Aplicação da Vermimetria de Fluxo na Quantificação e Análise do Microbioma Intestinal de Caenorhabditis elegans

Resumo

Caenorhabditis elegans é um modelo poderoso para examinar os determinantes moleculares que conduzem as interações hospedeiro-microbioma. Apresentamos um pipeline de alto rendimento traçando o perfil dos níveis de colonização do microbioma intestinal em um único animal, juntamente com os principais aspectos da fisiologia de C. elegans.

Resumo

A composição do microbioma intestinal pode ter um impacto dramático na fisiologia do hospedeiro ao longo do desenvolvimento e da vida do animal. Medir as mudanças composicionais no microbioma é crucial para identificar as relações funcionais entre essas mudanças fisiológicas. Caenorhabditis elegans emergiu como um poderoso sistema hospedeiro para examinar os drivers moleculares das interações hospedeiro-microbioma. Com seu plano corporal transparente e micróbios naturais marcados com fluorescência, os níveis relativos de micróbios dentro do microbioma intestinal de um animal de C. elegans individual podem ser facilmente quantificados usando um grande classificador de partículas. Aqui descrevemos os procedimentos para o arranjo experimental de um microbioma, coleta e análise de populações de C. elegans no estágio de vida desejado, operação e manutenção do classificador, e análises estatísticas dos conjuntos de dados resultantes. Também discutimos considerações para otimizar as configurações de classificação com base nos micróbios de interesse, o desenvolvimento de estratégias de confinamento eficazes para os estágios de vida de C. elegans e como utilizar as capacidades de classificação para enriquecer as populações animais com base na composição do microbioma intestinal. Exemplos de aplicações potenciais serão apresentados como parte do protocolo, incluindo o potencial de escalabilidade para aplicativos de alto rendimento.

Introdução

A evolução animal está sob constante influência microbiana¹. A partir de diversos micróbios no ambiente, os hospedeiros animais adquirem parceiros específicos² que ampliam as capacidades do hospedeiro e impulsionam sua fisiologia e suscetibilidade a doenças³. Por exemplo, análises metagenômicas do microbioma intestinal descobriram classes metabólicas enriquecidas de genes microbianos que podem conferir maior colheita e armazenamento de energia em camundongos obesos⁴, muitos dos quais também são encontrados no microbioma intestinal humano

Protocolo

1. Preparação da mistura do microbioma

1. Carimbar ou riscar bactérias de um congelador de glicerol em uma placa de caldo de lisogenia (LB), ou meio de crescimento apropriado, e crescer durante a noite a uma temperatura ideal com base em cepas bacterianas de interesse (tipicamente 25 °C para micróbios naturais de C. elegans ).
2. A partir da placa LB, use uma única colônia de cada isolado bacteriano (por exemplo, 12 bactérias da coleção CeMbio) para inocular 800 μL de meio LB em poços separados de uma placa de poço profundo de 1 mL. Incubar durante a noite à temperatura ideal com agitação a 250 rpm.
   NOTA: Este protocolo é oti....

Resultados

Definição de portões populacionais de adultos e larvas
Aqui, C. elegans L1s sincronizados foram cultivados em uma placa NGM semeada com E. coli OP50 (Eco), uma dieta padrão de laboratório. Populações de C. elegans foram coletadas para análise de LPS após 96 h ou 120 h de crescimento a 20 °C (Figura 2A). Um gráfico de pontos de extinção (EXT, um proxy de densidade corporal) versus tempo de voo (TOF, um proxy de comprimento do corpo) .......

Discussão

A vermimetria de fluxo tem sido utilizada para caracterizar genes e vias de C. elegans contra a colonização e toxicidade de patógenos em diversos estudos^21,22. Aqui, uma abordagem de alto rendimento é apresentada que usa C. elegans para investigar como os microbiomas intestinais modulam sua fisiologia hospedeira. Em comparação com os métodos existentes que utilizam unidades formadoras de colônias (UFC) ou sequenciamento do amplicon de 16.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL conical bottom centrifuge tubes	VWR	10026-076
96 deep-well plates (1 mL)	Axygen	P-DW-11-C
96 deep-well plates (2 mL)	Axygen	P-DW-20-C
96-well Costar plate	Corning	3694
Agar	Millipore Sigma		Standard bacteriology agar is also sufficient.
Aspirating manifold	V&P scientific	VP1171A
Bleach	Clorox
Bleach solution			Mix Bleach with 5M Sodium hypochlorite 2:1 (v/v)
Cell Imaging Multimode Reader	Biotek	Cytation 5	Bacterial OD measurement
Centrifuge	Thermo scientific	Sorvall Legend XTR	For 96 well plate and conical tubes
Fluorescent Microscope	Nikon	TiE
ggplot: Various R Programming Tools for Plotting Data.	R package	Version 3.3.2
Large Particle Autosampler	Union Biometrica	LP Sampler
Large Particle Sorter	Union Biometrica	COPAS Biosorter
Levamisole	Fisher	AC187870100
Lysogeny Broth (LB)	RPI	L24066	Standard LB home-made recipes using Bacto-tryptone, yeast extract, and NaCl are also sufficient.
M9 solution			22 mM KH2PO4 monobasic, 42.3 mM Na2HPO4, 85.6 mM NaCl, 1 mM MgSO4
Nematode Growth Medium	RPI	N81800-1000.0	1 mM CaCl2, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4 added after autoclaving.
RStudio	GNU	Version 1.3.1093
Sodium hypochlorite	Sigma-Aldrich		5M NaOH
Stereo Microscope	Nikon	SMZ745
Sterile 10 cm diameter petri dishes	Corning	351029
Sterile 12-well plates	VWR	10062-894
Sterile 24-well plates	VWR	10062-896
Sterile 6 cm diameter petri dishes	Corning	351007
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787