Sıvı Kromatografisi-Tandem Kütle Spektrometrisi ile Gözyaşı Proteomiği için Bir Protein Süspansiyonu-Tutucu Numune Hazırlama

Özet

Bu protokol, Schirmer şeritlerini kullanarak gözyaşı örneklerini toplamak için bir yöntemi ve non-invaziv gözyaşı proteini biyobelirteçlerini keşfetmek için entegre bir kantitatif iş akışını açıklar. Süspansiyon yakalama numunesi hazırlama iş akışı, hızlı ve sağlam gözyaşı numunesi hazırlama ve kütle spektrometrik analizine olanak tanıyarak standart çözelti içi prosedürlere göre daha yüksek peptit geri kazanım verimi ve protein tanımlaması sağlar.

Özet

Gözyaşı sıvısı, non-invaziv olarak toplanabilen, kolay erişilebilir biyosıvılardan biridir. Gözyaşı proteomikleri, çeşitli oküler hastalıklar ve durumlar için biyobelirteçleri keşfetme potansiyeline sahiptir. Süspansiyon yakalama kolonunun, aşağı akış proteomik analizinin geniş uygulaması için verimli ve kullanıcı dostu bir numune hazırlama iş akışı olduğu bildirilmiştir. Ancak, bu strateji insan gözyaşı proteomunun analizinde iyi çalışılmamıştır. Mevcut protokol, biyoinformatik analizle birleştirildiğinde hastalık biyobelirteçleri ve izleme hakkında bilgi sağlayan kütle spektrometrisi kullanılarak non-invaziv gözyaşı proteini biyobelirteç araştırması için klinik insan gözyaşı örneklerinden saflaştırılmış peptitlere kadar entegre bir iş akışını açıklamaktadır. Bir protein süspansiyonu yakalama numune preparatı uygulandı ve insan gözyaşı sıvısı analizi için evrensel, optimize edilmiş bir numune preparatı olarak hızlı, tekrarlanabilir ve kullanıcı dostu prosedürlerle gözyaşı proteomunun keşfi gösterildi. Özellikle, süspansiyon yakalama prosedürü, peptit geri kazanımı, protein tanımlaması ve daha kısa numune hazırlama süresi açısından çözelti içi numune hazırlamadan daha iyi performans gösterdi.

Giriş

Gözyaşı proteomikleri, oküler ve sistemik durumun patogenezine erişmek ve ayrıca Schirmer şeritleri kullanılarak non-invaziv gözyaşı örneği toplamanın avantajından yararlanmak için^oküler hastalıklar ve durumlar 1,2,3,4,5,6 için potansiyel biyobelirteçleri keşfetmeye dikkat çekmiştir. Yeni nesil kütle spektrometrisinin teknolojik ilerlemesi, mikrolitre ölçekli gözyaşlarında geçmişte mümkün olmayan doğruluk ve hassasiyetle protein miktar tayinini mümkün kılmıştır. Numune hazırlama yöntemleri henüz standartlaştırılmamıştır. Gözyaşı proteini biyobelirteç araştırmalarında klinik uygulamanın başarısı için sağlam ve standartlaştırılmış bir numune hazırlama iş akışı şarttır. Süspansiyon yakalama (S-Trap) numune hazırlama iş akışı, yakın zamanda geniş aşağı akış proteomik analizi için etkili ve hassas bir numune hazırlama yöntemi olarak rapor edilmiştir ^7,8. Yine de, bu strateji, insan gözyaşı proteomunun analizinde iyi rapor edilmemiştir, enzimatik sindirim etkinliği ve kütle spektrometrik analizi ile daha fazla sayıda protein tanımlaması açısından filtre destekli numune hazırlama (FASP) ve çözelti içi sindirimden daha iyi performans göstermiştir⁹. S-Trap tabanlı yaklaşım, retina dokusu 10, formalinle sabitlenmiş, parafine gömülü (FFPE) doku 11, hücreler 12, mikroorganizma¹³ ve sıvı biyopsilerin^14,15 hazırlanmasında gösterilmiştir.

Bu protokol, hızlı, tekrarlanabilir ve sağlam bir teknik stratejiye sahip non-invaziv bir gözyaşı proteini biyobelirteç panelinin keşfi için klinik örneklerden enzimatik olarak sindirilmiş proteine kadar entegre bir nicel iş akışını tanımlar. Kısaca, gözyaşı sıvısı standart bir Schirmer şeridi kullanılarak toplandı ve oda sıcaklığında protein otolizini önlemek için hemen oftalmik bir çerçeve ısıtıcısı ile kurutuldu. Gömülü toplam proteinler, üreticinin önerisine göre% 5 sodyum dodesil sülfat (SDS) lizis tamponu kullanılarak ekstrakte edildi ve ardından protein tahlili ölçümü yapıldı. Ekstrakte edilen lizat daha sonra ditiyotreitol (DTT) ile standart indirgeme ve iyodoasetamid (IAA) ile alkilasyona tabi tutuldu.

Fosforik asit ile asitleştirildikten sonra, agrega proteinlerine %90 metanol ve 100 mM trietilamonyum bikarbonat (TEAB) içeren süspansiyon tutucu kolon protein çökeltme tamponu ilave edildi. Numune daha sonra yeni bir süspansiyon tutucu mikro kolona aktarıldı. 1 saat boyunca 47 ° C'de 1:25 oranında (a/a, tripsin: protein) sıralama dereceli tripsin ile yapılan enzimatik sindirim. Elde edilen peptitler daha sonra santrifüjleme yoluyla, sırayla 50 mM TEAB, %0.2 sulu formik asit (FA) ve %0.2 FA içeren %50 asetonitril (ACN) ile ayrıştırıldı. Ayrıştırılan peptitler vakumla kurutuldu ve% 0.1 FA'da sulandırıldı. Peptit konsantrasyonu ölçüldü ve kütle spektrometrik analizi için 0.5 μg/μL'ye ayarlandı.

Protokol

Denekler çalışmaya katılmadan önce yazılı bilgilendirilmiş onam verdiler. Çalışma, Hong Kong Politeknik Üniversitesi İnsan Etik Komitesi tarafından onaylandı ve Helsinki Bildirgesi'nin ilkelerine bağlı kaldı.

1. İnsan gözyaşı sıvısının Schirmer şeridi ile toplanması

1. Numune kontaminasyonunu önlemek için eldiven giyin ve sterilize edin.
2. İç ambalajın sağlam, steril ve son kullanma tarihinin geçmemiş olduğunu kontrol edin.
3. Schirmer şeridinin üst kısmını, şeridin yarım daire ucunun yanında gösterildiği gibi 0 mm işaretinde hafifçe içe doğru bükün (Şekil 1).
4. Şeridin ucunu tutarak şeridi iç ambalajdan çıkarın ve 0 ila 25 mm arasındaki numune toplama alanıyla doğrudan temastan kaçının.
5. Denekten yerleştirilecek şeridin konumundan başka bir yere bakmasını isteyin.
6. Alt göz kapağını yavaşça aşağı çekin ve şeridin ucunu lateral kantus bölgesinin yakınındaki alt fornikse asın (Şekil 2). Aynı işlemi diğer gözde de tekrarlayın.
7. Tahrişi en aza indirmek için denekten göz kapaklarını nazikçe kapatmasını isteyin.
8. Yaklaşık 5 dakika boyunca gözyaşı sıvısı toplandı veya tercihen 15-20 mm gözyaşı örneği alındı.
9. Denekten her iki gözünü de açmasını, alt göz kapağını nazikçe aşağı çekmesini ve şeritleri konudan çıkarmasını isteyin.
10. Schirmer şeridindeki hidratlı uzunluğu inceleyin ve toplanan miktarı mm cinsinden kaydedin.
11. Sıvı tamamen kuruyana kadar şeridi standart, temiz bir çerçeve ısıtıcısıyla kurutun.
    NOT: Filtre kağıdını kömürleştirebilecek aşırı ısınmadan kaçınılmalıdır.
12. Her kurutulmuş Schirmer şeridini etiketli bir kriyotüpe yerleştirin ve daha fazla işleme kadar tercihen karanlıkta serin ve kuru bir yerde saklayın.

2. Kimyasalların ve reaktiflerin hazırlanması

1. Lizis Tamponu (%5 SDS, 50 mM TEAB, pH 7.5), 20 mL
   1. 1 mL 1 M TEAB ve 80 μL %12 fosforik asit pipetleyin. Kabarcıkları çıkarmak için kısaca girdap ve sonikate. Deiyonize su ile 20 mL'ye kadar doldurun.
   2. 1 g SDS tartın ve çözünene kadar salınımlı çözeltiye ekleyin.
2. Protein Çökeltme Tamponu (%90 metanol, 100 mM TEAB, pH 7.1), 10 mL
   1. 893 μL 1 M TEAB ve 92 μL deiyonize su ekleyin.
   2. Çözeltiye ağırlıkça 15 μL %85 fosforik asit ve 9 mL metanol ekleyin ve kısaca girdap yapın.
3. Sindirim Tamponu (50 mM TEAB), 1 mL
   1. 50 μL 1 M TEAB ekleyin ve 1 mL'ye kadar deiyonize su ekleyin.
4. 200 mM ditiyotreitol (DTT) çözeltisi, 500 μL
   1. 15 mg DTT tartılır ve 500 μL deiyonize suda çözülür; kısaca girdap.
      NOT: Kullanmadan önce hazırlayın.
5. 400 mM iyodoasetamid (IAA) çözeltisi, 200 μL
   1. 15 mg IAA ağırlığında ve 200 μL deiyonize suda çözülür; kısaca girdap. NOT: Kullanmadan önce hazırlayın ve ışıktan kaçının.
6. %0,2 formik asit, %50 asetonitril, 10 mL
   1. Deiyonize suda 10 mL %50 asetonitril hazırlayın.
   2. 20 μL formik asit ekleyin ve kısaca girdap yapın.
7. % 0.2 formik asit çözeltisi, 10 mL
   1. 10 mL deiyonize suya 20 μL formik asit ekleyin ve kısaca girdap yapın.
8. % 0.1 formik asit çözeltisi, 10 mL
   1. 10 mL deiyonize suya 10 μL formik asit ekleyin; kısaca girdap.

3. Schirmer şeridinde protein ekstraksiyonu

1. Konjonktival dokuların temiz paslanmaz çelik makasla temasından kaynaklanan olası kontaminasyonu gidermek için ön ucu şeridin 0 mm işaretinin ötesinde kesin ve atın.
2. Şeridi 1 mm aralıklarla 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne kesin (Şekil 3).
3. Mikrosantrifüj tüpüne 100 μL lizis tamponu ekleyin ve bir termomikserde 1 saat oda sıcaklığında 1.000 rpm'de girdap yapın.
4. Kısa bir süre santrifüjleyin ve süpernatanı yeni bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
5. Şeritleri temiz forseps kullanarak 200 μL'lik pipet uçlarına taşıyın. Uçları tutucu ile adım 3.4'ten itibaren aynı tüpe yerleştirin ve şerit üzerinde kalan numunenin maksimum geri kazanımı için 4.000 × g'da oda sıcaklığında 1 dakika daha santrifüjleyin.
6. Bikinkoninik asit (BCA) veya uyumlu protein tahlili kullanarak protein konsantrasyonunu ölçün.

4. Süspansiyon tutucu numune hazırlama

1. Protein tahlili sonucuna göre numuneleri 50 μg proteine normalleştirin.
2. 20 mM DTT'lik bir nihai konsantrasyona 1:10 oranında 200 mM DTT (v/h, DTT: numune) ekleyin ve 95 °C'de 10 dakika inkübe edin.
3. Protein çözeltisini oda sıcaklığına soğutun.
4. 40 mM IAA'lık bir nihai konsantrasyona 1:10 oranında (h/h, IAA: numune) 400 mM IAA ekleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
5. %1.2 fosforik asidin nihai konsantrasyonuna 1:10 (h/h, asit: numune) oranında %12 sulu fosforik asit ekleyin ve kısaca girdap yapın.
6. 1:6 oranında protein bağlayıcı tampon ekleyin (v/h, örnek: tampon) ve kısaca girdap yapın.
   NOT: Bu adımda, kolloidal protein partikülü oluşturulmalıdır ve protein miktarı yeterliyse çözelti yarı saydam görünecektir.
7. Süspansiyon Tutucu Mikro Döndürme Kolonu kapağını açın ve akışı toplamak için döndürme kolonunu 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne monte edin.
8. Kolona 200 μL'ye kadar asitlendirilmiş protein lizat karışımı ekleyin.
9. Kolonu 20 saniye boyunca 4.000 × g'da santrifüjleyin. Protein partikülleri hapsedildi; Örnekler sütuna yüklenene kadar tekrarlayın.
10. 150 μL protein bağlayıcı tampon ekleyin ve askıdaki proteini yıkamak için 20 saniye boyunca 4.000 × g'da santrifüjleyin. 3x tekrarlayın.
11. Süspansiyon Tutucu Mikro Kolonu yeni bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne monte edin.
12. Spin kolonunun içindeki filtreye 1:25 oranında proteaz içeren 20 μL 50mM TEAB sindirim tamponu ekleyin (a/a, tripsin: protein) filtre ile sindirim solüsyonu arasındaki kabarcıkları ve hava boşluğunu önleyin.
13. Buharlaşmayı önlemek için Süspansiyon Tutucu Mikro Döndürme Sütununu kapatın. Bir termomikserde 47 °C'de 1 saat inkübe edin; Sindirim sırasında sallamayın veya girdap yapmayın.
14. 20 saniye boyunca 4.000 × g'da merkezkaç kuvveti ile 40 μL 50 mM TEAB ile elute peptitler.
15. 40 μL% 0.2 FA ekleyin ve 20 saniye boyunca 4.000 × g'da santrifüjleyin.
16. 35 μL %0.2 FA, %50 asetonitril ekleyin ve 20 saniye boyunca 4.000 × g'da santrifüjleyin.
17. Havuz üç elüasyon yapar ve bir vakum santrifüjü ile kurutur.
18. Daha fazla analize kadar -80 °C ultra düşük sıcaklıktaki dondurucuda saklayın. NOT: Protokol burada duraklatılabilir.

5. Kütle spektrometrisi analizi için peptitleri sulandırın

1. Numuneyi 12 μL% 0.1 FA, vorteks ve santrifüj ile kısaca sulandırın.
2. Peptit konsantrasyonunu bir Peptit Test Kiti ile ölçün.
3. Peptit konsantrasyonunu% 0.1 FA'da 0.5 μg / μL'ye normalleştirin.
4. Peptit karışımını bir otomatik örnekleyici şişesine aktarın ve kütle spektrometrisi analizi için hazır hale getirin.

6. Sıvı Kromatografisi-Tandem Kütle Spektrometrisi ile Numune Alımı

1. İzokratik yükleme tamponu (% 0.1 FA,% 5 ACN) ile 3 μg peptidi, 15 dakika boyunca 2 μL / dak'lık bir akış hızında bir tuzak kolonuna (C18, 5 μm, 100 μm, 20 mm) yükleyin.
2. Peptitleri, 155 dakikalık bir ayırma gradyanında 350 nL / dak'lık bir akış hızında ters fazlı bir nano analitik kolon (C18, 5 μm, 100 μm, 300 mm) kullanarak fraksiyonlayın. Suda %0,1 formik asit (h/v), %5 ACN (h/v) karışımından oluşan mobil faz A ve suda %0,1 FA (h/v), %98 ACN (h/v) içeren mobil faz B kullanın. Aşağıdaki gradyanı kullanın: 0-0,5 dk: %5 B, 0,5-90 dk: %10 B, 90-120 dk: %20 B, 120-130 dk: %28 B, 130-135 dk: %45 B, 135-141 dk: %80 B, 141-155 dk: %5 B.
3. 350 ila 1800 m/z arasında bir TOF-MS tarama aralığıyla, 250 ms'lik bir biriktirme süresi ve 18 s'lik bir dinamik hedef dışlama süresiyle veriye bağlı toplama (DDA) gerçekleştirin. Ardından, +2 ila +4 arasında bir şarj durumuna sahip MS/MS sinyali için 125 cps eşiği ile döngü başına ilk 50 öncü için 50 ms'lik bir biriktirme süresiyle yüksek hassasiyet modunda 100 ila 1.800 m/z'de bir MS/MS taraması gerçekleştirin.
4. Ham verileri, referans verilen yazılımla veya diğer uyumlu motorlarla genel olarak erişilebilen UniProt veritabanından FASTA'daki bir referans veritabanıyla analiz edin.

Tartışmalar

Bu yöntemi kullanarak doğru sonuçlar elde etmek için, numune kontaminasyonunu önlemek için gözyaşı numunesi alımından tüm prosedürlerde elektriksiz tek kullanımlık eldivenler giyilmelidir. Mikro eğirme kolonları kullanarak her adımda filtre ve numune çözeltisi arasında kabarcık ve hava boşluklarından kaçınmak önemlidir. Numune hacmi kolonların kapasitesinden büyükse, işlemin tekrarlanması önerilir. Bu protokolün, hazırlık süresi, protein geri kazanımı ve toplam protein tanımlaması açısından geleneksel çözelti içi protokolden daha verimli olduğu kanıtlanmıştır. Bunun nedeni, büyük ölçüde, aseton çökeltme, sindirim ve temizleme (tuzdan arındırma) gibi birden fazla aktarım adımını içeren çözelti içi yöntemin aksine, numunelerin aynı kolon üzerinde gerekli prosedürlerin çoğundan geçmesidir ve bu da elde edilen verilerde değişiklik olasılığını artırır.

Mikrokapiler yöntem^16,17 ile toplanan gözyaşı örneklerine ek olarak^, süspansiyon tutuculu mikro kolonlu bu FASP iş akışı, minimum malzeme hazırlığı ve izlenecek kullanıcı dostu adımlarla Schirmer şeritleri kullanılarak toplanan gözyaşı numunesi hazırlığına hızlı ve sağlam bir şekilde olanak tanıyan alternatif bir numune hazırlama yöntemi sağlar. Bu, çözelti içi prosedürler üzerinde MS tarafından geliştirilmiş peptit geri kazanımı ve protein tanımlaması ile çoklu oküler hastalıklar veya durumlar arasında büyük kohort çalışmaları için tekrarlanabilir gözyaşı örneği hazırlanmasına izin verir. Bu güvenilir süreç, araştırma ve diğer klinik amaçlar için gözyaşı biyobelirteç örneklerinin hazırlanmasında düzenli olarak kullanılabilir. En önemlisi, yerinde toplama için minimum personel eğitimi gerektirir ve numunelerin dondurucuda saklanması ihtiyacını ortadan kaldırır. Protein otolizini ve bozulmasını en aza indirmek için numuneler yerinde kurutulur. Bu nedenle, bu, mikro kılcal tüplerin kullanılmasının aksine, aşağı akış analizini kolaylaştırmak için posta yoluyla uygun sevkiyata izin verir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
9 mm Plastic Screw Thread Vials	Thermo Scientific	C4000-11
Acetonitrile, LCMS Grade	Anaqua	AC-1026
Centrifuge MiniSpin plus	Eppendorf	5453000097
DL-dithiothreitol (DTT), BioUltra	Sigma-Aldrich	43815
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL	Eppendorf	30120086
Formic acid, ACS reagent, ≥96%	Sigma-Aldrich	695076
Frame Heater OPTIMONSUN Electronic	Breitfeld & Schliekert GmbH	1203166
Iodoacetamide (IAA), BioUltra	Sigma-Aldrich	I1149
Methanol, HPLC Grade	Anaqua	MA-1292
Nunc Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes, 2 mL	Thermo Fisher Scientific	368632
Phosphoric acid, 85 wt.% in H2O	Sigma-Aldrich	345245
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay	Thermo Fisher Scientific	23275
Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	A53225
Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry	Sciex	TripleTOF 6600
Schirmer Ophthalmic Strips	Entod Research Cell UK Ltd	I-DEW Tearstrips
S-Trap Micro Column	Protifi	C02-micro-80
SureSTART 9 mm Screw Caps	Thermo Scientific	CHSC9-40
Triethylammonium bicarbonate (TEAB), 1 M	Sigma-Aldrich	18597
Ultra-performance Liquid Chromatography	Eksigent	NanoLC 400
UltraPure Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Thermo Fisher Scientific	15525017