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요약

여기에서 우리는 평생 생리학적 매개변수 추적 및 형광 정량화를 위해 고체 배지에서 분리된 개별 선충을 배양하는 프로토콜을 제시합니다. 이 배양 시스템에는 동물이 도망가는 것을 방지하기 위해 단일 벌레 우물 주위에 팔미트산 장벽이 포함되어 있어 병원성 박테리아 및 화학적 스트레스 요인을 포함한 혐오적인 개입을 사용할 수 있습니다.

초록

Caenorhabditis elegans 는 노화 생물학을 연구하는 데 널리 사용됩니다. 예쁜꼬마선충 노화 연구의 표준 관행은 고체 선충 성장 배지(NGM)에서 벌레 그룹을 배양하여 생존 및 기타 생리학적 표현형에 대한 개체군 수준 데이터를 효율적으로 수집하고 형광 바이오마커 정량화를 위해 하위 집단을 주기적으로 샘플링할 수 있도록 하는 것입니다. 이 접근법의 한계는 (1) 시간이 지남에 따라 개별 벌레를 추적하여 관심 표현형에 대한 연령 궤적을 개발하고 (2) 배양 환경의 맥락에서 형광 바이오마커를 직접 모니터링할 수 없다는 것입니다. 대체 배양 접근법은 액체 배양 또는 미세 유체 공학을 사용하여 시간이 지남에 따라 개별 동물을 모니터링하며, 경우에 따라 형광 정량화를 포함하여 배양 환경이 고체 NGM과 문맥상 구별된다는 단점이 있습니다. WorMotel은 고체 NGM에서 분리된 웜을 배양하기 위한 이전에 설명한 미세 조립식 다중 웰 장치입니다. 각 벌레는 C. elegans의 접촉 방수제인 황산구리로 채워진 해자로 둘러싸인 고체 NGM을 포함하는 우물에 유지되어 개별 동물의 세로 모니터링이 가능합니다. 우리는 황산구리가 식이 제한, 병원성 박테리아 및 세포 스트레스를 유발하는 화학 물질을 포함하여 노화 연구에서 흔히 볼 수 있는 혐오적인 개입을 받을 때 벌레가 도망가는 것을 방지하기에 불충분하다는 것을 발견했습니다. 멀티웰 장치는 또한 형광 이미징에서 높은 배경 아티팩트를 생성하는 폴리디메틸실록산으로 성형됩니다. 이 프로토콜은 원래 인간 백혈구 항원(HLA) 유형 지정을 위해 설계된 상업적으로 이용 가능한 폴리스티렌 마이크로트레이를 사용하여 고체 NGM에서 분리된 회충을 배양하는 새로운 접근 방식을 설명하여 수명 전반에 걸쳐 생존, 생리학적 표현형 및 형광을 측정할 수 있습니다. 팔미트산 장벽은 혐오스러운 조건에서도 벌레가 도망가는 것을 방지합니다. 각 플레이트는 최대 96마리의 동물을 배양할 수 있으며 식이 제한, RNAi 및 화학 첨가물을 포함한 다양한 조건에 쉽게 적응할 수 있으며 수명 및 활동 데이터 수집을 위한 자동화 시스템과 호환됩니다.

서문

예쁜꼬마선충은 유전학, 세포생물학, 분자생물학 연구를 위한 강력한 모델 유기체로, 실험실에서 쉽게 배양할 수 있고, 생성 시간과 수명이 짧으며, 포유류와 높은 수준의 단백질 상동성을 공유하고, 형광 단백질과 염료를 생체 내에서 시각화할 수 있는 투명한 신체 구조를 가지고 있기 때문입니다1. 예쁜꼬마선충을 발달 생물학 및 노화를 포함한 다양한 분야에서 주요 모델 시스템으로 오랫동안 사용해 온 결과, 이들의 성장과 발달이 잘 이해되고 게놈이 완전히 시퀀싱되었으며, 게놈 차원의 RNAi 공급 라이브러리와 수천 개의 돌연변이 및 형질전환 균주를 포함한 강력한 유전 도구가 만들어졌습니다. 역사적으로 예쁜꼬마선충은 고체 한천 선충 성장 배지(NGM)에서 개체군으로 재배되며 표현형은 직접 관찰 또는 이미징 및 다운스트림 분석을 통해 수동으로 평가됩니다. 형광 현미경은 염료 또는 개별 예쁜꼬마선충 에서 형질전환적으로 발현된 형광 태그를 사용하여 다양한 분자 표현형을 캡처하는 데 사용됩니다.형광 이미징은 일반적으로 침습적이고 종종 치명적일 수 있는 얇은 아가로스 패드가 포함된 슬라이드에 동물을 고정하거나 마비시키는 것을 포함합니다. 또한 levamisole 또는 sodium azide와 같은 화학 물질의 사용이 포함되며, 이는 잠재적으로 관심있는 분자 과정을 방해 할 수 있습니다 2,3. 이러한 접근 방식을 사용하면 광범위한 표현형에 걸쳐 단면, 개체군 수준 데이터를 수집할 수 있지만 시간이 지남에 따라 개별 동물을 추적할 수는 없습니다.

최근 몇 년 동안 분리된 예쁜꼬마선충을 배양하기 위한 몇 가지 접근 방식이 등장하여 연구자들이 새로운 이미징 기술을 활용하여 시간이 지남에 따라 동물의 생리학적 및 분자적 표현형의 동적 변화를 포착할 수 있게 되었습니다. 예쁜꼬마선충 배양 접근법의 한 범주는 WormFarm4, Nemalife 칩5 및 Chronis et al.6의 '거동' 칩을 포함한 미세 유체 장치입니다 7,8,9. 이와 관련된 액체 기반 배양 방법은 다중 웰 플레이트를 사용하여 시간이 지남에 따라 개별 벌레 또는 작은 개체군을 특성화합니다10,11. 미세 유체 및 마이크로플레이트 시스템은 단일 동물에 대한 예쁜꼬마선충의 표현형 반응에 대한 우수한 정량적 측정을 제공하지만 배양 환경에는 주요 한계가 있습니다. 예쁜꼬마선충(C. elegans)에 대한 과거 연구의 대다수, 특히 노화 분야는 고체 한천 기반 배지에서 완료되었습니다. 액체 배양은 예쁜꼬마선충이 지속적으로 헤엄치게 하고 기본 생물학을 바꿀 수 있는 뚜렷한 환경적 맥락을 나타냅니다. 예를 들어, 액체 배지에서 배양된 동물은 한천 기반 고체 NGM12,13에서 배양된 동물에 비해 지방 함량과 유전자 발현(특히 스트레스 반응에 관여하는 유전자의 경우)을 크게 변화시켰습니다. 단일 동물 이미징 방법의 또 다른 범주에는 페트리 플레이트의 그룹 배양에서 고체 NGM에서 배양된 벌레가 경험하는 표준 환경을 보다 밀접하게 모방하기 위해 고체 배지에서 개별 동물을 분리하는 폴리디메틸실록산(PDMS) 장치가 포함됩니다. WorMotel은 고체 배지에서 개별 동물을 배양하도록 설계된 240웰 PDMS 장치입니다. 각 웰은 한천 대신 저융점 아가로스를 사용하여 변형된 NGM으로 채워지고 박테리아 식품으로 시딩되어 페트리 플레이트를 사용하는 가장 일반적인 배양 시스템과 유사한 견고한 배지 환경을 만듭니다. 우물 벽은 둥글기 때문에 우물 내의 위치에 관계없이 각 동물을 이미지화할 수 있습니다(다중 웰 플레이트의 벽 근처에 있는 동물로 인한 시각적 가려짐 방지). 각 우물을 둘러싸고 있는 좁은 해자에 있는 황산구리는 동물을 우물에 가두기 위한 억지력으로 사용된다(14,15). 이 접근법의 한계는 황산구리가 식이 제한, 병원성 박테리아 또는 세포 스트레스를 유발하는 화학 물질(예: 파라콰트)을 포함하여 혐오스러운 환경 조건이 존재할 때 벌레가 도망가는 것을 방지하는 데 효과적이지 않다는 것입니다.

고체 배지를 사용하는 두 번째 시스템은 웜 코랄(Worm Corral)로, 하이드로겔을 사용하여 슬라이드 상의 각 웜에 대해 작은 밀폐 환경을 생성하여, 개별적으로 격리된 동물(16)의 장기 모니터링을 가능하게 한다. 주요 제한 사항은 동물을 알처럼 환경에 밀봉해야 하므로 번식을 방지하기 위해 멸균 동물을 사용해야 하고 약물 치료를 단일 적용으로 제한해야 한다는 것입니다. 다중 용량 약물 시험은 WorMotel에서 웜을 장치로 옮기기 전에 여러 차례의 노출을 수행하거나 실험 중에 웰에 추가 약물을 국소 적으로 추가하여 수행 할 수 있습니다. 그러나 후자의 경우 기존 웰에 추가 약물을 첨가한 후 실제 노출 선량을 정확하게 정량화하기 어렵고 약물이 얼마나 빨리 분해되는지에 따라 달라집니다. WorMotel과 Worm Corral은 모두 명시야 또는 암시야 이미징에 탁월하여 활동 및 동물 생리학(예: 성장 및 발달)과 관련된 정보를 캡처합니다. 이러한 시스템은 형광을 모니터링하는 데 사용할 수 있지만, 우리의 경험에 비추어 볼 때, 다른 단일 웜 이미징 기술을 만드는 데 사용되는 PDMS는 특히 예쁜꼬마선충 연구에 사용되는 가장 일반적인 형광단인 GFP의 방출 범위에서 일관된 형광 시각화 및 정량화를 방해하는 불규칙한 형광 아티팩트를 생성하는 미세 기포를 형성하고, 미립자를 포집하고, 기타 작은 이상을 포착하는 경향이 있습니다. 현재까지, 예쁜꼬마선충 개별 동물의 종방향 방식의 생형광 이미징은 주로 미세유체 장치17에 의존한다.

여기에서 우리는 혐오 개입과 직접 형광 이미징 모두와 호환되는 고체 배지에서 개별 예쁜꼬마선충을 배양하는 새로운 방법을 설명합니다. 이 접근 방식은 맞춤형 성형 PDMS 칩이 원래 미세 세포 독성 분석용으로 개발된 상업적으로 이용 가능한 폴리스티렌 마이크로트레이(일반적으로 Terasaki 트레이라고도 함)로 대체된다는 점을 제외하면 다른 단일 웜 이미징 기술과 개념이 유사합니다18. 이 마이크로트레이는 고체 배지로 채우고 박테리아 식품으로 씨를 뿌릴 수 있는 웰을 특징으로 하며, 표준 고체 NGM 배양 방법론에 따라 동물이 경험하는 환경을 밀접하게 모방합니다. 각 우물은 황산구리가 아닌 팔미트산의 혐오스러운 장벽으로 둘러싸여 있습니다. 팔미트산은 일반적으로 벌레가 식이 제한이나 화학적 스트레스 요인에 노출되는 것과 같은 혐오스러운 환경에 도전하는 실험에서 페트리 플레이트의 표준 그룹 배양을 사용하여 벌레가 고체 배지에서 도망치는 것을 방지하는 데 사용됩니다. 또한 마이크로트레이는 최소한으로 일관된 형광 배경을 생성하여 배양 환경에서 직접 동물의 형광 이미징을 가능하게 합니다. 이 새로운 단일 동물 고체 한천 기반 배양 시스템은 일생 동안 개별 동물을 추적하고 성장, 발달, 활동 및 수명을 모니터링할 수 있을 뿐만 아니라 직접 형광 현미경과도 호환됩니다. 벌레는 마비나 고정 없이 이미지화할 수 있기 때문에 배양 배지에 남아 있는 개별 동물에서 생체 내 형광 바이오마커를 종단으로 정량화할 수 있어 각 동물의 수명 동안 동적 변화를 관찰할 수 있습니다. 이러한 배양 시스템은 또한 수명 및 다른 건강 지표를 추적하기 위한 현세대 자동화 시스템과도 호환된다(14,19). 우리는 이 마이크로트레이 기반 시스템에서 개별 예쁜꼬마선충을 배양하기 위한 자세한 프로토콜을 제공하고, 잠재적인 함정 및 문제 해결에 대해 논의하고, 다른 시스템, 특히 업데이트되고 최적화된 WorMotel 프로토콜15와 관련된 장점과 한계에 대해 논의합니다.

각 단일 웜 배양 환경은 맞춤형 3D 인쇄 어댑터를 사용하여 표준 단일 웰 트레이 내부에 장착된 마이크로 트레이로 구성됩니다(그림 1A). 우물은 저융점 아가로스 선충 성장 배지(lmNGM)로 채워지고, 농축된 박테리아를 먹이로 씨를 뿌리고, 벌레가 도망가는 것을 방지하기 위해 팔미트산 코팅으로 둘러싸여 있습니다(그림 1B). 마이크로트레이와 단일 웰 플레이트의 벽 사이의 공간은 습도를 유지하기 위해 포화 물 결정으로 채워집니다(그림 1B). 결로를 방지하기 위해 트레이 뚜껑에 세제 코팅이 되어 있습니다. 단일 웜이 각 웰에 추가되고 단일 웰 트레이는 파라필름으로 밀봉되어 수분을 유지하고 산소 교환이 가능합니다. 최대 6개의 마이크로트레이를 한 명의 숙련된 연구원이 병렬로 합리적으로 준비할 수 있습니다.

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프로토콜

1. 조리법

알림: 마이크로트레이 플레이트 준비를 시작하기 전에 스톡 용액을 준비하십시오.

  1. 저융점 아가로스 선충 성장 배지(lmNGM)를 위한 스톡 솔루션
    1. 1 L 병에 1 L의 멸균 탈이온수에 174.18 g의K2HPO4를 용해시켜 1 M K2HPO4를 제조한다. 용액을 121°C, 15psi에서 30분 동안 오토클레이브하고 실온(RT)에서 보관합니다.
    2. 1 L 병에 1 L 멸균 탈이온수 136.09 g의 KH2HPO4를 용해시켜 1MKPi (pH 6.0)를 제조한다. pH 6.0을 달성하기 위해 용액을 1 M K2HPO4로 적정합니다. 용액을 121°C, 15psig에서 30분 동안 오토클레이브하고 RT에 보관합니다.
    3. 500mL 병에 500mL의 멸균 탈이온수에 73.5g의 CaCl2를 용해시켜 1MCaCl2 를 준비합니다. 용액을 121°C, 15psig에서 30분 동안 오토클레이브하고 RT에서 보관
    4. 500mL 병에 500mL의 멸균 탈이온수에 123.25g의MgSO4를 용해시켜 1M MgSO4를 제조합니다. 용액을 121°C, 15psig에서 30분 동안 오토클레이브하고 RT에 보관합니다.
    5. lmNGM용 3M NaCl 준비: 깨끗한 100mL 병에 초순수 100mL와 NaCl 18.20g을 섞습니다. 121°C, 15psig에서 30분 동안 오토클레이브합니다.
    6. 5mL 호박색 병에 콜레스테롤 2.5g, 100% 에탄올 275mL, 멸균 탈이온수 25mL를 혼합하여 5mg/mL 콜레스테롤을 준비합니다. 용액을 121°C, 15psig에서 30분 동안 오토클레이브하고 RT에 보관합니다.
    7. 15mL 원뿔형 튜브에 10mL의 멸균 탈이온수에 0.1231g의 FUdR을 용해시켜 50mM 플루오로데옥시유리딘(FUdR)을 준비합니다. 10mL 주사기와 0.22μm 필터를 사용하여 용액을 멸균합니다. 용액 1mL를 각각 10개의 미세원심분리 튜브에 분취하여 -20°C에서 보관한다.
    8. 500mL 원뿔형 튜브의 멸균 탈이온수 10mL에 500mg의 카르베니실린을 용해시켜 15mg/mL 카르베니실린을 준비합니다. 10mL 주사기와 0.22μm 필터를 사용하여 용액을 멸균합니다. 용액 1mL를 각각 10개의 미세원심분리 튜브에 분취하여 -20°C에서 보관한다.
    9. 15mL 원뿔형 튜브에 10mL의 멸균 탈이온수에 2.38g의 IPTG를 용해시켜 1mM 이소프로필 ß-D-1-티오갈락토피라노시드(IPTG)를 준비합니다. 10mL 주사기와 0.22μm 필터를 사용하여 용액을 멸균합니다. 용액 1mL를 각각 10개의 미세원심분리 튜브에 분취하여 -20°C에서 보관한다.
    10. 100mL 원추형 튜브에 10mL의 멸균 탈이온수에 암피실린 1g을 용해시켜 15mg/mL 암피실린을 준비합니다. 10mL 주사기와 0.22μm 필터를 사용하여 용액을 멸균합니다. 100mg/mL 암피실린 용액 1mL를 각각 10개의 미세원심분리기 튜브에 분취하여 튜브를 -20°C에서 보관합니다.
  2. 일반적인 예쁜꼬마선충 유지를 위한 선충 성장 배지(NGM) 준비
    1. 50개의 플레이트를 만들기 위해 1L 플라스크에 486mL의 초순수에 박토 한천 10g, NaCl 1.5g, 박토 펩톤 1.25g을 녹입니다. 배지를 121°C, 15psig의 액체 사이클에서 최소 30분 동안 고압증기멸균하여 멸균합니다.
    2. 오토클레이브 후 배지를 55°C로 냉각시킵니다. 그런 다음 1M KPi 12.5mL, 1M MgSO4 500μL, 1M CaCl2 500μL, 5mg/mL 콜레스테롤 500μL를 용액에 추가합니다.
    3. 멸균 기술을 사용하여 1.2.2 단계에서 준비된 배지 10mL를 각 60mm 플레이트 (총 50 개)에 붓습니다. 플레이트를 미디어와 함께 최소 30분 동안 그대로 두어 굳힙니다. 하룻밤 동안 성장한 박테리아 배양액 300μL를 플레이트 중앙에 피펫팅하고 플레이트를 벤치에 둡니다. 배양 물이 건조되고 1-2 일 동안 두껍게 자랄 수 있습니다. 이 NGM 플레이트를 박테리아와 함께 4°C에서 보관하십시오.
  3. lmNGM 프리믹스 준비
    1. 250mL 삼각 플라스크에 저융점 아가로스 2g, 펩톤 0.25g, 3M NaCl 1mL, 초순수 99mL를 섞습니다. 용액을 121°C, 15psig에서 30분 동안 오토클레이브합니다.
    2. lmNGM 10mL를 시험관에 분취하고 Parafilm으로 덮어 액체 손실을 방지합니다. 튜브를 덮고 식히고 굳히십시오.
  4. 박테리아 식품용 85mM NaCl 준비: 100mL 병에 515.61mg의 NaCl을 결합하고 초순수로 최대 100mL를 채웁니다. 121°C, 15psig에서 30분 동안 오토클레이브합니다.
  5. 오토클레이브 가능한 스퀴즈 병에 150mL의 초순수에 Type S 고흡수성 폴리머 1g을 용해시켜 흡수성 폴리아크릴아미드 결정을 준비합니다. 적절한 투약 크기를 보장하기 위해 팁을 자릅니다. 121°C, 15psig에서 30분 동안 오토클레이브하고 은박지로 캡핑하고 흔들어 결정을 섞습니다.
  6. 15mL 원뿔형 바이알에 3mL의 100% Tween-20과 7mL의 초순수를 혼합하여 세제 용액을 준비합니다.
  7. 500mL 병에 콜레스테롤 2.5g, 100% EtOH 275mL, 초순수 25mL를 섞어 콜레스테롤 5mg/mL를 준비합니다.
  8. 팔미트산 작업 용액 준비
    1. 모르타르와 유봉에서 500mg의 고체 팔미트산을 갈아서 50mL 원추형 바이알에 15mL의 Tween-20과 결합합니다. 소용돌이로 혼합하여 가능한 한 많은 결정을 녹입니다.
    2. 100 % 에탄올 17.5mL를 넣고 용액을 소용돌이 치면 가능한 한 많은 팔 미트 산이 용해됩니다.
    3. 초순수 17.5mL를 넣고 세게 소용돌이칩니다. 팔미트산이 완전히 용해될 때까지 80°C의 비드 배스에서 용액을 부드럽게 가열합니다. 일부 팔미트산은 냉각 중에 침전될 수 있습니다.
  9. 1L 이상의 비커에서 1L의 탈이온수에 20g의 LB 분말을 혼합하여 용원성 액체(LB)를 준비합니다. 500mL의 배양액을 500mL 비커 2개에 분취합니다. 국물을 121°C, 15psig에서 30분 동안 오토클레이브합니다. 준비된 국물을 RT에 보관하십시오.
  10. 용원성 브로스(LB) 한천 플레이트 준비
    1. 1L 플라스크에 500μL의 탈이온수에 LB 분말 10g과 Bacto 한천 7.5g을 섞습니다. 용액을 121°C, 15psig에서 30분 동안 액체 사이클로 오토클레이브합니다.
    2. 원하는 경우 오토클레이브 배지를 55°C로 냉각한 후 선택적 항생제(100μg/mL 암피실린 500μL)를 추가합니다. 멸균 기술을 사용하여 각 100mm 플레이트(총 25개)에 20mL의 배지를 부어 LB 한천 플레이트를 만듭니다. 플레이트를 4°C에서 보관하십시오.

2. 연령 동기화 웜 개체군 준비

  1. 유충 4단계(L4)에서 마이크로트레이에 추가할 준비가 된 연령 동기화 벌레 개체군을 준비합니다. 또는 모든 수명 단계의 웜을 추가할 수 있습니다(발달 정지를 방지하기 위해 L4 이전의 발달 단계에서 웜을 추가하는 경우 FUdR을 마이크로트레이 매체에서 제외해야 함).
    알림: 이 단계는 목표 수명 s인 경우 마이크로트레이에 웜을 추가하기 2일 전에 완료해야 합니다.tage 실험 시작 시 L4입니다. 동기화 타이밍은 웜이 원하는 수명 단계에 도달할 수 있도록 조정할 수 있습니다.
  2. 온도는 수명에 영향을 줄 수 있습니다. 일관된 결과를 얻으려면 표준 NGM 플레이트(섹션 1 참조)를 사용하여 예쁜꼬마선충 을 20°C로 유지하고 박테리아 식품이 부족한 경우 벌레를 신선한 플레이트로 옮깁니다.
  3. 젊은 성충이 많은 스톡 플레이트에서 표준 접근법을 사용하여 연령 동기화 개체군을 생성하며, 가장 일반적으로 표백20 또는 시간 제한 알을 낳습니다21.
  4. 계란을 분리하여 박테리아가 발견된 NGM 플레이트에 추가합니다. 야생형 예쁜꼬마선충을 사용하면 알이 부화하여 벌레를 형성하여 2일 만에 L4 애벌레 단계에 도달합니다.

3. 세균 배양 준비

  1. 실험 시작 전날, 원하는 박테리아 식품 공급원을 접종하십시오. 플레이트당 ~5mL의 박테리아 배양을 준비합니다.
    참고: 박테리아 줄무늬는 최대 1개월 전에 준비할 수 있으며 대장균 식품 공급원을 위해 4°C에서 보관할 수 있습니다.
    1. 동결된 글리세롤 스톡에서 LB 한천 플레이트에 단일 콜로니에 대한 박테리아를 줄무늬로 만듭니다.
    2. 배양액을 37°C에서 하룻밤 동안 성장시킨다.
    3. 액체 LB 국물에 접종당 단일 콜로니를 접종합니다.
    4. 37°C에서 ~250rpm으로 12-16시간 동안 흔들어줍니다.

4. 마이크로트레이에 팔미트산 코팅 도포

알림: 팔미트산은 개별 우물에서 동물이 도망가는 것을 방지하는 혐오스러운 장벽 역할을 합니다. 코팅은 웰의 내부 표면을 제외하고 마이크로 트레이의 전체 바닥 표면에 적용됩니다. Nystatin은 곰팡이 오염을 완화하기 위해 팔미트산에 첨가됩니다. 이 단계는 원하는 경우 실험 시작 1일 전에 완료할 수 있습니다.

  1. 예열 시간을 허용하기 위해 비드 수조를 80°C로 설정합니다.
  2. 사용 직전에 마이크로트레이당 팔미트산 작업 용액 1mL를 별도의 멸균 용기(일반적으로 15mL 원추형 바이알)에 분취하고 가열하기 전에 팔미트산 용액 1mL당 10,000단위/mL 니스타틴 4μL를 추가합니다.
  3. 마이크로트레이 내부와 외부에 에탄올(70% 이상)을 포화 상태로 뿌리고 과도한 에탄올을 털어냅니다.
    참고: 잔류 에탄올은 UV 가교 처리 중에 증발해야 합니다(단계 4.4).
  4. UV 가교제를 사용하여 마이크로트레이를 멸균합니다(다음 지침은 이 연구에 사용된 UV 가교제에 대한 것입니다).
    1. 마이크로트레이와 뚜껑을 UV 가교제에 별도로 놓습니다(즉, UV가 플라스틱을 관통하지 않으므로 플레이트 위에 뚜껑을 놓지 마십시오).
    2. 도어를 닫고 UV 가교제를 켭니다.
    3. Time(시간)을 누르고 20분을 입력한 다음 Start(시작)를 누릅니다.
    4. 20분 후 접시와 뚜껑을 뒤집고 4.2.2-4.2.3단계를 반복합니다.
    5. 장갑을 끼고 멸균 후 오염을 방지하기 위해 마이크로트레이에 뚜껑을 덮으십시오.
  5. 팔미트산 작업 용액을 vortexing 및 inverting으로 철저히 혼합하십시오.
  6. 팔미트산 작업 용액이 담긴 15mL 원뿔형 바이알을 비드 배스에 넣고 사용하기 전에 눈에 보이는 결정이 완전히 용해되도록 합니다.
  7. 비드 수조를 둘러싼 선반에 마이크로트레이를 놓고 뚜껑을 덮고 ~2분 동안 예열합니다.
  8. 마이크로트레이 덮개를 제거합니다. 마이크로트레이의 뒤쪽 벽(긴 쪽)에 200μL의 팔미트산 작업 용액을 천천히 추가합니다. 뚜껑을 교체하고 마이크로트레이를 비드 수조에 2-3분 동안 그대로 두어 팔미트산 용액이 마이크로트레이 바닥에 가라앉도록 합니다.
    알림: 마이크로트레이의 전체 바닥은 4.10단계까지 완전히 코팅되지 않지만 용액은 바닥 표면의 절반 이상에 고르게 퍼져야 합니다. 팔미트산 용액이 고르게 퍼지지 않으면 마이크로트레이 근처에서 소용돌이 또는 진동 모터를 켭니다. 이것은 팔미트산 용액이 더 쉽게 퍼질 수 있도록 하는 데 도움이 될 수 있는 소량의 진동을 제공합니다. 오염을 완화하기 위해 마이크로트레이 뚜껑을 제자리에 두십시오.
  9. 4.8단계를 반복합니다.
    알림: 마이크로트레이 바닥의 약 절반 이상이 액체 팔미트산으로 눈에 띄게 덮여 있어야 합니다.
  10. 마이크로트레이를 180° 회전하고 트레이의 반대쪽에서 4.8단계와 4.9단계를 반복합니다.
    알림: Terasaki 트레이의 바닥은 전체 결합 부피가 양쪽에 추가된 후에만 팔미트산 용액의 얇은 층으로 덮여 있습니다(4.9 및 4.10단계). 더 많거나 적은 팔미트산 혼합물은 혼합물 준비, 온도, 및 다른 요인에 따라 요구될 수 있다. 일반적으로, 400 내지 800 μL의 팔미트산 혼합물은 마이크로트레이의 전체 바닥을 코팅하기에 충분할 것이다. 마이크로트레이의 바닥이 눈에 띄게 덮이자마자 팔미트산을 추가로 첨가해서는 안 되는데, 이는 웰을 오염시킬 수 있기 때문입니다.
  11. 멸균 건조 상자 또는 층류 후드에서 뚜껑을 덮지 않은 상태로 최소 1시간 동안 트레이를 건조시킵니다. 또는 플레이트를 넣기 전날(섹션 5)에 이 단계를 완료하고 RT에서 뚜껑을 덮은 상태에서 마이크로트레이를 최소 16시간 동안 건조시킵니다.

5. 마이크로트레이에 저융점 선충 성장 배지(lmNGM) 로딩

참고: 이 방법은 일반적인 한천 대신 저융점 아가로스와 혼합된 표준 NGM을 사용합니다. 한천은 45°C에서 겔화되기 시작할 수 있습니다. 마이크로트레이 웰을 채우는 데 필요한 소량으로 작업할 때 한천 기반 NGM은 종종 피펫 팁을 막거나 빠른 겔화로 인해 고르지 않은 웰 표면을 생성합니다. 저융점 아가로스를 사용하는 NGM은 ~28°C에서 겔화되기 시작하여 용융된 매체를 쉽게 피펫팅하고 평평하고 우물 표면을 일관되게 형성할 수 있습니다. 웜을 마이크로트레이에 놓는 날에 lmNGM을 준비합니다. lmNGM으로 마이크로트레이를 준비하고, 박테리아를 파종하고, 예쁜꼬마선충 을 모두 같은 날 안에 로딩하는 경우 이 일련의 단계를 시작하기 전에 동물이 원하는 연령 또는 그 근처에 있는지 확인하십시오.

  1. 피펫 수조를 80°C 비드 배스에 넣어 예열합니다.
  2. 마이크로레인지에서 준비 중인 마이크로트레이당 10mL lmNGM 예비혼합물 1개(1.1단계)를 ~30-45초 동안 녹입니다.
    1. lmNGM 예혼합물 시험관을 200mL 비커에 넣고 뒤집히지 않도록 덮습니다.
    2. ~10-15초 후 또는 lmNGM 예비혼합물이 거품이 나기 시작하면 전자레인지를 일시 중지하고 lmNGM 예혼합물을 멸균된 200mL 비커에 붓고 전자레인지를 다시 돌립니다.
    3. 끓는 것을 방지하기 위해 필요에 따라 일시 중지하고 소용돌이치며 섞습니다.
    4. 모든 lmNGM이 덩어리 없이 액체로 변하면 전자레인지를 중지하십시오.
      참고: 단일 10mL 분취액은 총 192웰(마이크로트레이 2개)을 채우기에 충분합니다.
  3. 따뜻한 저융점 아가로스에 나열된 순서로 다음 성분을 첨가하여 lmNGM을 준비합니다(부피는 저융점 아가로스 10mL당): 250μL의 25mM KPi(pH 6), 10μL의 1MCaCl2, 10μL의 1M MgSO4 및 10μL의 5mg/mL 콜레스테롤
    1. 연구원이 시간이 지남에 따라 성체 동물을 검사할 계획이고 번식을 방지해야 하는 경우 50mM FUdR 10μL도 추가합니다.
    2. 일반적인 HT115 RNAi E. coli 균주 및 관련 RNAi 플라스미드를 사용하여 RNAi 공급 실험을 수행하는 경우 5μL의 50mg/mL 카베니실린(RNAi 플라스미드 선택)과 12μL의 1mM IPTG(RNAi 플라스미드에서 이중 가닥 RNA의 발현 유도)도 추가합니다.
      알림: 원하는 식품 공급원에 필요한 선택적 항생제 및 기타 화학 물질에 따라 추가 첨가제가 포함될 수 있습니다. 이 단계에서 약물 또는 화학적 스트레스 요인도 lmNGM에 추가 될 수 있습니다. NGM과 lmNGM은 동일한 최종 농도의 NaCl을 포함하지만 NaCl이 배지에 첨가되는 방식이 다릅니다. NGM의 경우 배지 준비 중에 모든 NaCl이 추가됩니다(단계 1.2). lmNGM의 경우, NaCl의 일부는 배지 준비 (단계 5.3) 동안 첨가되고 일부는 박테리아 식품 (섹션 6)과 함께 첨가됩니다. 이러한 변경의 이유는 각 마이크로트레이 웰의 용지 부피가 작기 때문입니다. 20 μL의 배지가 들어 있는 웰에 LB에 현탁된 농축 박테리아 5 μL를 추가하면 배지의 영양소 조성이 크게 변경됩니다(LB 성분을 비슷한 부피로 추가함으로써). 이를 방지하기 위해 박테리아는 대신 NaCl 용액에 재현탁되어 LB 성분을 제거하고 박테리아에 대한 삼투압 스트레스를 방지합니다. 배지에 첨가된 NaCl은 박테리아에 첨가된 염을 설명하기 위해 그에 따라 감소됩니다.
  4. lmNGM을 따뜻한 피펫 대야에 붓습니다.
  5. 벤치탑에 마이크로트레이를 놓고 20μL의 lmNGM을 각 마이크로트레이에 피펫팅합니다. 오염을 최소화하기 위해 피펫을 리필할 때 마이크로트레이를 덮으십시오.
    알림: 이 단계는 전자식 반복 파이펫을 사용하면 더 쉽습니다.

6. 박테리아 음식으로 마이크로 트레이 웰 파종

참고: 하룻밤 접종한 배양액에서 얻은 10배 농축 식품 5μL는 예쁜꼬마선충 한 마리의 전체 수명 동안 먹이기에 충분합니다.

  1. 하룻밤 배양에서 박테리아를 50mL 원추형 바이알로 옮깁니다.
  2. ~3,500 x g 에서 20분 동안 원심분리기.
  3. 상청액을 제거합니다. 박테리아 배양액을 85mM NaCl 용액으로 10배 농도(원래 배양액의 1/10 부피)로 재현탁합니다.
  4. 웰에 박테리아를 추가하기 전에 마이크로트레이를 육안으로 검사하여 고체 lmNGM이 각 웰 내에 완전히 포함되어 있는지 확인합니다. lmNGM이 우물 측면에 매달려 있는 경우 피펫 팁으로 초과 lmNGM을 긁어냅니다. 이 과도한 배지는 제거되지 않으면 음식이 팔미트산에 빠지게 할 수 있습니다.
  5. 10배 농축 박테리아 배양액 5μL를 각 웰의 lmNGM 표면에 조심스럽게 피펫팅합니다. 박테리아 배양액이 우물 옆을 지나 팔미트산으로 흘러 들어가면 벌레가 우물을 떠나도록 유인할 수 있으므로 피하십시오.
  6. 마이크로트레이를 멸균 건조 상자 또는 층류 후드에서 ~35분 동안 건조시킵니다. ~5분마다 확인하고 과도하게 건조되지 않도록 주의하세요. 선충류가 추가되는 동안 우물이 더 건조되므로 몇 개의 우물이 눈에 띄게 약간 젖었을 때 제거하십시오.

7. 각 마이크로트레이를 단일 웰 플레이트 안에 넣습니다.

알림: 이 섹션에서 마이크로트레이는 맞춤형 3D 프린팅 인서트를 사용하여 표준 단일 웰 플레이트 내부에 장착되고 수분 흡수 결정으로 둘러싸여 있습니다. 그런 다음 단일 웰 플레이트를 닫고 Parafilm으로 밀봉합니다. 이를 통해 오염을 방지하고 충분한 습도를 유지하면서 산소 교환이 가능하여 여러 주간의 실험 과정에서 lmNGM이 건조되는 것을 방지할 수 있습니다(수명 연장 돌연변이 또는 환경 조건을 검사하는 경우 웜 수명 실험은 6-8주 동안 지속될 수 있음). 준비하는 동안 박테리아 또는 곰팡이 오염을 최소화하기 위해 무언가를 적극적으로 추가하지 않을 때마다 접시를 덮으십시오.

  1. 단일 웰 플레이트와 3D 프린팅 어댑터 및 뚜껑을 각각 10% 표백제 용액에 담가 멸균합니다. 멸균 DI 물로 철저히 헹굽니다. 작업 물티슈로 물기를 닦아냅니다.
  2. 단일 웰 플레이트와 3D 프린팅 어댑터 및 뚜껑에 70% 이상의 에탄올 용액을 뿌리고 작업 물티슈로 깨끗이 닦습니다. 잔류 에탄올을 자연 건조시키십시오.
    알림: UV 방사선은 위의 4.4단계에서 설명한 대로 마이크로트레이와 동일한 매개변수로 표백제와 에탄올 후에도 사용할 수 있습니다.
  3. 멸균 3D 프린팅 인서트를 멸균 단일 웰 플레이트에 넣습니다.
  4. 준비된 마이크로트레이의 외부를 70% 에탄올로 분사하여 소독합니다.
  5. 마이크로트레이를 단일 웰 플레이트의 3D 프린팅 어댑터에 넣습니다.
  6. 마이크로트레이 덮개를 폐기합니다.
  7. 마이크로트레이의 외벽과 단일 웰 플레이트의 내벽 사이의 3D 프린팅 인서트 위에 물 결정을 자유롭게 분배합니다.
  8. 즉시 웜을 추가하거나(섹션 8) 다음날 사용할 수 있도록 마이크로트레이를 밀봉하십시오. 트레이 뚜껑을 닫고 Parafilm 한 조각을 사용하여 4면을 모두 감싸 마이크로트레이를 밀봉합니다. Parafilm으로 밀봉 단계를 두 번 더 반복하여 총 3개의 층을 만듭니다.
  9. 마이크로트레이를 밀봉한 후 웜을 추가하기 전에 최대 4일 동안 RT에서 벤치에 두십시오(섹션 8).

8. 마이크로트레이에 웜 추가

알림: 플래티넘 픽을 사용하여 연령 동기화 웜 개체군(섹션 2)에서 동물을 옮겨 각 웰에 하나의 웜을 수동으로 추가할 수 있습니다. 원하는 생애 단계에서만 동물을 옮깁니다. 이송 공정에 1시간 이상 걸리면 마이크로트레이 웰의 lmNGM이 건조될 수 있습니다. 한 번에 10-20 마리의 벌레 그룹을 옮기면이 단계를 앞당길 수 있지만 우물 당 한 마리의 동물 만 일관되게 방출하려면 약간의 연습이 필요합니다.

  1. 원하는 수명 단계에 도달하면 우물당 하나의 선충을 추가합니다.
  2. 오염을 최소화하기 위해 소스 플레이트에서 벌레를 피킹할 때 마이크로트레이 위에 뚜껑을 다시 놓습니다.

9. 장기간 사용을 위한 배양환경 준비 마무리

알림: 아래 단계는 실험 기간 동안 마이크로트레이의 미디어와 웜이 수분 상태를 유지하도록 하기 위해 수행됩니다.

  1. ~40μL의 세제 용액을 단일 웰 플레이트의 뚜껑에 넣고 작업 물티슈를 사용하여 뚜껑을 고르게 코팅합니다. 이 코팅은 플레이트가 밀봉되면 시간이 지남에 따라 결로를 방지합니다. 추가 작업용 물티슈를 사용하여 뚜껑을 통한 시야가 왜곡되지 않을 때까지 세제 용액을 펴십시오(일반적으로 약 두 번의 작업용 물티슈가 필요함).
  2. 물 결정을 검사하여 마이크로트레이의 상단 가장자리와 수평을 이루고 넘치지 않는지 확인합니다. 필요한 경우 플레이트에 물 결정을 추가하거나 제거하십시오.
  3. 다음 방법을 사용하여 트레이를 Parafilm(총 3개)으로 감싸서 Parafilm 씰이 장기간 지속되도록 합니다.
    1. Parafilm의 첫 번째 조각을 약간 늘려 트레이의 양면을 덮습니다.
    2. Parafilm의 두 번째 조각을 약간 늘리고 트레이의 나머지 면을 덮습니다.
    3. 파라필름의 마지막 조각을 펴고 트레이의 네 면을 완전히 감싸고 파라필름의 첫 번째와 두 번째 조각을 덮습니다. 적절하게 밀봉된 마이크로트레이는 ~2개월 동안 수분을 유지할 수 있습니다.
      알림: 실험 전반에 걸쳐 1-2주마다 Parafilm 무결성을 모니터링하고 필요에 따라 교체하십시오.
    4. 작업 물티슈로 트레이 상단을 닦고 damp 70% 에탄올로 지문을 제거합니다.
  4. 테이프를 사용하여 단일 웰 플레이트에 라벨을 붙입니다. 이제 마이크로트레이는 시간이 지남에 따라 웜을 모니터링하기 위해 이미징 및 장기 보관이 가능합니다. 이미징 세션 사이에 트레이를 20°C로 유지하십시오. 마이크로트레이는 약물 투여 또는 기타 절차를 위해 여러 번 개봉하고 다시 밀봉할 수 있지만 오염 및 수분 손실을 방지하기 위해 최소화해야 합니다.

10. 마이크로트레이 웰에서 개별 웜 이미징

참고: 이 프로토콜의 목적은 마이크로트레이 배양 환경을 준비하는 방법에 대한 자세한 설명을 제공하는 것입니다. 일단 준비되고 웜으로 채워지면, 마이크로트레이 단일 웜 배양 환경은 페트리 플레이트의 표준 배양을 위해 확립된 기술을 사용하여 많은 표현형을 세로적으로 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다. 다음 섹션에서는 몇 가지 일반적인 표현형을 측정하기 위한 기본 지침을 제공합니다. 형광 이미징은 정립 현미경으로 수행해야 합니다. Terasaki 트레이를 통한 빛의 굴절은 어두운 방에서 최소화됩니다.

  1. 수명: 접시의 측면이나 상단을 부드럽게 두드리거나 접시에 밝은 파란색 빛을 비추고 각 동물을 관찰하여 수명을 측정합니다. 동물이 몇 초 안에 움직이지 않으면 "죽은"점수를 매기십시오. 모든 웜이 죽을 때까지 1-3일마다 이 작업을 반복합니다.
    참고: 마이크로트레이 배양 환경은 수명 추정을 위해 이미지 수집 및 분석을 자동화하는 시스템과 호환됩니다14,19.
  2. 표준 현미경: 고해상도 카메라 또는 스캐너를 사용하여 개별 웰 또는 전체 트레이에서 명시야(또는 암시야) 이미징을 수행합니다. 이 이미징 데이터는 동물 크기 22,23,24, 발달 25, 활동14,19 및 수명을 포함한 다양한 표현형에 사용할 수 있습니다.
  3. 형광 현미경: 단일 웰에서 수동으로 또는 전동 플랫폼 시스템을 사용하여 형광 이미징을 수행합니다. 단일 웰 트레이는 표준 멀티 웰 플레이트 어댑터와 호환됩니다. 장치를 검은 벽 상자에 넣으면 신호 대 잡음이 최소화됩니다.
    참고: 웜은 자유롭게 기어 다닐 수 있는 상태에서 이미지화되기 때문에 이 배양 시스템은 전신 형광 및 형광단의 거친 조직 국소화를 캡처하기 위한 저해상도 이미징에 매우 적합합니다. 고해상도 및 고배율 이미징은 일반적으로 움직임을 방지하기 위해 동물을 고정시켜야 합니다. 마비제(예: 아지드화나트륨 또는 레바미솔)를 각 웰에 국소적으로 도포하고 고해상도 이미징을 진행할 수 있어야 하지만, 이는 이후 시점에서 동일한 웜을 반복적으로 측정하는 것을 배제합니다. 설명된 바와 같이 배양 시스템은 또한 반전되도록 의도되지 않아 도립 현미경 시스템의 사용을 방지합니다.
    1. 명시야를 사용하여 수명을 측정하지 않고 형광만 캡처하는 경우 수명을 수동으로 측정합니다. 웜에 파란색 빛(GFP 여기에 사용됨)을 5초 동안 그대로 두면 동물이 움직이게 됩니다. 동물이 5 초 이내에 움직이지 않으면 동물을 죽은 것으로 간주하십시오.

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결과

여기에 설명된 마이크로트레이 기반 단일 벌레 배양 환경은 수명 및 건강 기간, 활동 및 움직임, 체형 및 크롤링 기하학, 시간 경과에 따른 개별 동물에서 형질전환적으로 발현된 형광 바이오마커의 발현을 포함한 다양한 표현형을 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다. 마이크로트레이 배양 시스템은 수동 스코어링 또는 이미지 수집 및 다운스트림 이미징 분석을 통한 수명 분석과 호환됩니다. 페...

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토론

여기에서는 원래 인간 백혈구 항원 조직 유형 분석을 위해 개발된 마이크로트레이를 적용하여 C. elegans 연구의 표준인 한천 기반 NGM과 맥락적으로 유사한 고체 배지 환경에서 시간이 지남에 따라 단일 예쁜꼬마선충의 분리 및 특성화를 허용하는 새로운 배양 시스템에 대해 설명합니다. 이 시스템은 식이 제한, 외인성 약물 치료, 화학적 또는 환경적 스트레스 요인에 대한 도전 및 RNAi?...

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공개

저자는 공개할 이해 상충이 없다고 말합니다.

감사의 말

이 작업은 GLS에 대한 NIH R35GM133588, LE에 대한 NIHT32GM008659 교육 보조금, GLS에 대한 미국 국립 의학 아카데미 촉매 상, 애리조나 이사회에서 관리하는 애리조나 주 기술 및 연구 이니셔티브 기금의 지원을 받았습니다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
3D-printed terasaki insertsCustom printing companyRobot_Terasaki_tray_insert_10-20
-2021.STL		FDM printing, nozzle size 0.6 mm using standard PLA plus filament
AirClean systems AC624LF vertical laminar flow fume hoodFisher Scientific36-100-4376
Bacto peptoneThermo Scientific211677
CaCl2Acros organics349615000
Caenorhabditis elegans N2Caenorhabditis Genetics Center (CGC)N2Wildtype strain
CarbenicillinGoldbioC-103-25
CholesterolICN Biomedicals Inc101380
Escherichia coli OP50 Caenorhabditis Genetics Center (CGC)OP50Standard labratory food for C. elegans
EthanolMilliporeex0276-4
Fisher Vortex Genie 2Fisher ScientificG-560
FUdR Research Products InternationalF10705-1.0
Hydrating water crystals M2 Polymer TechnologiesType SType S super absorbent polymer
Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)GoldBioI2481C100
K2HPO4Fisher ChemicalP288-500
KimwipesKimTech34155Task wipes
LB Broth, LennoxBD Difco240230
Leica K5 sCMOS monochrome cameraLeica Microsystems11547112
Leica M205 FCA Fluorescent Stereo MicroscopeLeica Microsystems10450826
Low-melt agaroseResearch Products InternationalA20070-250.0
MgSO4 Fisher ChemicalM-8900
NaClFisher bioreagentsBP358-1
Nunc OmniTray Single-Well PlateThermo Scientific264728
NystatinSigmaN1538
Palmitic acidAcros organics129700010
Paper towelsCoastwide Professional365374
Parafilm MParafilm16-101
Stratagene UV Stratalinker 2400Stratagene400075UV crosslinker
Terasaki trays (Lambda)One Lambda151431
Thermolyne Dri-bathThermolyneDB28125
Tween Thermo ScientificJ20605-AP

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