sie die Daten erneut.

5. Analyse der Merkmale von C. elegans und des Darmmikrobioms pro Tier

1. Rohdaten werden in drei Dateitypen gespeichert: .lmd, .bxr3, .txt. Laden Sie die Textdatei mit der Bezeichnung .txt zur Analyse in das R-Programm. Führen Sie die folgenden Schritte in R¹⁹ aus.
2. Verwenden Sie das Paket tidyverse²⁰ als Framework für die Analyse.
3. Mit der ggplot-Funktion (in tidyverse enthalten) werden die LPS-Daten mit den TOF-Werten als x-Achse und den EXT-Werten als y-Achse dargestellt. Ein normales Diagramm zeigt zwei Wolken von Punkten. Stellen Sie sicher, dass sich eines in der Nähe des Ursprungs und der x-Achse befindet, was kleinere Partikel wie Larven und kleine Trümmer anzeigt, und die zweite Gruppe von Partikeln befindet sich oben rechts im Diagramm und stellt erwachsene Nematoden dar.
4. Wählen Sie anhand dieser Gruppierung geeignete TOF- und EXT-Cutoff-Werte aus. Das Gating kann je nach C. elegans-Stämmen auf verschiedenen Mikroben variieren, basierend auf Veränderungen in der Physiologie (z. B. dunkle vs . klare Tiere oder Änderungen in der Eibeförderung können die EXT-Koeffizienten verändern).
5. Verwenden Sie die Funktionsteilmenge, um adulte Tiere und Larven durch TOF- und EXT-Gating zu trennen. Verwenden Sie im folgenden Beispiel die Einstellungen TOF > 1.200 und EXT > 1.000, um das Tor für erwachsene Tiere zu öffnen.
6. Analysieren Sie die resultierenden Datensätze auf statistische Unterschiede. Verwenden Sie die t-test-Funktion in R für dieses Experiment.
   1. Um den Einfluss des Mikrobioms auf die Größe und optische Dichte von C. elegans zu bestimmen, vergleichen Sie die TOF- bzw. EXT-Werte zwischen den Bedingungen. TOF ist ein Indikator für die Wurmgröße und kann Veränderungen in den Wachstumsraten der Tiere zu bestimmten Zeitpunkten anzeigen. EXT-Veränderungen sind aufgrund des von den Eiern gestreuten Lichts zwischen dem Ende der Entwicklung und dem Erwachsenenalter am größten und können verwendet werden, um Veränderungen im Zeitpunkt dieses Übergangs und der Fruchtbarkeit zu beurteilen. Beurteilen Sie den Anteil und die Verteilung der Nachkommen, wenn sie während der Analysen beibehalten wurden.
   2. Um Veränderungen in der Darmmikrobiom-Kolonisierung zu bestimmen, normalisieren Sie zunächst die Fluoreszenzwerte (z. B. rote oder grüne Säulen), indem Sie mit individuellen TOF-Werten für jedes Tier dividieren. Wenn Würmer größer werden und erwachsen werden, wird auch das Volumen ihres Darms größer. Die Normalisierung trägt dazu bei, Artefakte zu reduzieren, die sich aus Unterschieden in der Größenverteilung der Stichprobentiere ergeben. Verwenden Sie normalisierte Tiere, um Veränderungen in der Darmmikrobiom-Kolonisierung unter verschiedenen Bedingungen zu beurteilen.
      HINWEIS: Ein Rohdatenbeispiel und entsprechende R-Skripte finden Sie in der JOVE_worm_microbiome.txt Ergänzungsdatei 1 und der Zusatzdatei 2 JOVE_worm_microbiome.r. In Abbildung 2 und Abbildung 3 finden Sie ein repräsentatives Beispiel für diese Analysen des Wirts und des Mikrobioms mit zwei fluoreszierenden Bakterien.

6. Sortierung von C. elegans-Tieren nach Darmmikrobiommerkmalen

1. Sammeln Sie eine C. elegans-Population , die auf fluoreszenzmarkierten Mikroben gezüchtet wurde (z. B. RFP), wie in Schritt 3 beschrieben. Die Würmer sollten in konische 50-ml-Röhrchen mit mindestens 5 ml Probe gegeben werden. Streben Sie etwa 2.000 Würmer/ml an, einschließlich aller erwachsenen Tiere und Nachkommen.
   HINWEIS: Dies kann auch in einer 96-Well-Platte mit flachem Boden mit dem LP-Sampler erfolgen. Halten Sie die Wurmdichte bei 50–100 pro Well.
   1. Wenn der LP-Sampler verwendet wurde, schalten Sie den LP-Sampler aus und trennen Sie ihn. Schließen Sie die Proben- und Spülleitungen vor dem Sortieren wieder an das LPS an.
2. Öffnen Sie die LPS-Software, gehen Sie zu Datei > neues Experiment und dann zu Datei > neuen Beispiel. Erstellen Sie ein Punktdiagramm mit TOF auf der x-Achse und Extinktion auf der y-Achse. Erstellen Sie ein weiteres Punktdiagramm mit TOF auf der x-Achse und Rot auf der y-Achse. Verwenden Sie den gleichen Achsenmaßstab und die gleichen Lasereinstellungen wie zuvor. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Laser aktivieren, um 488-nm- und 561-nm-Laser einzuschalten
   HINWEIS: Wenn diese Diagramme zuvor erstellt wurden, wechseln Sie zu Datei > Experiment öffnen und Datei > Beispiel öffnen, um Diagramme zu laden.
   1. Setzen Sie das Kontrollprobenröhrchen auf den Probenanschluss. Klicken Sie im Dialogfeld "Erwerben/Ausgeben" auf " Erwerben". Speichern Sie die Datei, wenn Sie dazu aufgefordert werden. Nachdem genügend Würmer gemessen wurden, um Populationen zu unterscheiden, klicken Sie auf Abbrechen.
      HINWEIS: Die Durchflussraten sollten ca. 15–30 Ereignisse/s betragen. Ist dies nicht der Fall, passen Sie die Wurmkonzentrationen an, um sicherzustellen, dass einzelne Tiere pro Tröpfchen analysiert oder sortiert werden. Bei LPS durchlaufen die Schnecken die Bahn des Lasers in verschiedenen Positionen (gerade oder gekrümmt oder gebogen). Sie können je nach Position unterschiedlich lange brauchen, um den Laser und den Detektor zu passieren.
   2. Zeichnen Sie im Punktdiagramm TOF vs. Extinction ein Tor um die erwachsene Population. Im TOF-vs-Rotpunkt-Diagramm zeichnen Sie Tore um die Bereiche mit hohen und niedrigen Rotwerten als Interessensgebiete für erwachsene Würmer mit unterschiedlichem Grad der Mikrobiom-Besiedlung. Wechseln Sie zu Ansicht > Gating-Hierarchie und stellen Sie sicher, dass die fluoreszierenden Gatter unter dem Adult-Population-Gate aufgeführt sind. Nachdem die Einstellungen optimiert wurden, wechseln Sie zu Datei > Experiment speichern und Beispiel > Datei speichern.
      HINWEIS: Wählen Sie im folgenden Beispiel Tiere auf der Grundlage von TOF/EXT-Gattern für Erwachsene aus und sortieren Sie sie in Pools, die entweder eine hohe oder niedrige Besiedlung mit rot fluoreszierenden proteinexprimierenden Bakterien aufweisen. Jede Kombination von Parametern, die vom LPS gemessen werden, kann jedoch verwendet werden, um die interessierende(n) Grundgesamtheit(en) zu identifizieren.
3. Vergewissern Sie sich vor der Sortierung, dass das entsprechende Sammelgerät geladen wurde. Um die 96-Well-Platte in das Entnahmegerät zu laden, wählen Sie im Dialogfeld "Erfassen/Ausgeben" im Abschnitt "Move Stage" die Option Load Plate A > Move aus, damit die Collection Stage in eine Position bewegt werden kann, die für das Laden einer 96-Well-Platte vorbereitet ist.
4. Wählen Sie für die Massensortierung die entsprechende Röhrchengröße aus und klicken Sie auf Verschieben , um entweder ein konisches 15-ml- oder ein 50-ml-Röhrchen zu laden. Wählen Sie im Abschnitt Sortierung des Dialogfelds Erwerben/Ausgeben das Sortiergatter aus der Dropdown-Liste der erstellten Regionen aus. Geben Sie die Anzahl der Objekte aus dem definierten Bereich ein, die in ein Sammelröhrchen direkt unter der Durchflusszellendüse abgegeben werden sollen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Massensortierung im Dialogfeld Erwerben/Ausgeben.
5. Um auf eine 96-Well-Platte zu dosieren, gehen Sie zu Einrichten > Platten > kalibrierte Platten > 96-Well-Platte. Gehen Sie dann zu Ansicht > Plattenvorlage, wählen Sie die Wells aus, in die die Würmer sortiert werden sollen, geben Sie die Anzahl der Objekte ein, die in jede Wells sortiert werden sollen, und wählen Sie die gewünschten Bereiche aus. Wenn mehr als ein abgegrenzter Bereich in dieselbe Platte einsortiert werden soll, aktivieren Sie das Kontrollkästchen Gate Each Well. Klicken Sie auf OK, um die Änderungen zu speichern.
6. Nachdem Sortiernummern und Positionen zugewiesen wurden, klicken Sie im Dialogfeld "Erfassen/Ausgeben" auf die Schaltflächen " Platte füllen ", um die Dosierung auf eine 96-Well-Platte zu starten.
   1. Bevor Sie die gesamte 96-Well-Platte füllen, führen Sie eine Testsortierung einer Untergruppe von Tieren oder Kontrollen in eine 96-Well-Platte durch und analysieren Sie sie mit einem Stereomikroskop, um sicherzustellen, dass die richtige Anzahl und die gewünschten Tierpopulationen sortiert wurden. Sobald die genaue Sortierung bestätigt ist, wiederholen Sie die Schritte 6.3-6.6 für experimentelle Proben. Klicken Sie auf die Schaltfläche Daten speichern im oberen Menüband des LPS-Softwarefensters, um die Daten erneut zu speichern .
      HINWEIS: Alle Messungen (EXT, TOF, RFP, GFP usw.) können auch für sortierte Tiere gesammelt und mit denen verglichen werden, die nicht sortiert wurden. Auf diese Weise können Analyse- und Sortiermodi auf Wunsch gleichzeitig ausgeführt werden.

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Ergebnisse

Definition von adulten und larvenartigen Populationstore
Hier wurden synchronisierte C. elegans L1s auf einer NGM-Platte gezüchtet, die mit E. coli OP50 (Eco), einer Standard-Labordiät, ausgesät war. C. elegans-Populationen wurden für die LPS-Analyse nach 96 h oder 120 h Wachstum bei 20 °C gesammelt (Abbildung 2A). Ein Punktdiagramm der Extinktion (EXT, ein Proxy für die Körperdichte) im Vergleich zur Flugzeit (TOF, ein Proxy für die Kö...

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Diskussion

Die Fließvermimetrie wurde in mehreren Studien verwendet, um die Gene und Signalwege von C. elegans gegen die Kolonisierung und Toxizität von Krankheitserregern zu charakterisieren^21,22. Hier wird ein Hochdurchsatz-Ansatz vorgestellt, der C. elegans verwendet, um zu untersuchen, wie Darmmikrobiome ihre Wirtsphysiologie modulieren. Im Vergleich zu bestehenden Methoden, die koloniebildende Einheiten (KBE) oder 16S rRNA-Amplikon-Sequenzierung

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL conical bottom centrifuge tubes	VWR	10026-076
96 deep-well plates (1 mL)	Axygen	P-DW-11-C
96 deep-well plates (2 mL)	Axygen	P-DW-20-C
96-well Costar plate	Corning	3694
Agar	Millipore Sigma		Standard bacteriology agar is also sufficient.
Aspirating manifold	V&P scientific	VP1171A
Bleach	Clorox
Bleach solution			Mix Bleach with 5M Sodium hypochlorite 2:1 (v/v)
Cell Imaging Multimode Reader	Biotek	Cytation 5	Bacterial OD measurement
Centrifuge	Thermo scientific	Sorvall Legend XTR	For 96 well plate and conical tubes
Fluorescent Microscope	Nikon	TiE
ggplot: Various R Programming Tools for Plotting Data.	R package	Version 3.3.2
Large Particle Autosampler	Union Biometrica	LP Sampler
Large Particle Sorter	Union Biometrica	COPAS Biosorter
Levamisole	Fisher	AC187870100
Lysogeny Broth (LB)	RPI	L24066	Standard LB home-made recipes using Bacto-tryptone, yeast extract, and NaCl are also sufficient.
M9 solution			22 mM KH2PO4 monobasic, 42.3 mM Na2HPO4, 85.6 mM NaCl, 1 mM MgSO4
Nematode Growth Medium	RPI	N81800-1000.0	1 mM CaCl2, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4 added after autoclaving.
RStudio	GNU	Version 1.3.1093
Sodium hypochlorite	Sigma-Aldrich		5M NaOH
Stereo Microscope	Nikon	SMZ745
Sterile 10 cm diameter petri dishes	Corning	351029
Sterile 12-well plates	VWR	10062-894
Sterile 24-well plates	VWR	10062-896
Sterile 6 cm diameter petri dishes	Corning	351007
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787