JoVE Logo
Autoren
Kontakt

Anmelden

Zum Anzeigen dieser Inhalte ist ein JoVE-Abonnement erforderlich. Melden Sie sich an oder starten Sie Ihre kostenlose Testversion.

In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll vor, um isolierte einzelne Nematoden auf festen Medien zu kultivieren, um eine lebenslange Verfolgung physiologischer Parameter und eine Fluoreszenzquantifizierung zu ermöglichen. Dieses Kultursystem umfasst eine Palmitinsäurebarriere um einzelne Wurmbrunnen, um die Flucht der Tiere zu verhindern, was den Einsatz aversiver Interventionen, einschließlich pathogener Bakterien und chemischer Stressoren, ermöglicht.

Zusammenfassung

Caenorhabditis elegans wird häufig zur Erforschung der Biologie des Alterns verwendet. Die Standardpraxis in Studien zum Altern von C. elegans besteht darin, Gruppen von Würmern auf soliden Nematoden-Wachstumsmedien (NGM) zu kultivieren, was die effiziente Erfassung von Daten auf Populationsebene für das Überleben und andere physiologische Phänotypen sowie die regelmäßige Probenahme von Subpopulationen zur Quantifizierung fluoreszierender Biomarker ermöglicht. Einschränkungen dieses Ansatzes sind die Unfähigkeit, (1) einzelne Würmer über die Zeit zu verfolgen, um Altersverläufe für Phänotypen von Interesse zu entwickeln, und (2) fluoreszierende Biomarker direkt im Kontext der Kulturumgebung zu überwachen. Alternative Kulturansätze verwenden Flüssigkultur oder Mikrofluidik, um einzelne Tiere im Laufe der Zeit zu überwachen, in einigen Fällen einschließlich Fluoreszenzquantifizierung, mit dem Kompromiss, dass sich die Kulturumgebung kontextuell von festem NGM unterscheidet. Das WorMotel ist ein zuvor beschriebenes mikrofabriziertes Multi-Well-Gerät zur Kultivierung isolierter Würmer auf festem NGM. Jeder Wurm wird in einem Brunnen mit festem NGM gehalten, der von einem mit Kupfersulfat gefüllten Graben umgeben ist, einem Kontaktschutzmittel für C. elegans, das eine longitudinale Überwachung der einzelnen Tiere ermöglicht. Wir stellen fest, dass Kupfersulfat nicht ausreicht, um Würmer an der Flucht zu hindern, wenn sie aversiven Eingriffen ausgesetzt sind, die in der Alternsforschung üblich sind, einschließlich Ernährungseinschränkungen, pathogenen Bakterien und chemischen Wirkstoffen, die zellulären Stress induzieren. Die Multi-Well-Geräte sind ebenfalls aus Polydimethylsiloxan geformt, das bei der Fluoreszenzbildgebung hohe Hintergrundartefakte erzeugt. Dieses Protokoll beschreibt einen neuen Ansatz für die Kultivierung isolierter Fadenwürmer auf festem NGM unter Verwendung kommerziell erhältlicher Polystyrol-Mikroschalen, die ursprünglich für die Typisierung des humanen Leukozytenantigens (HLA) entwickelt wurden und die Messung des Überlebens, der physiologischen Phänotypen und der Fluoreszenz über die gesamte Lebensspanne ermöglichen. Eine Palmitinsäurebarriere verhindert die Flucht von Würmern, auch bei aversiven Bedingungen. Jede Platte kann bis zu 96 Tiere kultivieren und passt sich leicht an eine Vielzahl von Bedingungen an, einschließlich diätetischer Restriktionen, RNAi und chemischer Zusätze, und ist mit automatisierten Systemen zur Erfassung von Lebensdauer- und Aktivitätsdaten kompatibel.

Einleitung

C. elegans sind ein leistungsfähiger Modellorganismus für die Forschung in Genetik, Zellbiologie und Molekularbiologie, da sie leicht im Labor kultiviert werden können, eine kurze Generationszeit und Lebensdauer haben, ein hohes Maß an Proteinhomologie mit Säugetieren teilen und eine transparente Körperstruktur aufweisen, die die In-vivo-Visualisierung von fluoreszierenden Proteinen und Farbstoffen ermöglicht1. Als Ergebnis der langjährigen Verwendung von C. elegans als wichtiges Modellsystem in einer Reihe von Bereichen, einschließlich der Entwicklungsbiologie und des Alterns, sind ihr Wachstum und ihre Entwicklung gut verstanden, ihr Genom wurde vollständig sequenziert und eine Vielzahl leistungsfähiger genetischer Werkzeuge wurde entwickelt, darunter genomweite RNAi-Fütterungsbibliotheken und Tausende von mutierten und transgenen Stämmen. Historisch gesehen werden C. elegans als Populationen auf soliden Agar-Nematoden-Wachstumsmedien (NGM) kultiviert, und Phänotypen werden manuell entweder durch direkte Beobachtung oder durch Bildgebung und nachgelagerte Analyse bewertet. Die Fluoreszenzmikroskopie wird verwendet, um eine Vielzahl von molekularen Phänotypen mit Farbstoffen oder transgen exprimierten Fluoreszenzmarkierungen in einzelnen C. elegans zu erfassen.Bei der Fluoreszenzbildgebung wird in der Regel ein Tier auf Objektträgern mit dünnen Agarosepolstern fixiert oder gelähmt, was invasiv und oft tödlich ist. Es beinhaltet auch den Einsatz von Chemikalien wie Levamisol oder Natriumazid, die möglicherweise in den interessierenden molekularen Prozess eingreifen können 2,3. Zusammen ermöglichen diese Ansätze die Erhebung von Querschnittsdaten auf Populationsebene über ein breites Spektrum von Phänotypen, erlauben jedoch nicht die Verfolgung einzelner Tiere im Laufe der Zeit.

In den letzten Jahren haben sich mehrere Ansätze zur Kultivierung isolierter C. elegans herausgebildet, die es Forschern ermöglichen, dynamische Veränderungen der physiologischen und molekularen Phänotypen von Tieren im Laufe der Zeit mithilfe neuer Bildgebungstechnologien zu erfassen. Eine Kategorie des Ansatzes der C. elegans-Kultur sind mikrofluidische Geräte, darunter WormFarm4, der Nemalife-Chip5 und der "Verhaltens"-Chip von Chronis et al.6, neben verschiedenen anderen 7,8,9. Verwandt damit sind flüssige Kulturmethoden, die Multi-Well-Platten verwenden, um einzelne Würmer oder kleine Populationen über die Zeit zu charakterisieren10,11. Mikrofluidik und Mikrotiterplattensysteme liefern hervorragende quantitative Messungen der phänotypischen Reaktionen in C. elegans bis hinunter zu einem einzelnen Tier, aber die Kulturumgebung stellt eine wesentliche Einschränkung dar. Die überwiegende Mehrheit der bisherigen Forschungen zu C. elegans, insbesondere auf dem Gebiet des Alterns, wurde auf festen Agar-basierten Medien durchgeführt. Die Flüssigkultur führt dazu, dass C. elegans kontinuierlich schwimmt und stellt einen bestimmten Umweltkontext dar, der die zugrunde liegende Biologie verändern kann. Zum Beispiel haben Tiere, die in flüssigen Medien kultiviert wurden, einen drastisch veränderten Fettgehalt und eine drastische Genexpression – insbesondere für Gene, die an der Stressantwort beteiligt sind – im Vergleich zu Tieren, die auf agarbasiertem festem NGM12,13 kultiviert wurden. Eine alternative Kategorie von Einzeltier-Bildgebungsverfahren sind Polydimethylsiloxan (PDMS)-Geräte, die einzelne Tiere auf festen Medien isolieren, um die Standardumgebung von Würmern, die auf festem NGM kultiviert wurden, in Gruppenkultur auf Petriplatten besser nachzuahmen. Das WorMotel ist ein 240-Well-PDMS-Gerät, das für die Kultivierung einzelner Tiere auf festen Medien entwickelt wurde. Jede Vertiefung wird mit einem modifizierten NGM gefüllt, bei dem anstelle von Agar niedrigschmelzende Agarose verwendet wird, und mit bakterieller Nahrung besiedelt, wodurch eine feste Medienumgebung entsteht, die dem gängigsten Kultursystem mit Petriplatten ähnelt. Die Wände des Brunnens sind rund, so dass jedes Tier unabhängig von seinem Standort im Brunnen abgebildet werden kann (wodurch die visuelle Verschleierung durch ein Tier in der Nähe einer Wand in einer Multiwell-Platte vermieden wird). Kupfersulfat in einem schmalen Graben, der jeden Brunnen umgibt, wird als Abschreckungsmittel verwendet, um Tiere in ihren Brunnen zu halten14,15. Eine Einschränkung dieses Ansatzes besteht darin, dass das Kupfersulfat unwirksam ist, um Würmer an der Flucht zu hindern, wenn aversive Umweltbedingungen vorliegen, einschließlich Ernährungseinschränkungen, pathogener Bakterien oder Chemikalien, die zellulären Stress induzieren (z. B. Paraquat).

Ein zweites System, das feste Medien verwendet, ist der Worm Corral, bei dem ein Hydrogel verwendet wird, um für jeden Wurm auf einem Objektträger eine kleine versiegelte Umgebung zu schaffen, die eine Langzeitüberwachung einzelner isolierter Tiere ermöglicht16. Eine wesentliche Einschränkung besteht darin, dass Tiere als Eier in der Umwelt versiegelt werden müssen, was die Verwendung steriler Tiere erfordert, um die Fortpflanzung zu verhindern, und die medikamentöse Behandlung auf eine einzige Anwendung beschränkt. Mehrdosis-Arzneimittelstudien können im WorMotel durchgeführt werden, indem entweder mehrere Expositionsrunden durchgeführt werden, bevor die Würmer auf das Gerät übertragen werden, oder indem während des Experiments zusätzliche Medikamente topisch in die Vertiefungen gegeben werden. Im letzteren Fall ist die tatsächliche Expositionsdosis nach Zugabe eines zusätzlichen Medikaments zu einer bestehenden Bohrung jedoch schwer genau zu quantifizieren und hängt davon ab, wie schnell das Medikament abgebaut wird. Sowohl das WorMotel als auch der Worm Corral eignen sich hervorragend für Hellfeld- oder Dunkelfeldaufnahmen, um Informationen über Aktivität und Tierphysiologie (z. B. Wachstum und Entwicklung) zu erfassen. Während diese Systeme zur Überwachung der Fluoreszenz verwendet werden können, ist das PDMS, das zur Herstellung der anderen Einzelwurm-Bildgebungstechnologien verwendet wird, unserer Erfahrung nach anfällig für die Bildung von Mikrobläschen, das Einfangen von Partikeln und andere kleine Anomalien, die unregelmäßige Fluoreszenzartefakte erzeugen, die eine konsistente Fluoreszenzvisualisierung und -quantifizierung beeinträchtigen, insbesondere im Emissionsbereich für GFP, den am häufigsten in der C. elegans-Forschung verwendeten Fluorophor. Bisher stützt sich die Live-Fluoreszenzbildgebung von C. elegans-Individuen im Längsschnitt hauptsächlich auf mikrofluidische Geräte17.

In dieser Arbeit beschreiben wir eine neuartige Methode zur Kultivierung einzelner C. elegans auf festen Medien, die sowohl mit aversiven Interventionen als auch mit direkter Fluoreszenzbildgebung kompatibel ist. Dieser Ansatz ähnelt vom Konzept her anderen Einzelwurm-Bildgebungstechnologien, mit der Ausnahme, dass der kundenspezifisch geformte PDMS-Chip durch kommerziell erhältliche Polystyrol-Mikroschalen ersetzt wird, die ursprünglich für Mikrozytotoxizitätsassays entwickelt wurden (auch allgemein als Terasaki-Schalen bezeichnet)18. Diese Mikroschalen verfügen über Vertiefungen, die mit festem Medium gefüllt und mit bakteriellem Futter besiedelt werden können, wodurch die Umgebung, die Tiere mit der Standardmethode der festen NGM-Kultur erleben, genau nachgeahmt wird. Jede Vertiefung ist von einer aversiven Barriere aus Palmitinsäure anstelle von Kupfersulfat umgeben. Palmitinsäure wird häufig verwendet, um Würmer daran zu hindern, aus festen Medien zu fliehen, wobei Standardgruppenkulturen auf Petriplatten in Experimenten verwendet werden, in denen Würmer mit einer aversiven Umgebung wie Ernährungseinschränkungen oder der Exposition gegenüber einem chemischen Stressor konfrontiert werden. Die Mikroschalen erzeugen auch einen minimalen und konsistenten fluoreszierenden Hintergrund, was eine fluoreszierende Bildgebung von Tieren direkt in ihrer Kulturumgebung ermöglicht. Dieses neue Kultursystem auf Basis von festem Agar ermöglicht nicht nur die lebenslange Verfolgung einzelner Tiere und die Überwachung von Wachstum, Entwicklung, Aktivität und Lebensdauer, sondern ist auch mit der direkten Fluoreszenzmikroskopie kompatibel. Da die Würmer ohne Lähmung oder Fixierung abgebildet werden können, können In-vivo-Fluoreszenz-Biomarker in einzelnen Tieren, die auf ihren Nährmedien verbleiben, longitudinal quantifiziert werden, was die Beobachtung dynamischer Veränderungen über die Lebenszeit jedes Tieres ermöglicht. Dieses Kultursystem ist auch mit automatisierten Systemen der aktuellen Generation kompatibel, um die Lebensdauer und andere Gesundheitsmetriken zu verfolgen14,19. Wir stellen ein detailliertes Protokoll für die Kultivierung einzelner C. elegans in diesem Microtray-basierten System zur Verfügung, diskutieren mögliche Fallstricke und Fehlerbehebungen und diskutieren die Vorteile und Einschränkungen im Vergleich zu anderen Systemen und insbesondere ein aktualisiertes und optimiertes WorMotel-Protokoll15.

Jede Einzelschneckenkulturumgebung besteht aus einem Mikrotablett, das mit einem kundenspezifischen 3D-gedruckten Adapter in einem Standard-Single-Well-Tray montiert ist (Abbildung 1A). Die Vertiefungen sind mit niedrigschmelzenden Agarose-Nematoden-Wachstumsmedien (lmNGM) gefüllt, die mit konzentrierten Bakterien als Nahrungsquelle besiedelt und von einer Palmitinsäurebeschichtung umgeben sind, um die Flucht der Würmer zu verhindern (Abbildung 1B). Der Raum zwischen der Mikroschale und den Wänden der Single-Well-Platte ist mit gesättigten Wasserkristallen gefüllt, um die Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten (Abbildung 1B). Der Tablettdeckel wird mit einer Reinigungsmittelbeschichtung versehen, um Kondensation zu verhindern. In jede Vertiefung wird eine einzelne Schnecke gegeben, und die Einvertiefungsschale ist mit Parafilm versiegelt, um die Feuchtigkeit zu erhalten und den Sauerstoffaustausch zu ermöglichen. Bis zu sechs Microtrays können von einem einzigen erfahrenen Forscher sinnvoll parallel präpariert werden.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokoll

1. Rezepte

Anmerkungen: Bereiten Sie Stammlösungen vor, bevor Sie mit der Vorbereitung der Mikroschalenplatte beginnen.

  1. Lagerlösungen für niedrigschmelzende Agarosenematoden-Nährmedien (lmNGM)
    1. Bereiten Sie 1 M K 2 HPO4 vor, indem Sie 174,18 g K2HPO4in 1 l sterilem deionisiertem Wasser in einer 1-Liter-Flasche auflösen. Autoklavieren Sie die Lösung bei 121 °C, 15 psi, für 30 Minuten und lagern Sie sie bei Raumtemperatur (RT).
    2. Bereiten Sie 1 M KPi (pH 6,0) vor, indem Sie 136,09 g KH2HPO4 in 1 l sterilem deionisiertem Wasser in einer 1-Liter-Flasche auflösen. Die Lösung wird mit 1 M K2HPO4 titriert, um einen pH-Wert von 6,0 zu erreichen. Autoklavieren Sie die Lösung bei 121 °C, 15 psig, für 30 Minuten und lagern Sie sie bei RT.
    3. Bereiten Sie 1 M CaCl 2 vor, indem Sie 73,5 g CaCl2 in 500 ml sterilem deionisiertem Wasser in einer 500-ml-Flasche auflösen. Autoklavieren Sie die Lösung bei 121 °C, 15 psig, für 30 Minuten und lagern Sie sie bei RT
    4. Bereiten Sie 1 M MgSO 4 zu, indem Sie 123,25 g MgSO4 in 500 ml sterilem deionisiertem Wasser in einer 500-ml-Flasche auflösen. Autoklavieren Sie die Lösung bei 121 °C, 15 psig, für 30 Minuten und lagern Sie sie bei RT.
    5. Bereiten Sie 3 M NaCl für lmNGM vor: In einer sauberen 100-ml-Flasche 100 ml Reinstwasser und 18,20 g NaCl vermischen. Autoklavieren bei 121 °C, 15 psig, für 30 min.
    6. Bereiten Sie 5 mg/ml Cholesterin zu, indem Sie 2,5 g Cholesterin, 275 ml 100%iges Ethanol und 25 ml steriles deionisiertes Wasser in einer 500-ml-Braunflasche kombinieren. Autoklavieren Sie die Lösung bei 121 °C, 15 psig, für 30 Minuten und lagern Sie sie bei RT.
    7. Bereiten Sie 50 mM Fluordesoxyuridin (FUdR) vor, indem Sie 0,1231 g FUdR in 10 ml sterilem deionisiertem Wasser in einem konischen 15-ml-Röhrchen auflösen. Verwenden Sie eine 10-ml-Spritze und einen 0,22-μm-Filter, um die Lösung zu sterilisieren. Aliquotieren Sie je 1 mL der Lösung in 10 Mikrozentrifugenröhrchen und lagern Sie diese bei -20 °C.
    8. Bereiten Sie 50 mg/ml Carbenicillin zu, indem Sie 500 mg Carbenicillin in 10 ml sterilem deionisiertem Wasser in einem konischen 15-ml-Röhrchen auflösen. Verwenden Sie eine 10-ml-Spritze und einen 0,22-μm-Filter, um die Lösung zu sterilisieren. Aliquotieren Sie je 1 mL der Lösung in 10 Mikrozentrifugenröhrchen und lagern Sie diese bei -20 °C.
    9. Bereiten Sie 1 mM Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) vor, indem Sie 2,38 g IPTG in 10 ml sterilem deionisiertem Wasser in einem konischen 15-ml-Röhrchen auflösen. Verwenden Sie eine 10-ml-Spritze und einen 0,22-μm-Filter, um die Lösung zu sterilisieren. Aliquotieren Sie je 1 mL der Lösung in 10 Mikrozentrifugenröhrchen und lagern Sie diese bei -20 °C.
    10. Bereiten Sie 100 mg/ml Ampicillin zu, indem Sie 1 g Ampicillin in 10 ml sterilem deionisiertem Wasser in einem konischen 15-ml-Röhrchen auflösen. Verwenden Sie eine 10-ml-Spritze und einen 0,22-μm-Filter, um die Lösung zu sterilisieren. Aliquotieren Sie je 1 ml der 100 mg/ml Ampicillinlösung in 10 Mikrozentrifugenröhrchen und lagern Sie die Röhrchen bei -20 °C.
  2. Vorbereitung von Nematoden-Nährmedien (NGM) für die allgemeine Pflege von C. elegans
    1. Um 50 Platten herzustellen, lösen Sie 10 g Bacto-Agar, 1,5 g NaCl und 1,25 g Bacto-Pepton in 486 ml Reinstwasser in einem 1-Liter-Kolben auf. Sterilisieren Sie das Medium, indem Sie es in einem Flüssigkeitszyklus bei 121 °C, 15 psig, für mindestens 30 Minuten autoklavieren.
    2. Nach dem Autoklavieren das Medium auf 55 °C abkühlen lassen. Dann werden der Lösung 12,5 ml 1 M KPi, 500 μl 1 M MgSO4, 500 μl 1 M CaCl2 und 500 μl 5 mg/ml Cholesterin zugegeben.
    3. Steril werden 10 ml des in Schritt 1.2.2 hergestellten Mediums in jede 60-mm-Platte (insgesamt 50) gegossen. Lassen Sie die Platten mindestens 30 Minuten lang mit Medium erstarren. Pipettieren Sie 300 μl der über Nacht gewachsenen Bakterienkultur auf die Mitte der Platte und lassen Sie die Platte auf der Bank. Lassen Sie die Kultur 1-2 Tage trocknen und dicker werden. Lagern Sie diese NGM-Platten mit Bakterien bei 4 °C.
  3. Vorbereiten der lmNGM-Vormischung
    1. In einem 250-ml-Erlenmeyerkolben 2 g niedrigschmelzende Agarose, 0,25 g Pepton, 1 ml 3 M NaCl und 99 ml Reinstwasser vermischen. Autoklavieren Sie die Lösung bei 121 °C, 15 psig, für 30 Minuten.
    2. 10 ml lmNGM in Reagenzgläser aliquotieren und mit Parafilm abdecken, um Flüssigkeitsverlust zu vermeiden. Verschließen Sie die Röhrchen und lassen Sie sie abkühlen und erstarren.
  4. Bereiten Sie 85 mM NaCl für bakterielle Nahrung vor: In einer 100-ml-Flasche 515,61 mg NaCl vermischen und bis zu 100 ml mit Reinstwasser auffüllen. Autoklavieren bei 121 °C, 15 psig, für 30 min.
  5. Bereiten Sie wasserabsorbierende Polyacrylamidkristalle vor, indem Sie 1 g superabsorbierendes Polymer vom Typ S in 150 ml Reinstwasser in einer autoklavierbaren Quetschflasche auflösen. Schneiden Sie die Spitze ab, um eine ausreichende Dosiergröße zu gewährleisten. Bei 121 °C, 15 psig, 30 Minuten autoklavieren, mit Alufolie verschließen und schütteln, um die Kristalle zu vermischen.
  6. Bereiten Sie eine Reinigungslösung vor, indem Sie 3 ml 100 % Tween-20 mit 7 ml Reinstwasser in einer konischen Durchstechflasche mit 15 ml kombinieren.
  7. Bereiten Sie 5 mg/ml Cholesterin zu, indem Sie 2,5 g Cholesterin, 275 ml 100% EtOH und 25 ml Reinstwasser in einer 500-ml-Flasche kombinieren.
  8. Palmitinsäure-Arbeitslösung vorbereiten
    1. Mahlen Sie 500 mg feste Palmitinsäure in einem Mörser und Stößel und kombinieren Sie sie mit 15 ml Tween-20 in einer konischen 50-ml-Durchstechflasche. Mischen Sie durch Wirbeln und lösen Sie so viele Kristalle wie möglich auf.
    2. Fügen Sie 17,5 ml 100%iges Ethanol hinzu und wirbeln Sie die Lösung, um so viel Palmitinsäure wie möglich aufzulösen.
    3. Fügen Sie 17,5 ml Reinstwasser hinzu und wirbeln Sie rigoros. Erhitzen Sie die Lösung vorsichtig in einem Perlenbad bei 80 °C, bis sich die Palmitinsäure vollständig aufgelöst hat. Beim Abkühlen kann etwas Palmitinsäure ausfallen.
  9. Bereiten Sie Lysogenbrühe (LB) zu, indem Sie 20 g LB-Pulver in 1 l deionisiertem Wasser in einem 1-Liter-Becherglas oder größer mischen. 500 ml der Brühe in zwei 500-ml-Bechergläser aliquotieren. Die Brühe bei 121 °C, 15 psig, 30 Minuten lang autoklavieren. Bewahren Sie die vorbereitete Brühe bei RT auf.
  10. Zubereitung von Lysogenbrühe (LB) Agarplatten
    1. Mischen Sie 10 g LB-Pulver und 7,5 g Bacto-Agar in 500 μl deionisiertem Wasser in einem 1-Liter-Kolben. Autoklavieren Sie die Lösung in einem Flüssigkeitskreislauf bei 121 °C, 15 psig, für 30 Minuten.
    2. Falls gewünscht, fügen Sie optionale Antibiotika (500 μl oder 100 μg/ml Ampicillin) hinzu, nachdem das autoklavierte Medium auf 55 °C abgekühlt ist. Stellen Sie mit einer sterilen Technik LB-Agarplatten her, indem Sie 20 ml Medium in jede 100-mm-Platte gießen (insgesamt 25). Lagern Sie die Platten bei 4 °C.

2. Vorbereitung einer Population alterssynchronisierter Würmer

  1. Bereiten Sie eine Population alterssynchronisierter Würmer vor, die bereit sind, im Larvenstadium 4 (L4) in die Mikroschale gegeben zu werden. Alternativ können Würmer in jedem Lebensstadium hinzugefügt werden (FUdR sollte aus dem Mikroschalenmedium ausgeschlossen werden, wenn Würmer in einem Entwicklungsstadium vor L4 hinzugefügt werden, um einen Entwicklungsstopp zu verhindern).
    HINWEIS: Dieser Schritt sollte 2 Tage vor der Zugabe der Würmer in die Mikroschale abgeschlossen sein, wenn das angestrebte Lebensstadium zu Beginn des Experiments L4 ist. Der Synchronisationszeitpunkt kann so eingestellt werden, dass die Schnecken das gewünschte Lebensstadium erreichen können.
  2. Die Temperatur kann sich auf die Lebensdauer auswirken. Um konsistente Ergebnisse zu erzielen, verwenden Sie Standard-NGM-Platten (siehe Abschnitt 1), um C. elegans bei 20 °C zu halten, und übertragen Sie die Würmer auf frische Platten, wenn ihnen die bakterielle Nahrung ausgeht.
  3. Verwenden Sie aus den Vorratsplatten mit vielen jungen erwachsenen Würmern einen Standardansatz, um eine alterssynchronisierte Population zu generieren, wobei am häufigsten20 gebleicht oder21 Eier gelegt werden.
  4. Isolieren Sie die Eier und geben Sie sie auf eine mit Bakterien befleckte NGM-Platte. Bei Verwendung von Wildtyp-C. elegans schlüpfen die Eier und bilden Würmer, die in 2 Tagen das L4-Larvenstadium erreichen.

3. Bakterienkultur vorbereiten

  1. Impfen Sie am Tag vor Beginn des Experiments die gewünschte bakterielle Nahrungsquelle. Bereiten Sie ~5 ml Bakterienkultur pro Platte vor.
    Anmerkungen: Der Bakterienstreifen kann bis zu 1 Monat im Voraus vorbereitet und bei 4 °C für die Nahrungsquelle von E. coli gelagert werden.
    1. Streifen Sie Bakterien für einzelne Kolonien aus einem gefrorenen Glycerinstock auf die LB-Agarplatte.
    2. Wachsen Sie die Kultur über Nacht bei 37 °C.
    3. Beimpfen Sie flüssige LB-Bouillon mit einer einzigen Kolonie pro Inokulation.
    4. Bei ~250 U/min bei 37 °C 12-16 h schütteln.

4. Auftragen der Palmitinsäurebeschichtung auf die Mikroschale

HINWEIS: Palmitinsäure dient als aversive Barriere, um die Flucht von Tieren aus den einzelnen Brunnen zu verhindern. Die Beschichtung wird auf die gesamte Unterseite des Mikrotrays aufgebracht, mit Ausnahme der Innenflächen der Wells. Nystatin wird der Palmitinsäure zugesetzt, um die Pilzkontamination zu mildern. Dieser Schritt kann auf Wunsch 1 Tag vor Beginn des Experiments abgeschlossen werden.

  1. Stellen Sie das Perlenbad auf 80 °C ein, um Zeit zum Vorheizen zu haben.
  2. Aliquotieren Sie unmittelbar vor der Anwendung 1 ml der Palmitinsäure-Arbeitslösung pro Mikroschale in einen separaten sterilen Behälter (in der Regel eine konische Durchstechflasche mit 15 ml) und fügen Sie vor dem Erhitzen 4 μl 10.000 Einheiten/ml Nystatin pro 1 ml Palmitinsäurelösung hinzu.
  3. Besprühen Sie die Innen- und Außenseite der Mikroschale mit Ethanol (70 % oder mehr), um sie zu sättigen, und schütteln Sie das überschüssige Ethanol ab.
    Anmerkungen: Restethanol sollte während der Behandlung in UV-Vernetzung verdampfen (Schritt 4.4).
  4. Verwenden Sie einen UV-Vernetzer, um die Mikroschale zu sterilisieren (die folgenden Anweisungen gelten für den in dieser Studie verwendeten UV-Vernetzer):
    1. Legen Sie die Mikroschale und den Deckel separat in den UV-Vernetzer (d. h. legen Sie die Deckel nicht auf die Platten, da die UV-Strahlung nicht in den Kunststoff eindringt).
    2. Schließen Sie die Tür und schalten Sie den UV-Vernetzer ein.
    3. Drücken Sie Uhrzeit, geben Sie 20 Minuten ein, und drücken Sie dann Start.
    4. Drehen Sie nach 20 Minuten den Teller und den Deckel um und wiederholen Sie die Schritte 4.2.2-4.2.3.
    5. Legen Sie die Deckel mit Handschuhen auf die Mikroschale, um eine Kontamination nach der Sterilisation zu vermeiden.
  5. Mischen Sie die Palmitinsäure-Arbeitslösung gründlich durch Wirbeln und Invertieren.
  6. Stellen Sie die konische 15-ml-Durchstechflasche mit der Palmitinsäure-Arbeitslösung in das Perlenbad und lassen Sie alle sichtbaren Kristalle vor Gebrauch vollständig auflösen.
  7. Stellen Sie die Mikroschale mit aufgesetzten Deckeln für ~2 Minuten auf die Kante, die das Perlenbad umgibt, um sich aufzuwärmen.
  8. Entfernen Sie den Deckel der Mikroschale. Geben Sie langsam 200 μl Palmitinsäure-Arbeitslösung über die Rückwand (lange Seite) der Mikroschale. Setzen Sie die Deckel wieder auf und lassen Sie die Mikroschale 2-3 Minuten auf dem Perlenbad ruhen, damit sich die Palmitinsäurelösung auf dem Boden der Mikroschale absetzen kann.
    Anmerkungen: Während der gesamte Boden der Mikroschale erst in Schritt 4.10 vollständig beschichtet ist, sollte sich die Lösung gleichmäßig über mehr als die Hälfte der Bodenfläche verteilen. Wenn sich die Palmitinsäurelösung nicht gleichmäßig verteilt, schalten Sie einen Wirbel oder einen Vibrationsmotor in der Nähe der Mikroschale ein. Dadurch wird eine kleine Menge an Vibration erzeugt, die dazu beitragen kann, dass sich die Palmitinsäurelösung leichter ausbreiten kann. Lassen Sie die Deckel der Mikroschalen an Ort und Stelle, um eine Kontamination zu verringern.
  9. Wiederholen Sie Schritt 4.8.
    Anmerkungen: Etwa die Hälfte oder mehr des Bodens der Mikroschale sollte sichtbar mit der flüssigen Palmitinsäure bedeckt sein.
  10. Drehen Sie die Mikroschale um 180° und wiederholen Sie die Schritte 4.8 und 4.9 auf der anderen Seite der Schale.
    Anmerkungen: Der Boden der Terasaki-Schale wird erst dann mit einer dünnen Schicht Palmitinsäurelösung bedeckt, wenn das gesamte kombinierte Volumen auf beiden Seiten hinzugefügt wurde (Schritte 4.9 und 4.10). Je nach Zubereitung der Mischung, Temperatur und anderen Faktoren kann mehr oder weniger Palmitinsäuremischung erforderlich sein. Im Allgemeinen reichen zwischen 400 und 800 μl der Palmitinsäuremischung aus, um den gesamten Boden der Mikroschale zu beschichten. Sobald der Boden der Mikroschale sichtbar bedeckt ist, sollte keine zusätzliche Palmitinsäure hinzugefügt werden, da diese die Vertiefungen verunreinigen kann.
  11. Trocknen Sie das Tablett in einer sterilen Trockenbox oder Laminar-Flow-Haube mindestens 1 Stunde unbedeckt. Alternativ können Sie diesen Schritt am Tag vor dem Einlegen der Platten (Abschnitt 5) durchführen und die Mikroschale bei geschlossenem Deckel mindestens 16 Stunden lang bei RT trocknen.

5. Beladen des Mikrotrays mit niedrigschmelzenden Nematoden-Wachstumsmedien (lmNGM)

HINWEIS: Bei dieser Methode wird Standard-NGM gemischt mit niedrig schmelzender Agarose anstelle des üblichen Agars verwendet. Agar kann bei 45 °C zu gelieren beginnen. Bei der Arbeit mit den kleinen Volumina, die zum Befüllen der Microtray-Wells benötigt werden, verstopft das NGM auf Agarbasis häufig die Pipettenspitze und/oder erzeugt aufgrund der schnellen Gelierung unebene Well-Oberflächen. NGM mit niedrigschmelzender Agarose beginnt bei ~28 °C zu gelieren, so dass das geschmolzene Medium leicht pipettiert werden kann und konstant flache Well-Oberflächen bildet. Bereiten Sie lmNGM am selben Tag zu, an dem die Würmer auf die Mikroschale gelegt werden sollen. Wenn Sie die Mikroschale mit lmNGM vorbereiten, Bakterien aussäen und die C. elegans innerhalb desselben Tages beladen, stellen Sie sicher, dass die Tiere das gewünschte Alter erreicht oder sich dem gewünschten Alter nähern, bevor Sie mit diesen Schritten beginnen.

  1. Stellen Sie ein Pipettenbecken zum Aufwärmen in ein 80 °C heißes Perlenbad.
  2. Schmelzen Sie eine 10-ml-lmNGM-Vormischung pro herzustellender Mikroschale (Schritt 1.1) in der Mikrowelle für ~30-45 s.
    1. lmNGM-Vormischungs-Reagenzgläser in ein 200-ml-Becherglas geben, damit sie nicht umkippen.
    2. Nach ~10-15 s oder wenn die lmNGM-Vormischung gerade anfängt zu sprudeln, pausieren Sie die Mikrowelle, gießen Sie die lmNGM-Vormischung in ein steriles 200-ml-Becherglas und setzen Sie die Mikrowelle fort.
    3. Halten Sie nach Bedarf an, um ein Überkochen zu verhindern, und schwenken Sie zum Mischen.
    4. Stoppen Sie die Mikrowelle, sobald sich das gesamte lmNGM ohne Brocken in Flüssigkeit verwandelt hat.
      HINWEIS: Ein einziges 10-ml-Aliquot reicht aus, um insgesamt 192 Vertiefungen (zwei Mikroschalen) zu füllen.
  3. Bereiten Sie lmNGM vor, indem Sie die folgenden Komponenten in der angegebenen Reihenfolge zu der warmen, niedrigschmelzenden Agarose hinzufügen (die Volumina beziehen sich auf 10 ml niedrigschmelzende Agarose): 250 μl 25 mM KPi (pH 6), 10 μl 1 M CaCl2, 10 μl 1 MMgSO4 und 10 μl 5 mg/ml Cholesterin
    1. Wenn der Forscher plant, erwachsene Tiere im Laufe der Zeit zu untersuchen und eine Vermehrung verhindern muss, fügen Sie zusätzlich 10 μl 50 mM FUdR hinzu.
    2. Wenn Sie ein RNAi-Fütterungsexperiment mit dem gängigen HT115 RNAi E. coli-Stamm und den zugehörigen RNAi-Plasmiden durchführen, fügen Sie zusätzlich 5 μl 50 mg/ml Carbenicillin (zur Auswahl des RNAi-Plasmids) und 12 μl 1 mM IPTG (zur Induktion der Expression der doppelsträngigen RNA aus dem RNAi-Plasmid) hinzu.
      Anmerkungen: Abhängig von den selektiven Antibiotika und anderen Chemikalien, die für die gewünschte Nahrungsquelle benötigt werden, können zusätzliche Zusatzstoffe hinzugefügt werden. In diesem Stadium können auch Medikamente oder chemische Stressoren zu lmNGM hinzugefügt werden. NGM und lmNGM enthalten die gleiche Endkonzentration an NaCl, unterscheiden sich jedoch in der Art und Weise, wie das NaCl dem Medium zugeführt wird. Bei NGM wird das gesamte NaCl während der Medienvorbereitung hinzugefügt (Schritt 1.2). Für lmNGM wird ein Teil des NaCl während der Medienvorbereitung (Schritt 5.3) und ein Teil mit dem bakteriellen Futter (Abschnitt 6) zugegeben. Der Grund für diese Änderung liegt in dem geringen Medienvolumen in jeder Mikroschalenmulde. Die Zugabe von 5 μl konzentrierter Bakterien, die in LB suspendiert sind, zu einer Vertiefung, die 20 μl Medium enthält, verändert die Nährstoffzusammensetzung des Mediums erheblich (durch Zugabe der Komponenten von LB in einem vergleichbaren Volumen). Um dies zu vermeiden, wird das Bakterium stattdessen in einer NaCl-Lösung resuspendiert, um die LB-Komponenten zu entfernen und gleichzeitig osmotischen Stress für die Bakterien zu verhindern. Das dem Medium zugesetzte NaCl wird entsprechend reduziert, um dem den Bakterien zugesetzten Salz Rechnung zu tragen.
  4. Gießen Sie lmNGM in das erwärmte Pipettenbecken.
  5. Wenn sich das Mikrotablett auf einem Tischgerät befindet, pipettieren Sie 20 μl lmNGM in jedes Mikrotablett. Decken Sie die Mikroschale beim Nachfüllen der Pipette ab, um eine Kontamination zu minimieren.
    HINWEIS: Dieser Schritt ist mit einer elektronischen Repetierpipette einfacher.

6. Aussaat der Microtray-Vertiefungen mit bakteriellem Futter

HINWEIS: 5 μL 10x konzentriertes Futter aus einer über Nacht inokulierten Kultur reichen aus, um einen einzelnen C. elegans während seiner gesamten Lebensdauer zu ernähren.

  1. Übertragen Sie die Bakterien aus der Übernachtkultur in ein konisches 50-ml-Fläschchen.
  2. Bei ~3.500 x g für 20 min zentrifugieren.
  3. Entfernen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie die Bakterienkultur in einer 10-fachen Konzentration (1/10 des Volumens der ursprünglichen Kultur) mit 85 mM NaCl-Lösung.
  4. Bevor Sie Bakterien in die Vertiefungen geben, sollten Sie die Mikroschale visuell inspizieren, um sicherzustellen, dass das feste lmNGM vollständig in jeder Vertiefung enthalten ist. Wenn lmNGM an der Seite einer Vertiefung hängt, kratzen Sie das überschüssige lmNGM mit einer Pipettenspitze ab. Dieses überschüssige Medium kann dazu führen, dass die Lebensmittel in Palmitinsäure laufen, wenn sie nicht gereinigt werden.
  5. Pipettieren Sie vorsichtig 5 μl 10x konzentrierte Bakterienkultur auf die Oberfläche des lmNGM in jeder Vertiefung. Vermeiden Sie es, die Bakterienkultur über die Seite des Brunnens in die Palmitinsäure laufen zu lassen, da dies Würmer dazu bringt, den Brunnen zu verlassen.
  6. Lassen Sie die Mikroschalen in einer sterilen Trockenbox oder einer Laminar-Flow-Haube ~35 Minuten trocknen. Überprüfen Sie alle ~5 Minuten und achten Sie darauf, nicht zu stark zu trocknen. Entfernen Sie, wenn einige Vertiefungen sichtbar leicht nass sind, da die Vertiefungen weiter trocknen, während die Nematoden hinzugefügt werden.

7. Einschließen jeder Mikroschale in eine Single-Well-Platte

HINWEIS: In diesem Abschnitt wird die Mikroschale mit einem benutzerdefinierten 3D-gedruckten Einsatz in eine Standard-Single-Well-Platte montiert und von wasserabsorbierenden Kristallen umgeben. Anschließend wird die Single-Well-Platte mit Parafilm verschlossen und versiegelt. Dies ermöglicht den Sauerstoffaustausch bei gleichzeitiger Vermeidung von Kontamination und Aufrechterhaltung einer ausreichenden Luftfeuchtigkeit, um zu verhindern, dass das lmNGM im Laufe mehrwöchiger Experimente austrocknet (Experimente zur Lebensdauer von Würmern können 6-8 Wochen dauern, wenn lebensdauerverlängernde Mutationen oder Umweltbedingungen untersucht werden). Achten Sie bei der Zubereitung darauf, den Teller abzudecken, wenn nicht aktiv etwas hinzugefügt wird, um die Kontamination mit Bakterien oder Pilzen zu minimieren.

  1. Sterilisieren Sie eine Single-Well-Platte und einen 3D-gedruckten Adapter und Deckel, indem Sie sie jeweils in eine 10%ige Bleichlösung tauchen. Gründlich mit sterilem DI-Wasser abspülen. Mit einem Arbeitstuch trocken wischen.
  2. Besprühen Sie die Single-Well-Platte und den 3D-gedruckten Adapter sowie den Deckel mit einer Ethanollösung von 70 % oder mehr und wischen Sie sie mit einem Task-Tuch ab. Lassen Sie Ethanolreste an der Luft trocknen.
    HINWEIS: UV-Strahlung kann auch nach Bleichmittel und Ethanol mit den gleichen Parametern wie die Mikroschale verwendet werden, wie oben in Schritt 4.4 beschrieben.
  3. Legen Sie den sterilen 3D-gedruckten Einsatz in eine sterile Single-Well-Platte.
  4. Sterilisieren Sie die Außenseite der vorbereiteten Mikroschale, indem Sie sie mit 70 % Ethanol besprühen.
  5. Setzen Sie die Mikroschale in den 3D-gedruckten Adapter in der Single-Well-Platte ein.
  6. Entsorgen Sie den Deckel der Mikroschale.
  7. Verteilen Sie die Wasserkristalle großzügig auf den 3D-gedruckten Einsatz zwischen der Außenwand des Mikrotrays und der Innenwand der Single-Well-Platte.
  8. Fügen Sie sofort die Würmer hinzu (Abschnitt 8) oder verschließen Sie die Mikroschale, um sie am nächsten Tag zu verwenden. Schließen Sie den Deckel der Schale und verwenden Sie ein einziges Stück Parafilm, um alle vier Seiten zu umwickeln und die Mikroschale zu versiegeln. Wiederholen Sie den Versiegelungsschritt mit Parafilm noch zwei weitere Male für insgesamt drei Schichten.
  9. Nachdem Sie die Mikroschale versiegelt haben, lassen Sie sie bis zu 4 Tage auf dem Labortisch bei RT, bevor Sie die Würmer hinzufügen (Abschnitt 8).

8. Hinzufügen von Würmern in die Mikroschale

HINWEIS: Ein Wurm kann manuell zu jeder Vertiefung hinzugefügt werden, indem Tiere aus den alterssynchronisierten Wurmpopulationen (Abschnitt 2) mit einem Platin-Pickel übertragen werden. Übertragen Sie Tiere nur im gewünschten Lebensstadium. Dauert der Transfervorgang länger als 1 h, kann das lmNGM in den Microtray-Wells austrocknen. Das Übertragen von Gruppen von jeweils 10 bis 20 Würmern kann diesen Schritt beschleunigen, aber es erfordert etwas Übung, um konsequent nur ein einziges Tier pro Vertiefung freizulassen.

  1. Fügen Sie einen Fadenwurm pro Vertiefung hinzu, sobald sie das gewünschte Lebensstadium erreicht haben.
  2. Setzen Sie den Deckel wieder über die Mikroschale, wenn Sie Würmer von der Quellplatte entnehmen, um die Kontamination zu minimieren.

9. Fertigstellung der Vorbereitung der Kulturumgebung für den langfristigen Einsatz

HINWEIS: Die folgenden Schritte werden ausgeführt, um sicherzustellen, dass die Medien und Würmer in der Mikroschale während der Dauer des Experiments hydratisiert bleiben.

  1. Geben Sie ~40 μl der Waschmittellösung in den Deckel einer Single-Well-Platte und verwenden Sie ein Task-Wischtuch, um den Deckel gleichmäßig zu beschichten. Diese Beschichtung verhindert die Kondensation im Laufe der Zeit, sobald die Platte versiegelt ist. Verwenden Sie zusätzliche Arbeitstücher, um die Waschmittellösung zu verteilen, bis die Sicht durch den Deckel nicht mehr verzerrt ist (dies dauert normalerweise etwa zwei Arbeitstücher).
  2. Untersuchen Sie die Wasserkristalle, um sicherzustellen, dass sie beide auf gleicher Höhe mit dem oberen Rand der Mikroschale sind und nicht überlaufen. Geben Sie bei Bedarf Wasserkristalle auf den Teller oder entfernen Sie sie.
  3. Wickeln Sie die Schale wie folgt mit Parafilm (insgesamt drei Stück) ein, um sicherzustellen, dass die Parafilm-Versiegelung lange hält.
    1. Dehnen Sie das erste Stück Parafilm leicht, um zwei Seiten des Tabletts zu bedecken.
    2. Dehnen Sie das zweite Stück Parafilm leicht und decken Sie die restlichen Seiten des Tabletts ab.
    3. Dehnen Sie das letzte Stück Parafilm und wickeln Sie alle vier Seiten des Tabletts vollständig ein, wobei Sie das erste und zweite Stück Parafilm abdecken. Eine ordnungsgemäß versiegelte Mikroschale kann ~2 Monate lang hydratisiert bleiben.
      HINWEIS: Überwachen Sie die Integrität des Parafilms während des gesamten Experiments alle 1-2 Wochen und ersetzen Sie ihn bei Bedarf.
    4. Wischen Sie die Oberseite des Fachs mit einem mit 70 % Ethanol angefeuchteten Arbeitstuch ab, um Fingerabdrücke zu entfernen.
  4. Beschriften Sie die Single-Well-Platte mit Klebeband. Das Microtray ist nun bereit für die Bildgebung und Langzeitlagerung, um Würmer im Laufe der Zeit zu überwachen. Halten Sie das Fach zwischen den Bildgebungssitzungen bei 20 °C. Die Mikroschale kann für die Medikamentendosierung oder andere Verfahren mehrmals geöffnet und wieder verschlossen werden, sollte jedoch minimiert werden, um Kontamination und Feuchtigkeitsverlust zu vermeiden.

10. Abbildung einzelner Würmer in Microtray-Wells

HINWEIS: Der Zweck dieses Protokolls besteht darin, eine detaillierte Beschreibung der Vorbereitung der Microtray-Kulturumgebung bereitzustellen. Einmal präpariert und mit Würmern besiedelt, können die Mikroschalen-Einzelwurmkulturumgebungen verwendet werden, um viele Phänotypen im Längsschnitt zu überwachen, wobei Techniken verwendet werden, die für die Standardkultur auf Petriplatten etabliert sind. Der folgende Abschnitt enthält grundlegende Anweisungen zum Messen einiger gängiger Phänotypen. Die Fluoreszenzbildgebung muss in einem aufrechten Mikroskop durchgeführt werden. Die Lichtbrechung durch das Terasaki-Tablett wird in einem dunklen Raum minimiert.

  1. Lebensdauer: Messen Sie die Lebensdauer, indem Sie vorsichtig auf die Seite oder Oberseite der Platte klopfen oder ein helles blaues Licht auf die Platte leuchten lassen und jedes Tier beobachten. Erziele ein Tier als "tot", wenn es sich nicht innerhalb weniger Sekunden bewegt. Wiederholen Sie diese Aufgabe alle 1-3 Tage, bis alle Würmer abgestorben sind.
    HINWEIS: Die Microtray-Kulturumgebung ist mit Systemen kompatibel, die die Bilderfassung und -analyse für die Lebensdauerschätzungautomatisieren 14,19.
  2. Standardmikroskopie: Führen Sie Hellfeld- (oder Dunkelfeld-) Bildgebung an einzelnen Wells oder am gesamten Tray mit einer hochauflösenden Kamera oder einem Scanner durch. Diese Bildgebungsdaten können für eine Vielzahl von Phänotypen verwendet werden, einschließlich Tiergröße 22,23,24, Entwicklung 25, Aktivität 14,19 und Lebensdauer.
  3. Fluoreszenzmikroskopie: Führen Sie die Fluoreszenzbildgebung an einzelnen Wells entweder manuell oder mit einem motorisierten Plattformsystem durch. Die Single-Well-Trays sind mit Standard-Multi-Well-Plattenadaptern kompatibel. Das Signal-Rausch-Verhältnis wird minimiert, wenn das Gerät in einem Kasten mit schwarzen Wänden platziert wird.
    HINWEIS: Da die Würmer abgebildet werden, während sie frei kriechen können, eignet sich dieses Kultursystem gut für die Bildgebung mit niedriger Auflösung, um die Ganzkörperfluoreszenz und die Lokalisierung von Fluorophoren im rauen Gewebe zu erfassen. Bei der hochauflösenden Bildgebung mit hoher Vergrößerung müssen die Tiere in der Regel bewegungsunfähig gemacht werden, um Bewegungen zu verhindern. Es sollte zwar möglich sein, ein lähmendes Mittel (z. B. Natriumazid oder Levamisol) topisch auf jede Vertiefung aufzutragen und mit einer höher aufgelösten Bildgebung fortzufahren, dies würde wiederholte Messungen desselben Wurms zu späteren Zeitpunkten ausschließen. Das Kultursystem, wie beschrieben, ist auch nicht invertiert zu sein, was die Verwendung von inversen Mikroskopsystemen verhindert.
    1. Wenn das Hellfeld nicht zur Messung der Lebensdauer verwendet wird und nur die Fluoreszenz erfasst wird, messen Sie die Lebensdauer manuell. Wenn Sie das blaue Licht (das für die GFP-Anregung verwendet wird) 5 s lang auf dem Wurm belassen, wird das Tier aufgefordert, sich zu bewegen. Wenn sich das Tier nicht innerhalb von 5 Sekunden bewegt hat, betrachten Sie das Tier als tot.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Ergebnisse

Die hier beschriebene Mikroschalen-basierte Einzelwurmkulturumgebung kann verwendet werden, um eine Vielzahl von Phänotypen zu überwachen, einschließlich Lebens- und Gesundheitsspanne, Aktivität und Bewegung, Körperform und Krabbelgeometrie sowie die Expression transgen exprimierter fluoreszierender Biomarker in einzelnen Tieren über die Zeit. Das Mikroschalen-Kultursystem ist mit der Lebensdaueranalyse kompatibel, entweder durch manuelles Scoring oder durch Bilderfassung und nachgeschaltete Bildgebungsanalyse. Wie...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Diskussion

In dieser Arbeit beschreiben wir ein neuartiges Kultursystem, das Mikroschalen, die ursprünglich für humane Leukozytenantigen-Gewebetypisierungsassays entwickelt wurden, so anpasst, dass sie die Isolierung und Charakterisierung einzelner C. elegans im Laufe der Zeit in einer festen Medienumgebung ermöglichen, die kontextuell dem Agar-basierten NGM ähnelt, das der Standard in der C. elegans-Forschung ist. Dieses System ist mit einer Vielzahl von Interventionen kompatibel, darunter diätetische Restr...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Offenlegungen

Die Autoren geben an, dass sie keine Interessenkonflikte offenzulegen haben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt durch NIH R35GM133588 für G.L.S., ein NIHT32GM008659-Ausbildungsstipendium für L.E., einen United States National Academy of Medicine Catalyst Award für G.L.S. und den State of Arizona Technology and Research Initiative Fund, der vom Arizona Board of Regents verwaltet wird.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
3D-printed terasaki insertsCustom printing companyRobot_Terasaki_tray_insert_10-20
-2021.STL		FDM printing, nozzle size 0.6 mm using standard PLA plus filament
AirClean systems AC624LF vertical laminar flow fume hoodFisher Scientific36-100-4376
Bacto peptoneThermo Scientific211677
CaCl2Acros organics349615000
Caenorhabditis elegans N2Caenorhabditis Genetics Center (CGC)N2Wildtype strain
CarbenicillinGoldbioC-103-25
CholesterolICN Biomedicals Inc101380
Escherichia coli OP50 Caenorhabditis Genetics Center (CGC)OP50Standard labratory food for C. elegans
EthanolMilliporeex0276-4
Fisher Vortex Genie 2Fisher ScientificG-560
FUdR Research Products InternationalF10705-1.0
Hydrating water crystals M2 Polymer TechnologiesType SType S super absorbent polymer
Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)GoldBioI2481C100
K2HPO4Fisher ChemicalP288-500
KimwipesKimTech34155Task wipes
LB Broth, LennoxBD Difco240230
Leica K5 sCMOS monochrome cameraLeica Microsystems11547112
Leica M205 FCA Fluorescent Stereo MicroscopeLeica Microsystems10450826
Low-melt agaroseResearch Products InternationalA20070-250.0
MgSO4 Fisher ChemicalM-8900
NaClFisher bioreagentsBP358-1
Nunc OmniTray Single-Well PlateThermo Scientific264728
NystatinSigmaN1538
Palmitic acidAcros organics129700010
Paper towelsCoastwide Professional365374
Parafilm MParafilm16-101
Stratagene UV Stratalinker 2400Stratagene400075UV crosslinker
Terasaki trays (Lambda)One Lambda151431
Thermolyne Dri-bathThermolyneDB28125
Tween Thermo ScientificJ20605-AP

Referenzen

  1. Shaham, S. Methods in Cell Biology. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK19784/ (2006).
  2. Boulin, T., et al. Eight genes are required for functional reconstitution of the Caenorhabditis elegans levamisole-sensitive acetylcholine receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (47), 18590-18595 (2008).
  3. Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans. Cell Stress & Chaperones. 8 (1), 1-7 (2003).
  4. Xian, B., et al. WormFarm: a quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).
  5. Rahman, M., et al. NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10 (1), 16190(2020).
  6. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
  7. Clark, A. S., Huayta, J., Arulalan, K. S., San-Miguel, A. Microfluidic Devices for Imaging and Manipulation of C. elegans. Micro and Nano Systems for Biophysical Studies of Cells and Small Organisms. , Academic Press. Chapter 13 295-321 (2021).
  8. Levine, E., Lee, K. S. Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research. Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).
  9. Atakan, H. B., et al. Automated platform for long-term culture and high-content phenotyping of single C. elegans worms. Scientific Reports. 9 (1), 14340(2019).
  10. Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. Journal of Visualized Experiments. (49), e2496(2011).
  11. Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains. Journal of Visualized Experiments. (51), e2745(2011).
  12. Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise. BMC Biology. 15 (1), 30(2017).
  13. Çelen, İ, Doh, J. H., Sabanayagam, C. R. Effects of liquid cultivation on gene expression and phenotype of C. elegans. BMC Genomics. 19 (1), 562(2018).
  14. Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652(2017).
  15. Turner, E., et al. Long-term culture and monitoring of isolated nematodes on solid media in WorMotels. Journal of Visualized Experiments. , (2022).
  16. Pittman, W. E., et al. A simple apparatus for individual C. elegans culture. Methods in Molecular Biology. 2144, 29-45 (2020).
  17. Breimann, L., Preusser, F., Preibisch, S. Light-microscopy methods in C. elegans research. Current Opinion in Systems Biology. 13, 82-92 (2019).
  18. Mittal, K. K., Mickey, M. R., Singal, D. P., Terasaki, P. I. Serotyping for homotransplantation. 18. Refinement of microdroplet lymphocyte cytotoxicity test. Transplantation. 6 (8), 913-927 (1968).
  19. Freitas, S. Worm paparazzi-a high throughput lifespan and healthspan analysis platform for individual Caenorhabditis elegans. , Available from: https://repository.arizona.edu/handle/10150/661628 (2021).
  20. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019(2012).
  21. Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152(2009).
  22. Moore, B. T., Jordan, J. M., Baugh, L. R. WormSizer: high-throughput analysis of nematode size and shape. PloS One. 8 (2), 57142(2013).
  23. Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. , 1-17 (2013).
  24. Roussel, N., Sprenger, J., Tappan, S. J., Glaser, J. R. Robust tracking and quantification of C. elegans body shape and locomotion through coiling, entanglement, and omega bends. Worm. 3 (4), Taylor & Francis. 982437(2014).
  25. Raizen, D. M., et al. Lethargus is a Caenorhabditis elegans sleep-like state. Nature. 451 (7178), 569-572 (2008).
  26. Peters, M. J., et al. The transcriptional landscape of age in human peripheral blood. Nature Communications. 6 (1), 8570(2015).
  27. Sutphin, G. L., et al. Caenorhabditis elegans orthologs of human genes differentially expressed with age are enriched for determinants of longevity. Aging Cell. 16 (4), 672-682 (2017).
  28. Felker, D. P., Robbins, C. E., McCormick, M. A. Automation of C. elegans lifespan measurement. Translational Medicine of Aging. 4, 1-10 (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Weitere Artikel entdecken

WiderrufHeft 190

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Kontakt

BIBLIOTHEKS-EMPFEHLUNG

JoVE-Newsletter

Forschung

Lehre

Autoren

Bibliothekare

ÜBER JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten