JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, yaşam boyu fizyolojik parametre takibi ve floresan ölçümü için katı ortam üzerinde izole edilmiş bireysel nematodların kültürlenmesine yönelik bir protokol sunuyoruz. Bu kültür sistemi, hayvanların kaçmasını önlemek için tek solucan kuyularının etrafında bir palmitik asit bariyeri içerir ve patojenik bakteriler ve kimyasal stresörler de dahil olmak üzere önleyici müdahalelerin kullanılmasına izin verir.

Özet

Caenorhabditis elegans yaşlanma biyolojisini incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. C. elegans yaşlanma çalışmalarındaki standart uygulama, solucan gruplarının katı nematod büyüme ortamı (NGM) üzerinde kültürlenmesi, hayatta kalma ve diğer fizyolojik fenotipler için popülasyon düzeyinde verilerin verimli bir şekilde toplanmasına ve floresan biyobelirteç niceliği için alt popülasyonların periyodik olarak örneklenmesine izin vermektir. Bu yaklaşımın sınırlamaları, (1) ilgilenilen fenotipler için yaş yörüngeleri geliştirmek üzere zaman içinde bireysel solucanları takip edememe ve (2) floresan biyobelirteçleri doğrudan kültür ortamı bağlamında izleyememedir. Alternatif kültür yaklaşımları, bireysel hayvanları zaman içinde izlemek için sıvı kültür veya mikroakışkanlar kullanır, bazı durumlarda floresan niceliği de dahil olmak üzere, kültür ortamının katı NGM'den bağlamsal olarak farklı olduğu ödünleşimi ile. WorMotel, katı NGM üzerinde izole solucanların kültürlenmesi için daha önce tarif edilmiş mikrofabrikasyon çok kuyucuklu bir cihazdır. Her solucan, C. elegans için bir temas kovucu olan bakır sülfatla doldurulmuş bir hendekle çevrili katı NGM içeren bir kuyuda tutulur ve bireysel hayvanların uzunlamasına izlenmesini sağlar. Bakır sülfatın, diyet kısıtlaması, patojenik bakteriler ve hücresel strese neden olan kimyasal ajanlar da dahil olmak üzere yaşlanma araştırmalarında yaygın olan engelleyici müdahalelere maruz kaldıklarında solucanların kaçmasını önlemek için yetersiz buluyoruz. Çok kuyucuklu cihazlar ayrıca floresan görüntülemede yüksek arka plan artefaktları üreten polidimetilsiloksandan kalıplanmıştır. Bu protokol, orijinal olarak insan lökosit antijeni (HLA) tiplemesi için tasarlanmış, yaşam süresi boyunca hayatta kalma, fizyolojik fenotipler ve floresan ölçümüne izin veren, ticari olarak temin edilebilen polistiren mikrotrayları kullanarak katı NGM üzerinde izole yuvarlak kurtların kültürlenmesi için yeni bir yaklaşımı açıklamaktadır. Bir palmitik asit bariyeri, engelleyici koşulların varlığında bile solucanların kaçmasını önler. Her plaka 96 hayvana kadar kültür yapabilir ve diyet kısıtlaması, RNAi ve kimyasal katkı maddeleri dahil olmak üzere çeşitli koşullara kolayca adapte olur ve kullanım ömrü ve aktivite verilerini toplamak için otomatik sistemlerle uyumludur.

Giriş

C. elegans, genetik, hücresel biyoloji ve moleküler biyoloji araştırmaları için güçlü bir model organizmadır, çünkü laboratuvarda kolayca kültürlenirler, kısa bir üretim süresine ve ömrüne sahiptirler, memelilerle yüksek derecede protein homolojisini paylaşırlar ve floresan proteinlerin ve boyaların in vivo görselleştirilmesine izin veren şeffaf bir vücut yapısına sahiptirler1. C. elegans'ın gelişim biyolojisi ve yaşlanma da dahil olmak üzere bir dizi alanda büyük bir model sistem olarak uzun süredir kullanılmasının bir sonucu olarak, büyüme ve gelişmeleri iyi anlaşılmış, genomları tamamen sıralanmış ve genom çapında RNAi besleme kütüphaneleri ve binlerce mutant ve transgenik suş da dahil olmak üzere bir dizi güçlü genetik araç yaratılmıştır. Tarihsel olarak, C. elegans katı agar nematod büyüme ortamı (NGM) üzerinde popülasyonlar olarak yetiştirilir ve fenotipler doğrudan gözlem veya görüntüleme ve aşağı akış analizi ile manuel olarak değerlendirilir. Floresan mikroskopi, bireysel C. elegans'ta boyalar veya transjenik olarak eksprese edilmiş floresan etiketleri kullanarak çeşitli moleküler fenotipleri yakalamak için kullanılır.Floresan görüntüleme tipik olarak, bir hayvanı invaziv ve genellikle ölümcül olan ince agaroz pedleri içeren slaytlara sabitlemeyi veya felç etmeyi içerir. Ayrıca, levamisol veya sodyum azid gibi kimyasalların kullanımını da içerir ve bu da potansiyel olarak ilgilenilen moleküler sürece müdahale edebilir 2,3. Birlikte, bu yaklaşımlar kesitsel, popülasyon düzeyinde verilerin geniş bir fenotip yelpazesinde toplanmasına izin verir, ancak zaman içinde bireysel hayvanların izlenmesine izin vermez.

Son yıllarda, izole C. elegans'ı yetiştirmek için çeşitli yaklaşımlar ortaya çıkmış ve araştırmacıların yeni görüntüleme teknolojilerini kullanarak zaman içinde hayvanların fizyolojik ve moleküler fenotiplerindeki dinamik değişiklikleri yakalamalarına olanak sağlamıştır. C. elegans kültür yaklaşımının bir kategorisi, WormFarm4, Nemalife çip5 ve Chronis ve ark.6'nın 'davranış' çipi de dahil olmak üzere mikroakışkan cihazlardırve diğerleri 7,8,9'dur. Bunlarla ilgili olarak, zaman içinde bireysel solucanları veya küçük popülasyonları karakterize etmek için çok kuyucuklu plakalar kullanan sıvı bazlı kültür yöntemlerivardır 10,11. Mikroakışkanlar ve mikroplaka sistemleri, C. elegans'taki fenotipik tepkilerin tek bir hayvana kadar mükemmel nicel ölçümlerini sağlar, ancak kültür ortamı önemli bir sınırlama sunar. C. elegans'ta, özellikle yaşlanma alanında, geçmiş araştırmaların büyük çoğunluğu, katı agar bazlı medya üzerinde tamamlanmıştır. Sıvı kültür, C. elegans'ın sürekli yüzmesine neden olur ve altta yatan biyolojiyi değiştirebilecek farklı bir çevresel bağlamı temsil eder. Örneğin, sıvı ortamda kültürlenen hayvanlar, agar bazlı katı NGM12,13 üzerinde kültürlenen hayvanlara göre, yağ içeriğini ve gen ekspresyonunu - özellikle stres tepkisinde yer alan genler için - büyük ölçüde değiştirmiştir. Tek hayvanlı görüntüleme yöntemlerinin alternatif bir kategorisi, Petri plakaları üzerindeki grup kültüründe katı NGM üzerinde kültürlenen solucanların yaşadığı standart ortamı daha yakından taklit etmek amacıyla, katı ortam üzerinde bireysel hayvanları izole eden polidimetilsiloksan (PDMS) cihazlarını içerir. WorMotel, bireysel hayvanları katı ortamlarda kültürlemek için tasarlanmış 240 kuyucuklu bir PDMS cihazıdır. Her kuyucuk, agar yerine düşük erimeli agaroz kullanılarak modifiye edilmiş bir NGM ile doldurulur ve bakteriyel gıdalarla tohumlanır, böylece Petri plakaları kullanılarak en yaygın kültür sistemine benzer katı bir ortam ortamı yaratılır. Kuyu duvarları yuvarlaktır ve kuyudaki konumdan bağımsız olarak her hayvanın görüntülenmesine izin verir (çok kuyulu bir plakadaki bir duvarın yakınındaki bir hayvanın neden olduğu görsel belirsizlikten kaçınır). Her kuyuyu çevreleyen dar bir hendekte bulunan bakır sülfat, hayvanları kuyularında tutmak için caydırıcı olarak kullanılır14,15. Bu yaklaşımın bir sınırlaması, bakır sülfatın, diyet kısıtlaması, patojenik bakteriler veya hücresel strese neden olan kimyasallar (örneğin, paraquat) dahil olmak üzere engelleyici çevresel koşullar mevcut olduğunda solucanların kaçmasını önlemede etkisiz olmasıdır.

Katı ortam kullanan ikinci bir sistem, bir slayttaki her solucan için küçük bir sızdırmaz ortam oluşturmak için bir hidrojel kullanan ve bireysel olarak izole edilmiş hayvanların uzun süreli izlenmesine izin veren Worm Corral'dır16. Önemli bir sınırlama, hayvanların yumurta olarak çevreye kapatılması gerektiği, üremeyi önlemek için steril hayvanların kullanılmasını gerektirmesi ve ilaç tedavilerinin tek bir uygulamayla sınırlandırılmasıdır. Çok dozlu ilaç denemeleri, WorMotel'de solucanları cihaza aktarmadan önce birden fazla maruz kalma turu gerçekleştirerek veya deney sırasında kuyucuklara topikal olarak ek ilaçlar ekleyerek gerçekleştirilebilir; Bununla birlikte, ikinci durumda, mevcut bir kuyucuğa ek bir ilaç eklendikten sonra gerçek maruz kalma dozunun kesin olarak ölçülmesi zordur ve ilacın ne kadar hızlı bozulduğuna bağlıdır. Hem WorMotel hem de Worm Corral, aktivite ve hayvan fizyolojisi (örneğin, büyüme ve gelişme) ile ilgili bilgileri yakalamak için parlak alan veya karanlık alan görüntüleme için mükemmeldir. Bu sistemler floresanı izlemek için kullanılabilse de, deneyimlerimize göre, diğer tek solucanlı görüntüleme teknolojilerini oluşturmak için kullanılan PDMS, özellikle C. elegans araştırmasında kullanılan en yaygın florofor olan GFP emisyon aralığında, tutarlı floresan görselleştirme ve nicelleştirmeye müdahale eden düzensiz floresan artefaktlar üreten mikrokabarcıklar oluşturmaya, partikülleri yakalamaya ve diğer küçük anormalliklere eğilimlidir. Bugüne kadar, C. elegans bireysel hayvanlarının uzunlamasına bir şekilde canlı floresan görüntülemesi öncelikle mikroakışkan cihazlara dayanmaktadır17.

Burada, bireysel C. elegans'ı katı ortam üzerinde kültürlemek için hem engelleyici müdahaleler hem de doğrudan floresan görüntüleme ile uyumlu yeni bir yöntem tarif ediyoruz. Bu yaklaşım, özel olarak kalıplanmış PDMS çipinin, başlangıçta mikro sitotoksisite testleri için geliştirilen ticari olarak temin edilebilen polistiren mikro tepsilerle (yaygın olarak Terasaki tepsileri olarak da adlandırılır) değiştirilmesi dışında, konsept olarak diğer tek solucanlı görüntüleme teknolojilerine benzerdir18. Bu mikro tepsiler, katı ortamlarla doldurulabilen ve bakteriyel gıdalarla tohumlanabilen, standart katı NGM kültür metodolojisi altında hayvanların yaşadığı çevreyi yakından taklit eden kuyucuklara sahiptir. Her kuyu, bakır sülfat yerine palmitik asidin engelleyici bir bariyeri ile çevrilidir. Palmitik asit, solucanların katı ortamlardan kaçmasını önlemek için, solucanların diyet kısıtlaması veya kimyasal bir stresöre maruz kalma gibi engelleyici bir ortamla zorlandığı deneylerde Petri plakaları üzerinde standart grup kültürünü kullanarak yaygın olarak kullanılır. Mikro tepsiler ayrıca minimal ve tutarlı floresan arka plan üreterek hayvanların doğrudan kültür ortamlarında floresan görüntülemesine olanak tanır. Bu yeni tek hayvanlı katı agar tabanlı kültür sistemi, yalnızca yaşam boyunca bireysel hayvanların izlenmesine ve büyümenin, gelişmenin, aktivitenin ve ömrün izlenmesine izin vermekle kalmaz, aynı zamanda doğrudan floresan mikroskobu ile de uyumludur. Solucanlar felç veya fiksasyon olmadan görüntülenebildiğinden, in vivo floresan biyobelirteçleri, kültür ortamlarında kalan bireysel hayvanlarda uzunlamasına ölçülebilir ve her hayvanın ömrü boyunca dinamik değişikliklerin gözlemlenmesine izin verir. Bu kültür sistemi, kullanım ömrünü ve diğer sağlık ölçümlerini izlemek için mevcut nesil otomatik sistemlerle de uyumludur14,19. Bu mikrotepsi tabanlı sistemde bireysel C. elegans'ı kültürlemek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz, potansiyel tuzakları ve sorun gidermeyi tartışıyoruz ve diğer sistemlere göre avantajları ve sınırlamaları ve özellikle güncellenmiş ve optimize edilmiş bir WorMotel protokolü15'i tartışıyoruz.

Her tek solucan kültürü ortamı, özel bir 3B yazdırılmış adaptör kullanılarak standart bir tek kuyucuklu tepsinin içine monte edilmiş bir mikro tepsiden oluşur (Şekil 1A). Kuyucuklar düşük erimeli agaroz nematod büyüme ortamı (lmNGM) ile doldurulur, besin kaynağı olarak konsantre bakterilerle tohumlanır ve solucanların kaçmasını önlemek için palmitik asit kaplaması ile çevrilidir (Şekil 1B). Mikro tepsi ile tek kuyucuklu plakanın duvarları arasındaki boşluk, nemi korumak için doymuş su kristalleri ile doldurulur (Şekil 1B). Yoğuşmayı önlemek için tepsi kapağına bir deterjan kaplaması uygulanır. Her bir kuyucuğa tek bir solucan eklenir ve tek kuyucuklu tepsi, nemi korumak ve oksijen değişimine izin vermek için Parafilm ile kapatılır. Altı adede kadar mikro tepsi, tek bir deneyimli araştırmacı tarafından paralel olarak makul bir şekilde hazırlanabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Yemek tarifleri

NOT: Mikrotepsi plaka hazırlamaya başlamadan önce stok çözeltileri hazırlayın.

  1. Düşük erimeli agaroz nematod büyüme ortamı (lmNGM) için stok çözümleri
    1. 1 L şişede 1 L steril deiyonize su içinde 174.18 g K 2 HPO4 çözerek 1MK 2HPO4 hazırlayın. Çözeltiyi 121 ° C, 15 psi'de 30 dakika boyunca otoklavlayın ve oda sıcaklığında (RT) saklayın.
    2. 1 L şişede 136.09 g KH2HPO4 in 1 L steril deiyonize su çözerek 1 M KPi (pH 6.0) hazırlayın. pH 6.0'a ulaşmak için çözeltiyi 1 M K2HPO4 ile titre edin. Çözeltiyi 121 ° C'de, 15 psig'de, 30 dakika boyunca otoklavlayın ve RT'de saklayın.
    3. 73.5 g CaCl2'yi 500 mL'lik steril deiyonize suda 500 mL'lik bir şişede çözerek 1 M CaCl2 hazırlayın. Çözeltiyi 121 ° C, 15 psig'de, 30 dakika boyunca otoklavlayın ve RT'de saklayın
    4. 123.25 g MgSO4'ü 500 mL'lik steril deiyonize suda 500 mL'lik bir şişede çözerek 1 M MgSO4 hazırlayın. Çözeltiyi 121 ° C'de, 15 psig'de, 30 dakika boyunca otoklavlayın ve RT'de saklayın.
    5. lmNGM için 3 M NaCl hazırlayın: Temiz 100 mL şişede, 100 mL ultra saf su ve 18.20 g NaCl birleştirin. 121 °C'de otoklav, 15 psig, 30 dakika boyunca.
    6. 2.5 g kolesterol, 275 mL% 100 etanol ve 25 mL steril deiyonize suyu 500 mL'lik kehribar bir şişede birleştirerek 5 mg / mL kolesterol hazırlayın. Çözeltiyi 121 ° C'de, 15 psig'de, 30 dakika boyunca otoklavlayın ve RT'de saklayın.
    7. 0.1231 g FUdR'yi 10 mL'lik steril deiyonize suda 15 mL'lik bir konik tüpte çözerek 50 mM florodeoksiüridin (FUdR) hazırlayın. Çözeltiyi sterilize etmek için 10 mL'lik bir şırınga ve 0,22 μm filtre kullanın. Çözeltinin her biri 1 mL'sini 10 mikrosantrifüj tüpüne alın ve -20 ° C'de saklayın.
    8. 500 mg karbenisilin, 15 mL'lik bir konik tüp içinde 10 mL steril deiyonize su içinde 500 mg karbenisilin eritilerek hazırlanın. Çözeltiyi sterilize etmek için 10 mL'lik bir şırınga ve 0,22 μm filtre kullanın. Çözeltinin her biri 1 mL'sini 10 mikrosantrifüj tüpüne alın ve -20 ° C'de saklayın.
    9. 15 mL'lik bir konik tüp içinde 10 mL steril deiyonize su içinde 2.38 g IPTG'yi çözerek 1 mM izopropil ß-D-1-tiyogalaktopiranosid (IPTG) hazırlayın. Çözeltiyi sterilize etmek için 10 mL'lik bir şırınga ve 0,22 μm filtre kullanın. Çözeltinin her biri 1 mL'sini 10 mikrosantrifüj tüpüne alın ve -20 ° C'de saklayın.
    10. 15 mL'lik bir konik tüp içinde 10 mL steril deiyonize suda 1 g ampisilin çözerek 100 mg/mL ampisilin hazırlayın. Çözeltiyi sterilize etmek için 10 mL'lik bir şırınga ve 0,22 μm filtre kullanın. Her biri 100 mg/mL ampisilin çözeltisinin 1 mL'sini 10 mikrosantrifüj tüpüne alın ve tüpleri -20 ° C'de saklayın.
  2. Genel C. elegans bakımı için nematod büyüme ortamının (NGM) hazırlanması
    1. 50 plaka yapmak için, 10 g Bacto agar, 1.5 g NaCl ve 1.25 g Bacto peptonunu 486 mL ultra saf suda 1 L'lik bir şişede çözün. Ortamı, 121 ° C, 15 psig'de bir sıvı döngüsünde en az 30 dakika boyunca otoklavlayarak sterilize edin.
    2. Otoklav sonrası, ortamın 55 ° C'ye kadar soğumasını bekleyin. Daha sonra, çözeltiye 12.5 mL 1 M KPi, 500 μL 1 M MgSO4, 500 μL 1 M CaCl2 ve 500 μL 5 mg / mL kolesterol ekleyin.
    3. Steril bir teknik kullanarak, adım 1.2.2'de hazırlanan ortamın 10 mL'sini her 60 mm'lik plakaya dökün (toplam 50). Katılaşması için plakaları en az 30 dakika boyunca ortamla bırakın. Pipet 300 μL gece boyunca yetiştirilen bakteri kültürünü plakanın ortasına koyun ve tabağı tezgahın üzerinde bırakın. Kültürün 1-2 gün boyunca kurumasına ve kalınlaşmasına izin verin. Bu NGM plakalarını bakterilerle birlikte 4 °C'de saklayın.
  3. lmNGM ön karışımının hazırlanması
    1. 250 mL'lik bir Erlenmeyer şişesinde, 2 g düşük erimeli agaroz, 0.25 g pepton, 1 mL 3 M NaCl ve 99 mL ultra saf su birleştirin. Çözeltiyi 121 ° C'de, 15 psig'de, 30 dakika boyunca otoklavlayın.
    2. 10 mL lmNGM'yi test tüplerine alın ve sıvı kaybını önlemek için Parafilm ile örtün. Tüpleri kapatın ve soğumalarını ve katılaşmalarını sağlayın.
  4. Bakteriyel gıdalar için 85 mM NaCl hazırlayın: 100 mL'lik bir şişede, 515.61 mg NaCl'yi birleştirin ve 100 mL'ye kadar ultra saf suyla doldurun. 121 °C'de otoklav, 15 psig, 30 dakika boyunca.
  5. 1 g Tip S süper emici polimeri otoklavlanabilir bir sıkma şişesinde 150 mL ultra saf su içinde çözerek su emici poliakrilamid kristalleri hazırlayın. Yeterli bir dağıtım boyutu sağlamak için ucu kesin. 121 ° C'de otoklav, 15 psig, 30 dakika boyunca, infoil ile kapatın ve kristalleri karıştırmak için çalkalayın.
  6. 3 mL% 100 Tween-20'yi 15 mL'lik konik bir şişede 7 mL ultra saf su ile birleştirerek bir deterjan çözeltisi hazırlayın.
  7. 2.5 g kolesterol, 275 mL% 100 EtOH ve 25 mL ultra saf suyu 500 mL'lik bir şişede birleştirerek 5 mg / mL kolesterol hazırlayın.
  8. Palmitik asit çalışma çözeltisi hazırlayın
    1. Bir harç ve havanede 500 mg katı palmitik asit öğütün ve 50 mL'lik konik bir şişede 15 mL Tween-20 ile birleştirin. Vorteks yaparak karıştırın, kristallerin mümkün olduğunca çoğunu çözün.
    2. 17.5 mL% 100 etanol ekleyin ve mümkün olduğunca fazla palmitik asidi çözmek için çözeltiyi vorteks.
    3. 17.5 mL ultra saf su ve vorteksi titizlikle ekleyin. Çözeltiyi, palmitik asit tamamen çözünene kadar 80 ° C'de bir boncuk banyosunda hafifçe ısıtın. Bazı palmitik asit soğutma sırasında çökelebilir.
  9. 1 L veya daha büyük bir beherde 1 L deiyonize suda 20 g LB tozunu karıştırarak lizojen suyu (LB) hazırlayın. Aliquot 500 mL et suyu iki adet 500 mL beher haline getirilir. Suyu 121 ° C'de, 15 psig'de, 30 dakika boyunca otoklavlayın. Hazırlanan suyu RT'de saklayın.
  10. Lizojeni et suyu (LB) agar plakalarının hazırlanması
    1. 10 g LB tozu ve 7.5 g Bacto agar'ı 500 μL deiyonize suda 1 L'lik bir şişede karıştırın. Çözeltiyi 121 ° C, 15 psig'de bir sıvı döngüsünde 30 dakika boyunca otoklavlayın.
    2. İstenirse, otoklavlanmış ortam 55 ° C'ye soğutulduktan sonra isteğe bağlı antibiyotikler (500 μL 100 μg / mL ampisilin) ekleyin. Steril bir teknik kullanarak, her 100 mm'lik plakaya (toplam 25) 20 mL ortam dökerek LB agar plakaları yapın. Plakaları 4 °C'de saklayın.

2. Yaş senkronize solucan popülasyonunun hazırlanması

  1. Larva evresi 4'te (L4) mikro tepsiye eklenmeye hazır olan yaş senkronize solucanlardan oluşan bir popülasyon hazırlayın. Alternatif olarak, herhangi bir yaşam aşamasındaki solucanlar eklenebilir (solucanlar, gelişimsel durmayı önlemek için L4'ten önceki bir gelişim aşamasında eklenirse, FUdR mikrotepsi ortamından çıkarılmalıdır).
    NOT: Bu adım, deneyin başlangıcındaki hedef yaşam aşaması L4 ise, solucanları mikro tepsiye eklemeden 2 gün önce tamamlanmalıdır. Senkronizasyon zamanlaması, solucanların istenen yaşam aşamasına ulaşmasına izin verecek şekilde ayarlanabilir.
  2. Sıcaklık kullanım ömrünü etkileyebilir. Tutarlı sonuçlar için, C. elegans'ı 20 ° C'de tutmak için standart NGM plakalarını (bkz. bölüm 1) kullanın ve bakteriyel gıdalarda azalma varsa solucanları taze plakalara aktarın.
  3. Birçok genç yetişkin solucanı olan stok plakalarından, yaş senkronize bir popülasyon oluşturmak için standart bir yaklaşım kullanın, en yaygın olarak20 ağartma veya zamanlanmış yumurtlama21.
  4. Yumurtaları izole edin ve bakteri lekeli bir NGM plakasına ekleyin. Vahşi tip C. elegans kullanılıyorsa, yumurtalar yumurtadan çıkar ve solucanlar oluşturur ve 2 gün içinde L4 larva aşamasına ulaşır.

3. Bakteri kültürünün hazırlanması

  1. Deneyin başlamasından bir gün önce, istenen bakteriyel besin kaynağını aşılayın. Plaka başına ~ 5 mL bakteri kültürü hazırlayın.
    NOT: Bakteri çizgisi 1 ay öncesine kadar hazırlanabilir ve E. coli besin kaynağı için 4 °C'de saklanabilir.
    1. Tek koloniler için bakterileri dondurulmuş bir gliserol stoğundan LB agar plakasına çizin.
    2. Kültürü bir gecede 37 ° C'de büyütün.
    3. Sıvı LB suyunu aşılama başına tek bir koloni ile aşılayın.
    4. 12-16 saat boyunca 37 ° C'de ~ 250 rpm'de çalkalayın.

4. Mikrotraya palmitik asit kaplama uygulanması

NOT: Palmitik asit, hayvanların bireysel kuyucuklardan kaçmasını önlemek için caydırıcı bir bariyer görevi görür. Kaplama, kuyucukların iç yüzeyleri hariç, mikro tepsinin tüm alt yüzeyine uygulanır. Mantar kontaminasyonunu azaltmak için palmitik aside nistatin eklenir. İstenirse bu adım, deneme başlamadan 1 gün önce tamamlanabilir.

  1. Ön ısıtma için zaman tanımak için boncuk banyosunu 80 ° C'ye ayarlayın.
  2. Kullanımdan hemen önce, mikro tepsi başına 1 mL palmitik asit çalışma çözeltisini ayrı bir steril kaba (tipik olarak 15 mL'lik bir konik şişe) aliquot edin ve ısıtmadan önce 1 mL palmitik asit çözeltisi başına 4 μL 10.000 birim / mL nistatin ekleyin.
  3. Doygunluğa ulaşmak için mikro tepsinin içine ve dışına etanol (% 70 veya daha fazla) püskürtün ve fazla etanolün çalkalanması.
    NOT: Kalıntı etanol, UV çapraz bağlamada tedavi sırasında buharlaşmalıdır (adım 4.4).
  4. Mikro tepsiyi sterilize etmek için bir UV çapraz bağlayıcı kullanın (aşağıdaki talimatlar bu çalışmada kullanılan UV çapraz bağlayıcı içindir):
    1. Mikro tepsiyi ve kapağı UV çapraz bağlayıcıya ayrı ayrı yerleştirin (yani, UV plastiğe nüfuz etmediğinden kapakları plakaların üzerine yerleştirmeyin).
    2. Kapıyı kapatın ve UV çapraz bağlayıcıyı açın.
    3. Zaman tuşuna basın, 20 dakika girin ve ardından Başlat'a basın.
    4. 20 dakika sonra, plakayı ve kapağı ters çevirin ve 4.2.2-4.2.3 adımlarını tekrarlayın.
    5. Eldiven giyerken, sterilizasyondan sonra kontaminasyonu önlemek için kapakları mikro tepsiye yerleştirin.
  5. Palmitik asit çalışma çözeltisini vorteks ve ters çevirerek iyice karıştırın.
  6. 15 mL'lik konik şişeyi palmitik asit çalışma çözeltisi ile boncuk banyosuna yerleştirin ve görünür kristallerin kullanımdan önce tamamen çözünmesine izin verin.
  7. Mikro tepsiyi, ısınmak için ~ 2 dakika boyunca kapakları açık olacak şekilde boncuk banyosunu çevreleyen çıkıntıya yerleştirin.
  8. Mikro tepsi kapağını çıkarın. Mikro tepsinin arka duvarına (uzun tarafı) yavaşça 200 μL palmitik asit çalışma solüsyonu ekleyin. Kapakları değiştirin ve palmitik asit çözeltisinin mikro tepsinin dibine yerleşmesini sağlamak için mikro tepsinin boncuk banyosunda 2-3 dakika oturmasına izin verin.
    NOT: Mikro tepsinin tam tabanı adım 4.10'a kadar tamamen kaplanmayacak olsa da, çözelti alt yüzeyin yarısından fazlasına eşit olarak yayılmalıdır. Palmitik asit çözeltisi eşit şekilde yayılmıyorsa, mikro tepsinin yakınında bir vorteks veya titreşimli motoru açın. Bu, palmitik asit çözeltisinin daha kolay yayılmasına yardımcı olabilecek az miktarda titreşim sağlayacaktır. Kirlenmeyi azaltmak için mikro tepsi kapaklarını yerinde tutun.
  9. 4.8 adımını yineleyin.
    NOT: Mikrotepsinin tabanının kabaca yarısı veya daha fazlası sıvı palmitik asit ile gözle görülür şekilde kaplanmalıdır.
  10. Mikro tepsiyi 180° döndürün ve tepsinin diğer tarafındaki 4,8 ve 4,9 adımlarını yineleyin.
    NOT: Terasaki tepsisinin tabanı, her iki tarafa da tam birleşik hacim eklendikten sonra sadece ince bir palmitik asit çözeltisi tabakası ile kaplanacaktır (adım 4.9 ve 4.10). Karışım hazırlığına, sıcaklığa ve diğer faktörlere bağlı olarak az ya da çok palmitik asit karışımı gerekebilir. Genel olarak, palmitik asit karışımının 400 ila 800 μL arasında, mikro tepsinin tüm tabanını kaplamak için yeterli olacaktır. Mikro tepsinin tabanı gözle görülür şekilde kaplanır kaplanmaz, kuyucukları kirletebileceğinden ilave palmitik asit eklenmemelidir.
  11. Tepsiyi steril bir kurutma kutusunda veya laminer akış davlumbazında en az 1 saat açıkta bırakacak şekilde kurutun. Alternatif olarak, plakaları yüklemeden bir gün önce bu adımı tamamlayın (bölüm 5), mikro tepsiyi RT'de kapağı açıkken en az 16 saat kurutun.

5. Mikro tepsinin düşük erimeli nematod büyüme ortamı (lmNGM) ile yüklenmesi

NOT: Bu yöntem, normal agar yerine düşük erimeli agaroz ile karıştırılmış standart NGM kullanır. Agar 45 ° C'de jelleşmeye başlayabilir. Mikrotepsi kuyucuklarını doldurmak için gereken küçük hacimlerle çalışırken, agar bazlı NGM genellikle pipet ucunu tıkar ve/veya hızlı jelleşme nedeniyle düzgün olmayan kuyu yüzeyleri üretir. Düşük erimeli agaroz kullanan NGM, ~ 28 ° C'de jelleşmeye başlar, erimiş ortamın kolayca pipetlenmesini ve sürekli olarak düz kuyu yüzeyleri oluşturmasını sağlar. lmNGM'yi, solucanların mikro tepsiye yerleştirileceği gün hazırlayın. Mikro tepsiyi lmNGM ile hazırlıyorsanız, bakterilerle tohumluyorsanız ve C. elegans'ı aynı gün içinde yüklüyorsanız, bu adımlara başlamadan önce hayvanların istenen yaşta veya yakınında olduklarından emin olun.

  1. Isınmak için 80 °C boncuk banyosuna bir pipet havuzu yerleştirin.
  2. Hazırlanmakta olan mikro tepsi başına bir adet 10 mL lmNGM ön karışımını (adım 1.1) mikrodalgada ~30-45 s eritin.
    1. lmNGM ön karışım test tüplerini, devrilmemeleri için açıkta bırakılmış 200 mL'lik bir beher içine yerleştirin.
    2. ~ 10-15 s sonra veya lmNGM ön karışımı kabarcıklanmaya başladığında, mikrodalgayı duraklatın, lmNGM ön karışımını steril bir 200 mL beher içine dökün ve mikrodalga fırınlamaya devam edin.
    3. Kaynamasını önlemek için gerektiği gibi duraklatın ve karıştırmak için girdap yapın.
    4. Tüm lmNGM'ler parça olmadan sıvıya dönüştüğünde mikrodalga fırınlamayı durdurun.
      NOT: Toplam 192 kuyucuğu (iki mikro tepsi) doldurmak için tek bir 10 mL aliquot yeterlidir.
  3. Sıcak düşük erimeli agaroza aşağıdaki bileşenleri listelenen sırayla ekleyerek lmNGM'yi hazırlayın (hacimler 10 mL düşük erimeli agaroz başınadır): 250 μL 25 mM KPi (pH 6), 10 μL 1 M CaCl2, 10 μL 1 M MgSO4 ve 10 μL 5 mg / mL kolesterol
    1. Araştırmacı yetişkin hayvanları zamanla incelemeyi planlıyorsa ve üremeyi önlemesi gerekiyorsa, 10 μL 50 mM FUdR ekleyin.
    2. Ortak HT115 RNAi E. coli suşu ve ilişkili RNAi plazmidlerini kullanarak bir RNAi besleme deneyi yürütüyorsanız, ayrıca 5 μL 50 mg / mL karbenisilin (RNAi plazmidini seçmek için) ve 12 μL 1 mM IPTG (RNAi plazmidinden çift sarmallı RNA'nın ekspresyonunu indüklemek için) ekleyin.
      NOT: İstenilen gıda kaynağı için gerekli olan seçici antibiyotiklere ve diğer kimyasallara bağlı olarak ek katkı maddeleri eklenebilir. Bu aşamada lmNGM'ye ilaçlar veya kimyasal stresörler de eklenebilir. NGM ve lmNGM, aynı nihai NaCl konsantrasyonunu içerir, ancak NaCl'nin medyaya nasıl eklendiği konusunda farklılık gösterir. NGM için, tüm NaCl medya hazırlığı sırasında eklenir (adım 1.2). LmNGM için, ortam hazırlama sırasında NaCl'nin bir kısmı (adım 5.3) ve bakteriyel gıda ile bir kısmı (bölüm 6) eklenir. Bu değişikliğin nedeni, her mikro tepsi kuyusundaki küçük ortam hacminden kaynaklanmaktadır. 20 μL ortam içeren bir kuyucuğa LB içinde asılı 5 μL konsantre bakteri eklenmesi, ortamın besin bileşimini önemli ölçüde değiştirecektir (LB bileşenlerini karşılaştırılabilir bir hacimde ekleyerek). Bunu önlemek için, bakteriler bunun yerine, bakteriler üzerindeki ozmotik stresi önlerken LB bileşenlerini çıkarmak için bir NaCl çözeltisi içinde yeniden askıya alınır. Ortama eklenen NaCl, bakterilere eklenen tuzu hesaba katmak için buna göre azaltılır.
  4. Isıtılmış pipet havuzuna lmNGM dökün.
  5. Mikro tepsi bir tezgahın üzerindeyken, her bir mikro tepsiye 20 μL lmNGM pipet ekleyin. Kirlenmeyi en aza indirmek için pipeti yeniden doldururken mikro tepsiyi örtün.
    NOT: Bu adım, elektronik tekrarlanan pipet ile daha kolaydır.

6. Mikrotepsi kuyucuklarının bakteriyel gıdalarla tohumlanması

NOT: Bir gecede aşılanmış bir kültürden elde edilen 5 μL 10x konsantre gıda, ömrünün tamamı boyunca tek bir C. elegans'ı beslemek için yeterlidir.

  1. Bakterileri gece kültüründen 50 mL'lik bir konik şişeye aktarın.
  2. 20 dakika boyunca ~ 3.500 x g'de santrifüj.
  3. Supernatan'ı çıkarın. Bakteri kültürünü 85 mM NaCl çözeltisi ile 10x konsantrasyonda (orijinal kültürün 1/10 hacmi) yeniden askıya alın.
  4. Kuyucuklara bakteri eklemeden önce, katı lmNGM'nin her bir kuyucukta tamamen bulunduğundan emin olmak için mikro tepsiyi görsel olarak inceleyin. Bir kuyunun kenarından herhangi bir lmNGM sarkıyorsa, fazla lmNGM'yi bir pipet ucuyla kazıyın. Bu fazla madde, temizlenmezse yiyeceğin palmitik aside karışmasına neden olabilir.
  5. Her bir kuyucuktaki lmNGM yüzeyine 5 μL 10x konsantre bakteri kültürünü dikkatlice pipetin. Bakteri kültürünün kuyunun kenarından ve palmitik aside akmasına izin vermekten kaçının, çünkü bu, solucanları kuyudan ayrılmaya çekecektir.
  6. Mikro tepsilerin steril bir kurutma kutusunda veya laminer akış davlumbazında ~ 35 dakika kurumasını bekleyin. Her ~ 5 dakikada bir kontrol edin ve aşırı kurumamaya dikkat edin. Birkaç kuyucuk gözle görülür şekilde hafifçe ıslakken çıkarın, çünkü nematodlar eklenirken kuyular daha da kurur.

7. Her mikro tepsinin tek kuyucuklu bir plaka içine kapatılması

NOT: Bu bölümde, mikro tepsi, özel bir 3D baskılı kesici uç kullanılarak standart bir tek kuyucuklu plakanın içine monte edilir ve su emici kristallerle çevrilidir. Tek kuyucuklu plaka daha sonra kapatılır ve Parafilm ile kapatılır. Bu, kontaminasyonu önlerken ve lmNGM'nin birkaç haftalık deneyler boyunca kurumasını önlemek için yeterli nemi korurken oksijen değişimine izin verir (solucan ömrü deneyleri, ömrünü uzatan mutasyonları veya çevresel koşulları incelerse 6-8 hafta sürebilir). Hazırlık sırasında, bakteri veya mantar kontaminasyonunu en aza indirmek için aktif olarak bir şey eklenmediğinde plakayı kapattığınızdan emin olun.

  1. Tek kuyucuklu bir plakayı, 3D baskılı adaptörü ve kapağı her birini% 10'luk bir ağartıcı çözeltisine batırarak sterilize edin. Steril DI su ile iyice durulayın. Görev silme işlemiyle kurulayın.
  2. Tek kuyucuklu plakayı, 3D baskılı adaptörü ve kapağı %70 veya daha fazla etanol çözeltisiyle püskürtün ve bir görev silme işlemiyle silin. Herhangi bir artık etanol havasının kurumasını bekleyin.
    NOT: UV radyasyonu, yukarıda adım 4.4'te açıklandığı gibi, mikro tepsi ile aynı parametrelere sahip ağartıcı ve etanolden sonra da kullanılabilir.
  3. Steril 3D baskılı kesici ucu steril tek delikli bir plakaya yerleştirin.
  4. Hazırlanan mikro tepsinin dışını %70 etanol ile püskürterek sterilize edin.
  5. Mikro tepsiyi tek delikli plakadaki 3D yazdırılmış adaptöre yerleştirin.
  6. Mikro tepsi kapağını atın.
  7. Su kristallerini, mikro tepsinin dış duvarı ile tek kuyucuklu plakanın iç duvarı arasında 3D baskılı kesici ucun üzerine serbestçe dağıtın.
  8. Solucanları hemen ekleyin (bölüm 8) veya ertesi gün kullanmak için mikro tepsiyi kapatın. Tepsi kapağını kapatın ve mikro tepsiyi kapatmak için dört tarafı da sarmak için tek bir Parafilm parçası kullanın. Toplam üç katman için Parafilm ile sızdırmazlık adımını iki kez daha tekrarlayın.
  9. Mikro tepsiyi kapattıktan sonra, solucanları eklemeden önce RT'deki tezgahta 4 güne kadar bırakın (bölüm 8).

8. Mikro tepsiye solucanlar ekleme

NOT: Platin toplama kullanılarak yaşa senkronize solucan popülasyonlarından (bölüm 2) hayvanlar aktarılarak her kuyucuğa manuel olarak bir solucan eklenebilir. Hayvanları sadece istenen yaşam aşamasında transfer edin. Transfer işlemi 1 saatten fazla sürerse, mikro tepsi kuyucuklarındaki lmNGM kuruyabilir. Bir seferde 10 ila 20 solucandan oluşan grupların aktarılması bu adımı hızlandırabilir, ancak kuyu başına yalnızca tek bir hayvanı tutarlı bir şekilde serbest bırakmak biraz pratik gerektirir.

  1. İstenilen yaşam aşamasına ulaştıklarında kuyu başına bir nematod ekleyin.
  2. Kirlenmeyi en aza indirmek için kaynak plakadan solucanlar toplarken kapağı tekrar mikro tepsinin üzerine yerleştirin.

9. Kültür ortamının uzun süreli kullanıma hazırlanmasının bitirilmesi

NOT: Aşağıdaki adımlar, mikro tepsideki ortamın ve solucanların deney süresi boyunca nemli kalmasını sağlamak için gerçekleştirilir.

  1. Tek kuyucuklu bir plakanın kapağına ~ 40 μL deterjan çözeltisi ekleyin ve kapağı eşit şekilde kaplamak için bir görev mendili kullanın. Bu kaplama, plaka kapatıldıktan sonra zamanla yoğuşmayı önleyecektir. Deterjan çözeltisini, kapaktan görme bozulmayana kadar yaymak için ek görev mendilleri kullanın (bu genellikle yaklaşık iki görev mendili gerektirir).
  2. Su kristallerini, her ikisinin de mikro tepsinin üst kenarı ile aynı hizada olduğundan ve taşmadığından emin olmak için inceleyin. Gerekirse, plakaya su kristalleri ekleyin veya çıkarın.
  3. Aşağıdaki yaklaşımı kullanarak, Parafilm mührünün uzun süre dayanacağından emin olmak için tepsiyi Parafilm (toplamda üç parça) ile sarın.
    1. Tepsinin iki tarafını örtmek için ilk Parafilm parçasını hafifçe gerin.
    2. İkinci Parafilm parçasını hafifçe gerin ve tepsinin kalan taraflarını örtün.
    3. Parafilm'in son parçasını gerin ve birinci ve ikinci Parafilm parçalarını kaplayacak şekilde tepsinin dört tarafını da tamamen sarın. Düzgün kapatılmış bir mikro tepsi ~ 2 ay boyunca sulu kalabilir.
      NOT: Deney boyunca her 1-2 haftada bir Parafilm bütünlüğünü izleyin ve gerektiğinde değiştirin.
    4. Parmak izlerini çıkarmak için tepsinin üst kısmını, %70 etanol ile nemlendirerek bir görev mendili ile silin.
  4. Tek kuyucuklu plakayı bant kullanarak etiketleyin. Mikro tepsi artık solucanları zaman içinde izlemek için görüntüleme ve uzun süreli depolama için hazırdır. Görüntüleme seansları arasında tepsiyi 20 °C'de tutun. Mikro tepsi, ilaç dozlaması veya diğer prosedürler için birden çok kez açılabilir ve yeniden kapatılabilir, ancak kontaminasyonu ve nem kaybını önlemek için en aza indirilmelidir.

10. Mikrotepsi kuyucuklarında bireysel solucanların görüntülenmesi

NOT: Bu protokolün amacı, mikrotepsi kültür ortamının nasıl hazırlanacağına dair ayrıntılı bir açıklama sağlamaktır. Solucanlar hazırlandıktan ve doldurulduktan sonra, mikro tepsi tek solucan kültürü ortamları, Petri plakaları üzerinde standart kültür için oluşturulan teknikleri kullanarak birçok fenotipi uzunlamasına izlemek için kullanılabilir. Aşağıdaki bölümde, bazı yaygın fenotiplerin ölçülmesi için temel talimatlar verilmektedir. Floresan görüntüleme dik mikroskopta yapılmalıdır. Terasaki tepsisindeki ışığın kırılması karanlık bir odada en aza indirilir.

  1. Ömrü: Plakanın yan tarafına veya üstüne hafifçe dokunarak veya plakaya parlak mavi bir ışık yakarak ve her hayvanı gözlemleyerek ömrünü ölçün. Birkaç saniye içinde hareket etmeyen bir hayvanı "ölü" olarak puanlayın. Tüm solucanlar ölene kadar bu görevi her 1-3 günde bir tekrarlayın.
    NOT: Mikrotepsi kültürü ortamı, kullanım ömrü tahmini14,19 için görüntü toplama ve analizini otomatikleştiren sistemlerle uyumludur.
  2. Standart mikroskopi: Yüksek çözünürlüklü bir kamera veya tarayıcı ile tek tek kuyucuklarda veya tüm tepside parlak alan (veya karanlık alan) görüntülemesi gerçekleştirin. Bu görüntüleme verileri, hayvan büyüklüğü 22,23,24, gelişim 25, aktivite14,19 ve yaşam süresi dahil olmak üzere çeşitli fenotipler için kullanılabilir.
  3. Floresan mikroskopi: Tek kuyucuklarda manuel olarak veya motorlu platform sistemi ile floresan görüntüleme yapın. Tek kuyulu tepsiler, standart çok kanallı plaka adaptörleriyle uyumludur. Aparat siyah duvarlı bir kutuya yerleştirilirse sinyal-gürültü en aza indirilir.
    NOT: Solucanlar tarama için serbest kalırken görüntülendiğinden, bu kültür sistemi tüm vücut floresansını ve floroforların kaba doku lokalizasyonunu yakalamak için düşük çözünürlüklü görüntüleme için çok uygundur. Yüksek çözünürlüklü ve yüksek büyütmeli görüntüleme tipik olarak hayvanların hareketi önlemek için hareketsiz hale getirilmesini gerektirir. Her bir kuyucuğa topikal olarak bir felç edici ajan (örneğin, sodyum azid veya levamisol) uygulamak ve daha yüksek çözünürlüklü görüntülemeye devam etmek mümkün olsa da, bu, aynı solucanın daha sonraki zaman noktalarında tekrarlanan ölçümlerini engelleyecektir. Kültür sistemi, tarif edildiği gibi, ters çevrilmiş mikroskop sistemlerinin kullanılmasını önleyen tersine çevrilmesi amaçlanmamıştır.
    1. Ömrü ölçmek için parlak alan kullanılmıyorsa ve yalnızca floresan yakalanıyorsa, ömrü manuel olarak ölçün. Mavi ışığı (GFP uyarımı için kullanılır) solucan üzerinde 5 saniye boyunca bırakmak, hayvanın hareket etmesini sağlayacaktır. Hayvan 5 saniye içinde hareket etmediyse, hayvanı ölü olarak düşünün.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Burada açıklanan mikrotepsi tabanlı tek solucan kültürü ortamı, yaşam süresi ve sağlık süresi, aktivite ve hareket, vücut şekli ve tarama geometrisi ve zaman içinde bireysel hayvanlarda transjenik olarak eksprese edilen floresan biyobelirteçlerin ekspresyonu dahil olmak üzere çeşitli fenotipleri izlemek için kullanılabilir. Mikrotepsi kültür sistemi, manuel puanlama veya görüntü toplama ve aşağı akış görüntüleme analizi yoluyla kullanım ömrü analizi ile uyumludur. Petri plakaları

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Burada, başlangıçta insan lökosit antijen doku tipleme testleri için geliştirilen mikro tepsileri, C. elegans araştırmasında standart olan agar bazlı NGM'ye bağlamsal olarak benzeyen katı bir ortam ortamında tek C. elegans'ın zaman içinde izolasyonuna ve karakterizasyonuna izin verecek şekilde uyarlayan yeni bir kültür sistemini açıklıyoruz. Bu sistem, diyet kısıtlaması, eksojen ilaç tedavisi, kimyasal veya çevresel stresörlerle ilgili bir zorluk ve RNAi dahil olmak üzere çe...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar, açıklayacak herhangi bir çıkar çatışması olmadığını belirtmektedir.

Teşekkürler

Bu çalışma, G.L.S.'ye NIH R35GM133588, L.E.'ye bir NIHT32GM008659 eğitim hibesi, G.L.S.'ye Amerika Birleşik Devletleri Ulusal Tıp Akademisi Katalizör Ödülü ve Arizona Eyaleti Teknoloji ve Araştırma Girişimi Fonu tarafından desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
3D-printed terasaki insertsCustom printing companyRobot_Terasaki_tray_insert_10-20
-2021.STL		FDM printing, nozzle size 0.6 mm using standard PLA plus filament
AirClean systems AC624LF vertical laminar flow fume hoodFisher Scientific36-100-4376
Bacto peptoneThermo Scientific211677
CaCl2Acros organics349615000
Caenorhabditis elegans N2Caenorhabditis Genetics Center (CGC)N2Wildtype strain
CarbenicillinGoldbioC-103-25
CholesterolICN Biomedicals Inc101380
Escherichia coli OP50 Caenorhabditis Genetics Center (CGC)OP50Standard labratory food for C. elegans
EthanolMilliporeex0276-4
Fisher Vortex Genie 2Fisher ScientificG-560
FUdR Research Products InternationalF10705-1.0
Hydrating water crystals M2 Polymer TechnologiesType SType S super absorbent polymer
Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)GoldBioI2481C100
K2HPO4Fisher ChemicalP288-500
KimwipesKimTech34155Task wipes
LB Broth, LennoxBD Difco240230
Leica K5 sCMOS monochrome cameraLeica Microsystems11547112
Leica M205 FCA Fluorescent Stereo MicroscopeLeica Microsystems10450826
Low-melt agaroseResearch Products InternationalA20070-250.0
MgSO4 Fisher ChemicalM-8900
NaClFisher bioreagentsBP358-1
Nunc OmniTray Single-Well PlateThermo Scientific264728
NystatinSigmaN1538
Palmitic acidAcros organics129700010
Paper towelsCoastwide Professional365374
Parafilm MParafilm16-101
Stratagene UV Stratalinker 2400Stratagene400075UV crosslinker
Terasaki trays (Lambda)One Lambda151431
Thermolyne Dri-bathThermolyneDB28125
Tween Thermo ScientificJ20605-AP

Referanslar

  1. Shaham, S. Methods in Cell Biology. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK19784/ (2006).
  2. Boulin, T., et al. Eight genes are required for functional reconstitution of the Caenorhabditis elegans levamisole-sensitive acetylcholine receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (47), 18590-18595 (2008).
  3. Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans. Cell Stress & Chaperones. 8 (1), 1-7 (2003).
  4. Xian, B., et al. WormFarm: a quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).
  5. Rahman, M., et al. NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10 (1), 16190(2020).
  6. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
  7. Clark, A. S., Huayta, J., Arulalan, K. S., San-Miguel, A. Microfluidic Devices for Imaging and Manipulation of C. elegans. Micro and Nano Systems for Biophysical Studies of Cells and Small Organisms. , Academic Press. Chapter 13 295-321 (2021).
  8. Levine, E., Lee, K. S. Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research. Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).
  9. Atakan, H. B., et al. Automated platform for long-term culture and high-content phenotyping of single C. elegans worms. Scientific Reports. 9 (1), 14340(2019).
  10. Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. Journal of Visualized Experiments. (49), e2496(2011).
  11. Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains. Journal of Visualized Experiments. (51), e2745(2011).
  12. Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise. BMC Biology. 15 (1), 30(2017).
  13. Çelen, İ, Doh, J. H., Sabanayagam, C. R. Effects of liquid cultivation on gene expression and phenotype of C. elegans. BMC Genomics. 19 (1), 562(2018).
  14. Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652(2017).
  15. Turner, E., et al. Long-term culture and monitoring of isolated nematodes on solid media in WorMotels. Journal of Visualized Experiments. , (2022).
  16. Pittman, W. E., et al. A simple apparatus for individual C. elegans culture. Methods in Molecular Biology. 2144, 29-45 (2020).
  17. Breimann, L., Preusser, F., Preibisch, S. Light-microscopy methods in C. elegans research. Current Opinion in Systems Biology. 13, 82-92 (2019).
  18. Mittal, K. K., Mickey, M. R., Singal, D. P., Terasaki, P. I. Serotyping for homotransplantation. 18. Refinement of microdroplet lymphocyte cytotoxicity test. Transplantation. 6 (8), 913-927 (1968).
  19. Freitas, S. Worm paparazzi-a high throughput lifespan and healthspan analysis platform for individual Caenorhabditis elegans. , Available from: https://repository.arizona.edu/handle/10150/661628 (2021).
  20. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019(2012).
  21. Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152(2009).
  22. Moore, B. T., Jordan, J. M., Baugh, L. R. WormSizer: high-throughput analysis of nematode size and shape. PloS One. 8 (2), 57142(2013).
  23. Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. , 1-17 (2013).
  24. Roussel, N., Sprenger, J., Tappan, S. J., Glaser, J. R. Robust tracking and quantification of C. elegans body shape and locomotion through coiling, entanglement, and omega bends. Worm. 3 (4), Taylor & Francis. 982437(2014).
  25. Raizen, D. M., et al. Lethargus is a Caenorhabditis elegans sleep-like state. Nature. 451 (7178), 569-572 (2008).
  26. Peters, M. J., et al. The transcriptional landscape of age in human peripheral blood. Nature Communications. 6 (1), 8570(2015).
  27. Sutphin, G. L., et al. Caenorhabditis elegans orthologs of human genes differentially expressed with age are enriched for determinants of longevity. Aging Cell. 16 (4), 672-682 (2017).
  28. Felker, D. P., Robbins, C. E., McCormick, M. A. Automation of C. elegans lifespan measurement. Translational Medicine of Aging. 4, 1-10 (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geri ekmeSay 190

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır