Aplicação da Vermimetria de Fluxo na Quantificação e Análise do Microbioma Intestinal de Caenorhabditis elegans

Resumo

Caenorhabditis elegans é um modelo poderoso para examinar os determinantes moleculares que conduzem as interações hospedeiro-microbioma. Apresentamos um pipeline de alto rendimento traçando o perfil dos níveis de colonização do microbioma intestinal em um único animal, juntamente com os principais aspectos da fisiologia de C. elegans.

Resumo

A composição do microbioma intestinal pode ter um impacto dramático na fisiologia do hospedeiro ao longo do desenvolvimento e da vida do animal. Medir as mudanças composicionais no microbioma é crucial para identificar as relações funcionais entre essas mudanças fisiológicas. Caenorhabditis elegans emergiu como um poderoso sistema hospedeiro para examinar os drivers moleculares das interações hospedeiro-microbioma. Com seu plano corporal transparente e micróbios naturais marcados com fluorescência, os níveis relativos de micróbios dentro do microbioma intestinal de um animal de C. elegans individual podem ser facilmente quantificados usando um grande classificador de partículas. Aqui descrevemos os procedimentos para o arranjo experimental de um microbioma, coleta e análise de populações de C. elegans no estágio de vida desejado, operação e manutenção do classificador, e análises estatísticas dos conjuntos de dados resultantes. Também discutimos considerações para otimizar as configurações de classificação com base nos micróbios de interesse, o desenvolvimento de estratégias de confinamento eficazes para os estágios de vida de C. elegans e como utilizar as capacidades de classificação para enriquecer as populações animais com base na composição do microbioma intestinal. Exemplos de aplicações potenciais serão apresentados como parte do protocolo, incluindo o potencial de escalabilidade para aplicativos de alto rendimento.

Introdução

A evolução animal está sob constante influência microbiana¹. A partir de diversos micróbios no ambiente, os hospedeiros animais adquirem parceiros específicos² que ampliam as capacidades do hospedeiro e impulsionam sua fisiologia e suscetibilidade a doenças³. Por exemplo, análises metagenômicas do microbioma intestinal descobriram classes metabólicas enriquecidas de genes microbianos que podem conferir maior colheita e armazenamento de energia em camundongos obesos⁴, muitos dos quais também são encontrados no microbioma intestinal humano⁵. Ainda há uma grande necessidade de estabelecer relações causais e identificar os determinantes moleculares do impacto do microbioma, embora o progresso tenha sido prejudicado pelas complexidades do microbioma e pela tratabilidade dos sistemas hospedeiros para triagem em larga escala.

O organismo modelo C. elegans fornece uma plataforma para avançar a compreensão molecular das ligações entre o microbioma e a fisiologia do hospedeiro. C. elegans possui 20 células intestinais com camada mucosa e estruturas vilosidades. Essas células são equipadas com abundantes genes quimiorreceptores que detectam produtos microbianos e produzem moléculas antimicrobianas que potencialmente regulam seus colonizadores intestinais ^6,7. Essa biologia conservada de C. elegans levou a um grande número de descobertas na sinalização do hospedeiro que regula micróbios intestinais, incluindo sinalização de insulina, TGF-beta e MAP quinase ^8,9,10.

C. elegans utilizam micróbios como sua dieta para o crescimento durante o desenvolvimento e microbioma como adultos. Com a velhice, alguns micróbios podem se acumular em excesso no lúmen intestinal e a relação hospedeiro-micróbio muda da simbiose para a patogênese¹¹. Em seus habitats naturais, C. elegans encontra uma grande variedade de espécies bacterianas^12,13. O sequenciamento do 16S rDNA a partir de amostras representativas coletadas em habitats naturais (frutos podres, caule de plantas e vetores animais) revelou que o microbioma natural de C. elegans é dominado por quatro filos bacterianos: Proteobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes e Actinobacteria. Dentro dessas divisões encontra-se grande variação na diversidade e riqueza de bactérias com base no habitat^12,13,14,15. Várias comunidades definidas foram estabelecidas, incluindo as coleções de 63 membros (BIGbiome)¹⁶ e 12 membros (CeMbio) representando os principais gêneros de microbioma criados para a comunidade de pesquisa de C. elegans ¹⁷. Tanto os microbiomas quanto as linhagens componentes podem ter um impacto diverso na fisiologia de C. elegans, como tamanho corporal, taxas de crescimento e respostas ao estresse 9,16,17. Esses estudos fornecem recursos e exemplos para estabelecer C. elegans como um modelo para a pesquisa do microbioma.

Aqui é apresentado um fluxo de trabalho baseado em grandes classificadores de partículas (LPS) (Figura 1) que utiliza o sistema C. elegans para medir simultaneamente a composição do microbioma e medidas básicas da fisiologia do hospedeiro em escala populacional. Do lado microbiano, o fluxo de trabalho é adaptável para montar um microbioma definido ou micróbios únicos para testar a robustez e plasticidade da comunidade com interações microbianas crescentes. Do lado do hospedeiro, o fluxo de trabalho permite ensaios de alto rendimento para medir os níveis de colonização de micróbios fluorescentes no microbioma e leitura fisiológica do hospedeiro em termos de desenvolvimento, tamanho do corpo e reprodução. Em conjunto, o modelo do microbioma de C. elegans permite que telas de alto rendimento identifiquem os determinantes metabólicos e genéticos que modulam a fisiologia do hospedeiro.

Protocolo

1. Preparação da mistura do microbioma

1. Carimbar ou riscar bactérias de um congelador de glicerol em uma placa de caldo de lisogenia (LB), ou meio de crescimento apropriado, e crescer durante a noite a uma temperatura ideal com base em cepas bacterianas de interesse (tipicamente 25 °C para micróbios naturais de C. elegans ).
2. A partir da placa LB, use uma única colônia de cada isolado bacteriano (por exemplo, 12 bactérias da coleção CeMbio) para inocular 800 μL de meio LB em poços separados de uma placa de poço profundo de 1 mL. Incubar durante a noite à temperatura ideal com agitação a 250 rpm.
   NOTA: Este protocolo é otimizado para uso com microbiomas naturais definidos (por exemplo, CeMbio), mas pode ser facilmente ajustado para micróbios individuais pelo crescimento sob condições apropriadas ou outros vasos de cultura (tubos).
3. Avaliar o crescimento de cada micróbio por espectrofotometria. Transfira uma alíquota de 20 μL para 80 μL de LB e adicione a solução a uma placa de fundo plano transparente de 96 poços. Meça o OD₆₀₀ em um leitor de placas.
4. Após o crescimento durante a noite, centrifugar a placa de cultura de poço profundo a 4.000 x g por 10 min para pellets de bactérias e remover o sobrenadante por aspiração usando um coletor de aspiração de 96 poços ou pipeta multicanal.
5. Usando valores de OD₆₀₀ , normalize a concentração de cada micróbio para um OD₆₀₀ final de 1,0 usando meio M9 estéril.
6. Se combinar micróbios, determine a quantidade de cultura bacteriana necessária para o experimento e crie uma mistura mestre de microbioma combinando volumes iguais de cada cepa bacteriana em um tubo de tamanho suficiente (por exemplo, tubos de 5 mL ou 15 mL).
7. Detectar 30-50 μL dos micróbios com um OD_{final de 600} de 1,0 no centro de cada placa ou poço contendo ágar meio de crescimento de nematoide (NGM)¹⁸. Permita que o microbioma semeado cresça durante a noite a uma temperatura ideal (25 °C aqui).
   NOTA: Prepare as placas de ágar NGM com antecedência de acordo com as instruções no Wormbook ou usando pó NGM pré-misturado¹⁸. Por exemplo, 3 mL de NGM é adicionado para placas de 12 poços, e 1,5 mL é adicionado para placas de 24 poços.

2. Preparação de C. elegans sincronizados para crescimento no microbioma

1. Cultivar aproximadamente 100 vermes em placas NGM (6 cm de diâmetro) semeadas com Escherichia coli OP50, até que os vermes atinjam a idade adulta gravídica. Para os propósitos deste protocolo, a cepa N2 de C. elegans foi utilizada, embora o protocolo possa ser facilmente adaptado a outras cepas de nematoides.
2. Adicionar 6 mL de tampão M9 (mais 0,01% de triton X-100; M9-TX) para a placa, pipetando para cima e para baixo para lavar aproximadamente 100 vermes adultos gravídicos em um tubo cônico de 15 mL.
3. Prepare a solução de água sanitária recém-feita misturando duas partes de água sanitária com uma parte de NaOH 5 M.
4. Centrifugar os vermes a 3.000 x g por 30 s para peletizar os vermes. Aspirar para reduzir o volume para 4 mL e, em seguida, adicionar 2 mL de solução de água sanitária.
5. Feche bem a tampa e agite o tubo. Monitorar os vermes adultos na solução sob um microscópio estéreo em aumento de 10x. Quando os corpos adultos começam a se separar, normalmente após 3,5 min, pare de tremer e centrífuga a 3.000 x g por 30 s.
6. Aspirar a um volume mínimo com uma pipeta. Ressuspender, centrifugar e aspirar quatro vezes em M9-TX para lavar a água sanitária.
7. Ressuspender em 4-6 mL de M9-TX e colocar o tubo em um rotador durante a noite, permitindo que os ovos eclodam e sincronizem no estágio L1.
8. No dia seguinte, pegue 10 μL de vermes L1 em M9-TX do tubo e solte-os em uma placa de Petri limpa. Conte o número de vermes L1 vivos sob um microscópio estéreo com aumento total de 20x.
9. Com base na densidade L1, pipetar o volume apropriado para soltar ~50 larvas L1 sincronizadas na borda das placas NGM semeadas do microbioma e incubar a 20 °C. Permita que os vermes cresçam até a idade desejada (Dia 2 ou Dia 3 da idade adulta).

3. Coleta de população de vermes para análises do microbioma intestinal

1. Lave os vermes do gramado bacteriano com 1-2 mL de M9-TX para uma placa esterilizada de 2 mL e 96 poços de profundidade.
   NOTA: Para cepas microbianas que criam biofilmes significativos, agite a placa com líquido por 5 minutos para quebrar os detritos microbianos.
2. Centrifugar a placa de poço profundo a 300 x g por 1 min para peletizar os vermes e, em seguida, remover o líquido usando um coletor de aspiração.
   Observação : os usuários podem usar uma pipeta multicanal para remover manualmente o líquido se um coletor de aspiração não estiver disponível. Certifique-se de que as pontas da pipeta não tocam no fundo dos poços para evitar a perda de amostras de minhocas.
3. Adicionar 1,8 mL de M9-TX a cada poço da placa de poço profundo usando uma pipeta multicanal de 1,2 mL. Misture pipetando para cima e para baixo algumas vezes e centrifugando a 300 x g por 1 min. Repita este passo quatro vezes para remover as bactérias no líquido.
4. Após a lavagem final, levar o volume de cada poço para 100 μL usando o coletor aspirador.
   NOTA: Para separar os adultos das larvas usando a gravidade, deixe a placa no banco por 30-60 s, permitindo que os vermes adultos afundem no fundo do poço. Em seguida, aspirar a placa para remover as larvas da suspensão.
5. Adicionar 100 μL de levamisol 10 mM em M9-TX a cada poço e deixar os vermes paralisarem por 5 min. Após o tratamento com levamisol, adicionar 4% da solução de água sanitária descrita na etapa 2.3 a cada poço por 2 minutos para reduzir os aglomerados bacterianos, se necessário. Lavar com M9-TX duas vezes após o tratamento com água sanitária e aspirar até um volume final de 100 μL após a segunda lavagem.
6. Transfira os vermes para uma placa de fundo plano de 96 poços contendo 150 μL de levamisol 10 mM em M9-TX. Mantenha a densidade de vermes em 50-100 por poço e divida as minhocas em vários poços se a população estiver muito lotada.

4. Configuração do classificador de partículas grandes e do amostrador automático

1. Ligue o compressor de ar, o computador e o instrumento LPS. Verifique e esvazie o tanque de resíduos. Em seguida, adicione 500 mL de água sanitária ao tanque de resíduos vazio. Verifique e reabasteça bainha e caixas d'água se o volume estiver baixo. Certifique-se de que o conjunto de núcleo fluídico e óptico (FOCA) de 250 μm esteja no lugar.
2. Execute as partículas de controle para controle de qualidade. Abra o software do instrumento LPS. Na janela do software, marque Ativar lasers para ativar os lasers de 488 nm e 561 nm.
   NOTA: É possível pular as etapas 4.2-4.5 se as partículas de controle tiverem sido executadas nas últimas 2 semanas e o FOCA não tiver sido alterado nesse período.
3. Selecione Configurar > partículas de controle. Selecione Não no prompt para ir para as configurações padrão. Vórtice as partículas controle (10 mL dH,₂O e 10 mL partículas controle em um tubo cônico de 50 mL) antes de cada uso e carregue-as no orifício da amostra.
4. Quando estiver pronto, clique em Adquirir para registrar 500 eventos. Certifique-se de que a taxa de eventos seja lida entre 15 e 30 eventos/s.
   NOTA: Se a taxa de eventos não for de 15 a 30 eventos/s, um engenheiro deverá ser contatado para ajustar as configurações da máquina.
5. Examine o coeficiente de variação (CV) para todos os parâmetros. Se o CV < 15%, o controle de qualidade é passado e o software LPS pode ser fechado. Se CV > 15%, execute novamente e ajuste os micrômetros com partículas de controle recém-feitas para alinhar o laser com a célula de fluxo.
6. Conecte e ative o amostrador automático. Abra o software do instrumento do amostrador automático. Isso abre o amostrador automático e o software LPS. Na janela do software LPS, vá para Arquivo > Novo Experimento e, em seguida, Arquivo > Novo Exemplo. Marque Ativar lasers para ativar lasers de 488 nm e 561 nm, se isso ainda não tiver sido feito.
7. Crie modelos para gráficos de pontos de aquisição usando tempo de voo (TOF), extinção (EXT) e canais fluorescentes na janela do software LPS. Um bom número máximo inicial para capturar todos os vermes é de 8.000 para TOF e EXT. As escalas de fluorescência variam de acordo com cada micróbio. Inclua amostras de vermes de controle cultivadas em micróbios não fluorescentes (por exemplo, OP50) e cada micróbio fluorescente sozinho (se misturar micróbios) como controles em cada experimento.
   1. Clique com o botão direito do mouse no corpo de um gráfico para modificar o dimensionamento. Use animais de controle, como adultos do Dia 1 ou L1s sincronizados (ou população de interesse) para ajudar na seleção de TOF e EXT.
8. Na janela do amostrador automático, selecione Prime. Vá para Arquivo > Script Aberto para selecionar o script interno correto e clique em OK.
   1. Somente para análise, selecione o script com Acquire. Para classificar, selecione o script com Dispense. Para aquisição a partir de placas de 96 poços, selecione o roteiro com 96 poços; Para aquisição de placas de 384 poços, selecione o roteiro com 384 poços. Para o volume da amostra (40 ou 100 μL), selecione o script com o volume correspondente.
9. Vá para Modelo de placa no menu do software do amostrador automático para selecionar os poços desejados para análise. Carregue as amostras de controle. Depois que a placa for carregada no estágio do amostrador automático e protegida, pressione Executar placa na janela do amostrador automático. Salve o arquivo quando solicitado.
   NOTA: As amostras de controle e as configurações podem ser feitas com um tubo cônico de 50 mL na porta de amostra LPS antes de conectar o amostrador LP.
10. Quando a aquisição estiver concluída, clique no botão Armazenar Dados na faixa de opções superior na janela do software LPS e salve os dados novamente.

5. Análise das características de C. elegans e dos níveis de microbioma intestinal por animal

1. Os dados brutos são armazenados em três tipos de arquivo: .lmd, .bxr3 .txt. Carregue o arquivo de texto rotulado .txt arquivo no programa R para análise. Conclua as etapas abaixo na R¹⁹.
2. Use o pacote tidyverse²⁰ como uma estrutura para a análise.
3. Usando a função ggplot (incluída no tidyverse), plote os dados LPS usando os valores TOF como eixo x e valores EXT como eixo y. Um gráfico normal mostrará duas nuvens de pontos. Certifique-se de que um está próximo da origem e do eixo x, indicando partículas menores, como larvas e pequenos detritos, e o segundo grupo de partículas está na parte superior direita da parcela e representa nematoides adultos.
4. Usando esse agrupamento como guia, escolha valores de corte TOF e EXT adequados. O gating pode variar de acordo com as cepas de C. elegans em diferentes micróbios com base em mudanças na fisiologia (por exemplo, animais escuros versus claros ou mudanças no transporte de ovos podem alterar os coeficientes EXT).
5. Use o subconjunto de funções para separar adultos e larvas por TOF e EXT gating. No exemplo aqui, use TOF > 1.200 e EXT > 1.000 configurações para portar para animais adultos.
6. Analisar os conjuntos de dados resultantes para diferenças estatísticas; use a função t-test em R para este experimento.
   1. Para determinar o impacto do microbioma no tamanho e densidade óptica de C. elegans, compare os valores de TOF e EXT, respectivamente, entre as condições. A SQE é uma proxy para o tamanho do verme e pode indicar mudanças nas taxas de crescimento dos animais em momentos específicos. As alterações no EXT são maiores entre o final do desenvolvimento e a idade adulta devido à luz espalhada pelos ovos e podem ser usadas para avaliar mudanças no momento dessa transição e fecundidade. Avaliar a proporção e a distribuição da progênie se elas foram retidas durante as análises.
   2. Para determinar mudanças nos níveis de colonização do microbioma intestinal, primeiro normalize os valores de fluorescência (por exemplo, colunas vermelhas ou verdes) dividindo com valores individuais de TOF para cada animal. À medida que os vermes crescem em tamanho e se tornam adultos, o volume de seu intestino também aumenta. A normalização ajuda a reduzir os artefatos das diferenças nas distribuições de tamanho dos animais da amostra. Use animais normalizados para avaliar mudanças na colonização do microbioma intestinal através das condições.
      Observação : um exemplo de dados brutos e scripts R correspondentes podem ser encontrados no arquivo suplementar 1 JOVE_worm_microbiome.txt e arquivo suplementar 2 JOVE_worm_microbiome.r. Veja a Figura 2 e a Figura 3 para um exemplo representativo dessas análises do hospedeiro e do microbioma usando duas bactérias fluorescentes.

6. Classificação de animais de C. elegans por características do microbioma intestinal

1. Coletar uma população de C. elegans cultivada em micróbios marcados com fluorescência (por exemplo, RFP), conforme descrito na Etapa 3. Os vermes devem ser colocados em tubos cônicos de 50 mL com um mínimo de 5 mL de amostra. Procure aproximadamente 2.000 vermes/mL, incluindo todos os adultos e descendentes.
   NOTA: Isso também pode ser feito em uma placa de fundo plano de 96 poços usando o amostrador LP. Mantenha a densidade de vermes em 50-100 por poço.
   1. Se o amostrador de LP tiver sido usado, desligue e desconecte o amostrador de LP. Reconecte as linhas de amostra e limpeza ao LPS antes de classificar.
2. Abra o software LPS, vá para Arquivo > Novo Experimento e, em seguida, Arquivo > Novo Exemplo. Crie um gráfico de pontos com TOF no eixo x e Extinção no eixo y. Crie outro gráfico de pontos com TOF no eixo x e Vermelho no eixo y. Use a mesma escala de eixo e configurações de laser usadas anteriormente. Marque Ativar lasers para ativar lasers de 488 nm e 561 nm
   Observação : se esses gráficos foram criados anteriormente, vá para arquivo > Abrir experimento e arquivo > abrir amostra para carregar gráficos.
   1. Coloque o tubo de amostra de controle na porta de amostra. Na caixa de diálogo Adquirir/Dispensar, clique em Adquirir. Salve o arquivo quando solicitado. Depois que vermes suficientes tiverem sido medidos para distinguir populações, clique em Abortar.
      NOTA: As taxas de fluxo devem ser de aproximadamente 15 a 30 eventos/s. Caso contrário, ajuste as concentrações de vermes para garantir que os animais individuais sejam analisados ou classificados por gotícula. No LPS, os vermes passam pelo caminho do laser em diferentes posições (reta versus enrolada ou dobrada). Eles podem levar uma quantidade diferente de tempo para passar o laser e o detector, dependendo de suas posições.
   2. No TOF vs Extinction dot plot desenhe um portão em torno da população adulta. No TOF vs Red dot plot desenhamos portões ao redor das áreas com altos e baixos valores vermelhos como regiões de interesse para vermes adultos com diferentes níveis de colonização do microbioma. Vá para Exibir > hierarquia de gating e verifique se os portões fluorescentes estão listados sob o portão da população adulta. Depois que as configurações forem otimizadas, vá para Arquivo > Salvar Experimento e Arquivo > Salvar Amostra.
      NOTA: No exemplo aqui, selecione animais com base em portões TOF/EXT para adultos e classifique em pools que exibem alta ou baixa colonização por bactérias que expressam proteínas fluorescentes vermelhas. No entanto, qualquer combinação de parâmetros medidos pelo LPS pode ser usada para identificar a(s) população(s) de interesse.
3. Antes da triagem, certifique-se de que o aparelho de recolha adequado foi carregado. Para carregar a placa de 96 poços no aparelho de coleta, selecione Carregar placa A > Mover na seção Mover estágio na caixa de diálogo Adquirir/Dispensar para permitir que o estágio de coleta se mova para uma posição preparada para carregar uma placa de 96 poços.
4. Para classificação em massa, selecione o tamanho apropriado do tubo e clique em Mover para carregar um tubo cônico de 15 mL ou 50 mL. Na seção Classificação da caixa de diálogo Adquirir/Dispensar, escolha o portão de classificação na lista suspensa das regiões criadas. Insira o número de objetos da região definida para dispensar em um tubo de coleta diretamente abaixo do bocal da célula de fluxo. Clique no botão Classificação em massa na caixa de diálogo Adquirir/Dispensar.
5. Para dispensar uma placa de 96 poços, vá para Configurar placas > > placas calibradas > placa de 96 poços. Em seguida, vá para Exibir > modelo de placa, selecione os poços para os quais os vermes serão classificados, insira o número de objetos a serem classificados em cada poço e selecione as regiões fechadas de interesse. Se mais de uma região fechada for classificada na mesma placa, marque a caixa Portar cada poço. Clique em OK para salvar as alterações.
6. Depois que os números e locais de classificação tiverem sido atribuídos, clique nos botões Preencher placa na caixa de diálogo Adquirir/Dispensar para iniciar a distribuição em uma placa de 96 poços.
   1. Antes de encher toda a placa de 96 poços, realize a triagem de teste de um subconjunto de animais ou controles em uma placa de 96 poços e analise usando um estereomicroscópio para garantir que o número apropriado e as populações de animais desejadas tenham sido classificados. Uma vez confirmada a classificação precisa, repita as etapas 6.3-6.6 para amostras experimentais. Clique no botão Armazenar Dados na faixa de opções superior na janela do software LPS para salvar os dados novamente.
      NOTA: Todas as medidas (EXT, TOF, RFP, GFP, etc.) também podem ser coletadas para animais classificados e comparadas com aquelas que não foram classificadas. Isso pode permitir que os modos de análise e classificação sejam executados ao mesmo tempo, se desejado.

Resultados

Definição de portões populacionais de adultos e larvas
Aqui, C. elegans L1s sincronizados foram cultivados em uma placa NGM semeada com E. coli OP50 (Eco), uma dieta padrão de laboratório. Populações de C. elegans foram coletadas para análise de LPS após 96 h ou 120 h de crescimento a 20 °C (Figura 2A). Um gráfico de pontos de extinção (EXT, um proxy de densidade corporal) versus tempo de voo (TOF, um proxy de comprimento do corpo) ...

Discussão

A vermimetria de fluxo tem sido utilizada para caracterizar genes e vias de C. elegans contra a colonização e toxicidade de patógenos em diversos estudos^21,22. Aqui, uma abordagem de alto rendimento é apresentada que usa C. elegans para investigar como os microbiomas intestinais modulam sua fisiologia hospedeira. Em comparação com os métodos existentes que utilizam unidades formadoras de colônias (UFC) ou sequenciamento do amplicon de 16...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL conical bottom centrifuge tubes	VWR	10026-076
96 deep-well plates (1 mL)	Axygen	P-DW-11-C
96 deep-well plates (2 mL)	Axygen	P-DW-20-C
96-well Costar plate	Corning	3694
Agar	Millipore Sigma		Standard bacteriology agar is also sufficient.
Aspirating manifold	V&P scientific	VP1171A
Bleach	Clorox
Bleach solution			Mix Bleach with 5M Sodium hypochlorite 2:1 (v/v)
Cell Imaging Multimode Reader	Biotek	Cytation 5	Bacterial OD measurement
Centrifuge	Thermo scientific	Sorvall Legend XTR	For 96 well plate and conical tubes
Fluorescent Microscope	Nikon	TiE
ggplot: Various R Programming Tools for Plotting Data.	R package	Version 3.3.2
Large Particle Autosampler	Union Biometrica	LP Sampler
Large Particle Sorter	Union Biometrica	COPAS Biosorter
Levamisole	Fisher	AC187870100
Lysogeny Broth (LB)	RPI	L24066	Standard LB home-made recipes using Bacto-tryptone, yeast extract, and NaCl are also sufficient.
M9 solution			22 mM KH2PO4 monobasic, 42.3 mM Na2HPO4, 85.6 mM NaCl, 1 mM MgSO4
Nematode Growth Medium	RPI	N81800-1000.0	1 mM CaCl2, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4 added after autoclaving.
RStudio	GNU	Version 1.3.1093
Sodium hypochlorite	Sigma-Aldrich		5M NaOH
Stereo Microscope	Nikon	SMZ745
Sterile 10 cm diameter petri dishes	Corning	351029
Sterile 12-well plates	VWR	10062-894
Sterile 24-well plates	VWR	10062-896
Sterile 6 cm diameter petri dishes	Corning	351007
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787