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Résumé

Ici, nous présentons un protocole de culture de nématodes individuels isolés sur des milieux solides pour le suivi des paramètres physiologiques tout au long de la vie et la quantification de la fluorescence. Ce système de culture comprend une barrière d’acide palmitique autour des puits à ver unique pour empêcher les animaux de fuir, ce qui permet l’utilisation d’interventions aversives, y compris des bactéries pathogènes et des facteurs de stress chimiques.

Résumé

Caenorhabditis elegans est largement utilisé pour étudier la biologie du vieillissement. La pratique courante dans les études sur le vieillissement de C. elegans consiste à cultiver des groupes de vers sur des milieux de croissance de nématodes solides (NGM), ce qui permet la collecte efficace de données au niveau de la population pour la survie et d’autres phénotypes physiologiques, et l’échantillonnage périodique des sous-populations pour la quantification des biomarqueurs fluorescents. Les limites de cette approche sont l’incapacité (1) de suivre les vers individuels au fil du temps pour développer des trajectoires d’âge pour les phénotypes d’intérêt et (2) de surveiller les biomarqueurs fluorescents directement dans le contexte de l’environnement de culture. Les approches de culture alternatives utilisent la culture liquide ou la microfluidique pour surveiller les animaux individuels au fil du temps, dans certains cas, y compris la quantification de la fluorescence, avec le compromis que l’environnement de culture est contextuellement distinct du NGM solide. Le WorMotel est un dispositif multipuits microfabriqué décrit précédemment pour la culture de vers isolés sur NGM solide. Chaque ver est maintenu dans un puits contenant des NGM solides entouré d’un fossé rempli de sulfate de cuivre, un répulsif de contact pour C. elegans, permettant une surveillance longitudinale des animaux individuels. Nous trouvons que le sulfate de cuivre est insuffisant pour empêcher les vers de fuir lorsqu’ils sont soumis à des interventions aversives courantes dans la recherche sur le vieillissement, y compris la restriction alimentaire, les bactéries pathogènes et les agents chimiques qui induisent un stress cellulaire. Les dispositifs multipuits sont également moulés à partir de polydiméthylsiloxane, qui produit des artefacts de fond élevés en imagerie par fluorescence. Ce protocole décrit une nouvelle approche pour la culture de vers ronds isolés sur NGM solide à l’aide de microplateaux en polystyrène disponibles dans le commerce, conçus à l’origine pour le typage de l’antigène leucocytaire humain (HLA), permettant de mesurer la survie, les phénotypes physiologiques et la fluorescence tout au long de la vie. Une barrière d’acide palmitique empêche les vers de fuir, même en présence de conditions aversives. Chaque plaque peut cultiver jusqu’à 96 animaux et s’adapte facilement à une variété de conditions, y compris les restrictions alimentaires, l’ARNi et les additifs chimiques, et est compatible avec les systèmes automatisés de collecte de données sur la durée de vie et l’activité.

Introduction

C. elegans est un puissant organisme modèle pour la recherche en génétique, en biologie cellulaire et en biologie moléculaire, car ils sont facilement cultivés en laboratoire, ont une durée de vie et une durée de vie courtes, partagent un degré élevé d’homologie protéique avec les mammifères et ont une structure corporelle transparente qui permet la visualisation in vivo des protéines fluorescentes et des colorants1. En raison de l’utilisation de longue date de C. elegans comme système modèle majeur dans divers domaines, y compris la biologie du développement et le vieillissement, leur croissance et leur développement sont bien compris, leur génome a été entièrement séquencé et une foule d’outils génétiques puissants ont été créés, y compris des bibliothèques d’alimentation en ARNi à l’échelle du génome et des milliers de souches mutantes et transgéniques. Historiquement, C. elegans est cultivé en tant que population sur des milieux de croissance de nématodes gélose solides (NGM), et les phénotypes sont évalués manuellement soit par observation directe, soit par imagerie et analyse en aval. La microscopie fluorescente est utilisée pour capturer une variété de phénotypes moléculaires à l’aide de colorants ou de marqueurs fluorescents exprimés de manière transgénique chez des individus de C. elegans. L’imagerie fluorescente consiste généralement à fixer ou à paralyser un animal sur des lames contenant de minces pastilles d’agarose, ce qui est envahissant et souvent mortel. Elle implique également l’utilisation de produits chimiques, tels que le lévamisole ou l’azoture de sodium, qui peuvent potentiellement interférer avec le processus moléculaire d’intérêt 2,3. Ensemble, ces approches permettent de recueillir des données transversales à l’échelle de la population sur un large éventail de phénotypes, mais ne permettent pas le suivi des animaux individuels au fil du temps.

Au cours des dernières années, plusieurs approches ont émergé pour cultiver C. elegans isolé, permettant aux chercheurs de capturer les changements dynamiques dans les phénotypes physiologiques et moléculaires des animaux au fil du temps en utilisant de nouvelles technologies d’imagerie. Une catégorie d’approche de culture de C. elegans est constituée de dispositifs microfluidiques, notamment WormFarm4, la puce Nemalife5 et la puce « comportementale » de Chronis et al.6, entre autres 7,8,9. À cela s’ajoutent les méthodes de culture à base de liquide, qui utilisent des plaques multipuits pour caractériser des vers individuels ou de petites populations au fil du temps10,11. La microfluidique et les systèmes de microplaques fournissent d’excellentes mesures quantitatives des réponses phénotypiques chez C. elegans jusqu’à un seul animal, mais l’environnement de culture présente une limite clé. La grande majorité des recherches antérieures sur C. elegans, en particulier dans le domaine du vieillissement, ont été réalisées sur des milieux solides à base d’agar-agar. La culture liquide fait nager C. elegans en continu et représente un contexte environnemental distinct qui peut modifier la biologie sous-jacente. Par exemple, les animaux cultivés dans des milieux liquides ont considérablement modifié la teneur en matières grasses et l’expression des gènes – en particulier pour les gènes impliqués dans la réponse au stress – par rapport aux animaux cultivés sur NGM solide à base d’agar12,13. Une autre catégorie de méthodes d’imagerie sur un seul animal implique des dispositifs de polydiméthylsiloxane (PDMS) qui isolent des animaux individuels sur des milieux solides, dans le but d’imiter plus étroitement l’environnement standard rencontré par les vers cultivés sur NGM solide en culture de groupe sur plaques de Petri. Le WorMotel est un appareil PDMS de 240 puits conçu pour cultiver des animaux individuels sur des supports solides. Chaque puits est rempli d’un NGM modifié utilisant de l’agarose à faible fusion au lieu de gélose et ensemencé avec des aliments bactériens, créant un environnement de milieux solides similaire au système de culture le plus courant utilisant des plaques de Petri. Les parois du puits sont rondes, ce qui permet d’imager chaque animal quel que soit son emplacement dans le puits (en évitant l’obscurcissement visuel causé par un animal près d’un mur dans une plaque multipuits). Le sulfate de cuivre dans un fossé étroit entourant chaque puits est utilisé comme moyen de dissuasion pour garder les animaux dans leurs puits14,15. Une limite de cette approche est que le sulfate de cuivre est inefficace pour empêcher les vers de fuir lorsque des conditions environnementales aversives sont présentes, y compris des restrictions alimentaires, des bactéries pathogènes ou des produits chimiques qui induisent un stress cellulaire (par exemple, le paraquat).

Un deuxième système qui utilise des milieux solides est le Worm Corral, qui utilise un hydrogel pour créer un petit environnement étanche pour chaque ver sur une lame, permettant une surveillance à long terme des animaux isolés individuellement16. Une limitation clé est que les animaux doivent être scellés dans l’environnement sous forme d’œufs, ce qui nécessite l’utilisation d’animaux stériles pour empêcher la reproduction et limite les traitements médicamenteux à une seule application. Les essais de médicaments multidoses peuvent être réalisés dans le WorMotel soit en effectuant plusieurs cycles d’exposition avant de transférer les vers dans l’appareil, soit en ajoutant localement des médicaments supplémentaires aux puits pendant l’expérience; Cependant, dans ce dernier cas, la dose réelle d’exposition après l’ajout d’un médicament supplémentaire à un puits existant est difficile à quantifier avec précision et dépend de la rapidité avec laquelle le médicament se dégrade. Le WorMotel et le Worm Corral sont excellents pour l’imagerie en fond clair ou en fond noir afin de capturer des informations liées à l’activité et à la physiologie animale (par exemple, la croissance et le développement). Bien que ces systèmes puissent être utilisés pour surveiller la fluorescence, selon notre expérience, le PDMS utilisé pour créer les autres technologies d’imagerie à ver unique est susceptible de former des microbulles, de capturer des particules et d’autres petites anomalies qui génèrent des artefacts fluorescents irréguliers qui interfèrent avec la visualisation et la quantification cohérentes de la fluorescence, en particulier dans la plage d’émission de GFP, le fluorophore le plus couramment utilisé dans la recherche sur C. elegans. À ce jour, l’imagerie par fluorescence vivante de C. elegans d’animaux individuels de manière longitudinale repose principalement sur des dispositifs microfluidiques17.

Ici, nous décrivons une nouvelle méthode de culture de C. elegans individuels sur des milieux solides qui est compatible à la fois avec les interventions aversives et l’imagerie fluorescente directe. Cette approche est similaire dans son concept à d’autres technologies d’imagerie à ver unique, sauf que la puce PDMS moulée sur mesure est remplacée par des microplateaux en polystyrène disponibles dans le commerce développés à l’origine pour les tests de microcytotoxicité (aussi communément appelés plateaux Terasaki)18. Ces microplateaux comportent des puits qui peuvent être remplis de milieux solides et ensemencés avec des aliments bactériens, imitant étroitement l’environnement vécu par les animaux selon la méthodologie standard de culture de NGM solide. Chaque puits est entouré d’une barrière aversive d’acide palmitique plutôt que de sulfate de cuivre. L’acide palmitique est couramment utilisé pour empêcher les vers de fuir les milieux solides, en utilisant une culture de groupe standard sur des plaques de Petri dans des expériences où les vers sont confrontés à un environnement aversif comme une restriction alimentaire ou une exposition à un facteur de stress chimique. Les microplateaux produisent également un fond fluorescent minimal et cohérent, permettant l’imagerie fluorescente des animaux directement dans leur environnement de culture. Ce nouveau système de culture à base de gélose solide à animal unique permet non seulement de suivre les animaux individuels tout au long de la vie et de surveiller la croissance, le développement, l’activité et la durée de vie, mais il est également compatible avec la microscopie fluorescente directe. Parce que les vers peuvent être imagés sans paralysie ni fixation, les biomarqueurs de fluorescence in vivo peuvent être quantifiés longitudinalement chez les animaux individuels restant sur leur milieu de culture, permettant l’observation des changements dynamiques au cours de la vie de chaque animal. Ce système de culture est également compatible avec les systèmes automatisés de la génération actuelle pour le suivi de la durée de vie et d’autres paramètres de santé14,19. Nous fournissons un protocole détaillé pour la culture individuelle de C. elegans dans ce système à base de microplateau, discutons des pièges potentiels et du dépannage, et discutons des avantages et des limites par rapport aux autres systèmes, et en particulier, un protocole WorMotel mis à jour et optimisé15.

Chaque environnement de culture à vis sans fin unique se compose d’un microplateau monté à l’intérieur d’un plateau standard à puits unique à l’aide d’un adaptateur personnalisé imprimé en 3D (Figure 1A). Les puits sont remplis de milieux de croissance de nématodes agarose à faible point de fusion (lmNGM), ensemencés de bactéries concentrées comme source de nourriture et entourés d’un revêtement d’acide palmitique pour empêcher les vers de fuir (figure 1B). L’espace entre le microplateau et les parois de la plaque à puits unique est rempli de cristaux d’eau saturés pour maintenir l’humidité (Figure 1B). Un revêtement détergent est appliqué sur le couvercle du plateau pour éviter la condensation. Un seul ver est ajouté à chaque puits, et le plateau à puits unique est scellé avec du parafilm pour maintenir l’humidité et permettre l’échange d’oxygène. Jusqu’à six microplateaux peuvent raisonnablement être préparés en parallèle par un seul chercheur expérimenté.

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Protocole

1. Recettes

REMARQUE: Préparez les solutions mères avant de commencer la préparation de la plaque de microplateau.

  1. Solutions mères pour milieux de croissance de nématodes agarose à faible point de fusion (lmNGM)
    1. Préparer 1 M K2HPO4 en dissolvant 174,18 g deK2HPO4dans 1 L d’eau désionisée stérile dans un flacon de 1 L. Autoclaver la solution à 121 °C, 15 psi, pendant 30 min et la conserver à température ambiante (RT).
    2. Préparer 1 M KPi (pH 6,0) en dissolvant 136,09 g de KH2HPO4 dans 1 L d’eau désionisée stérile dans un flacon de 1 L. Titrer la solution avec 1 M K2HPO4 pour obtenir un pH de 6,0. Autoclaver la solution à 121 °C, 15 psig, pendant 30 min et la conserver à TA.
    3. Préparer 1 M de CaCl2en dissolvant 73,5 g de CaCl2 dans 500 mL d’eau désionisée stériledans un flacon de 500 mL. Autoclaver la solution à 121 °C, 15 psig, pendant 30 min et la conserver à RT
    4. Préparer 1 M de MgSO4 en dissolvant 123,25 g deMgSO4 dans 500 mL d’eau désionisée stérile dans un flacon de 500 mL. Autoclaver la solution à 121 °C, 15 psig, pendant 30 min et la conserver à TA.
    5. Préparer 3 M de NaCl pour le lmNGM : Dans un flacon propre de 100 mL, mélanger 100 mL d’eau ultrapure et 18,20 g de NaCl. Autoclave à 121 °C, 15 psig, pendant 30 min.
    6. Préparer 5 mg/mL de cholestérol en combinant 2,5 g de cholestérol, 275 mL d’éthanol à 100 % et 25 mL d’eau désionisée stérile dans une bouteille ambrée de 500 mL. Autoclaver la solution à 121 °C, 15 psig, pendant 30 min et la conserver à TA.
    7. Préparer 50 mM de fluorodésoxyuridine (FUdR) en dissolvant 0,1231 g de FUdR dans 10 mL d’eau désionisée stérile dans un tube conique de 15 mL. Utilisez une seringue de 10 mL et un filtre de 0,22 μm pour stériliser la solution. Aliquote 1 mL de la solution chacun dans 10 tubes microcentrifugés et les stocker à -20 °C.
    8. Préparer 50 mg/mL de carbénicilline en dissolvant 500 mg de carbénicilline dans 10 mL d’eau désionisée stérile dans un tube conique de 15 mL. Utilisez une seringue de 10 mL et un filtre de 0,22 μm pour stériliser la solution. Aliquote 1 mL de la solution chacun dans 10 tubes microcentrifugés et les stocker à -20 °C.
    9. Préparer 1 mM d’isopropyle ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) en dissolvant 2,38 g d’IPTG dans 10 mL d’eau désionisée stérile dans un tube conique de 15 mL. Utilisez une seringue de 10 mL et un filtre de 0,22 μm pour stériliser la solution. Aliquote 1 mL de la solution chacun dans 10 tubes microcentrifugés et les stocker à -20 °C.
    10. Préparer 100 mg/mL d’ampicilline en dissolvant 1 g d’ampicilline dans 10 mL d’eau désionisée stérile dans un tube conique de 15 mL. Utilisez une seringue de 10 mL et un filtre de 0,22 μm pour stériliser la solution. Aliquote 1 mL de la solution d’ampicilline à 100 mg/mL dans chacun des tubes de 10 microcentrifugeuses et stocker les tubes à -20 °C.
  2. Préparation des milieux de croissance des nématodes (NGM) pour l’entretien général de C. elegans
    1. Pour faire 50 plaques, dissoudre 10 g de gélose au Botto, 1,5 g de NaCl et 1,25 g de peptone de Bacto dans 486 mL d’eau ultrapure dans une fiole de 1 L. Stériliser le milieu en l’autoclavant sur un cycle liquide à 121 °C, 15 psig, pendant au moins 30 min.
    2. Après l’autoclave, laisser refroidir le milieu à 55 °C. Ensuite, ajouter 12,5 mL de 1 M KPi, 500 μL de 1 M MgSO4, 500 μL de 1 M CaCl2 et 500 μL de 5 mg/mL de cholestérol à la solution.
    3. À l’aide d’une technique stérile, verser 10 mL du milieu préparé à l’étape 1.2.2 dans chaque plaque de 60 mm (50 au total). Laisser les plaques avec le média pendant au moins 30 minutes pour solidifier. Pipeter 300 μL de culture bactérienne cultivée pendant la nuit au centre de la plaque et laisser la plaque sur le banc. Laissez la culture sécher et s’épaissir pendant 1-2 jours. Conservez ces plaques NGM avec des bactéries à 4 °C.
  3. Préparation du prémélange lmNGM
    1. Dans une fiole d’erlenmeyer de 250 mL, mélanger 2 g d’agarose à bas point de fusion, 0,25 g de peptone, 1 mL de NaCl 3 M et 99 mL d’eau ultrapure. Autoclaver la solution à 121 °C, 15 psig, pendant 30 min.
    2. Aliquote 10 mL de NGM dans des tubes à essai et couvrir de Parafilm pour éviter toute perte de liquide. Boucher les tubes et les laisser refroidir et se solidifier.
  4. Préparer 85 mM de NaCl pour les aliments bactériens : Dans une bouteille de 100 mL, mélanger 515,61 mg de NaCl et remplir jusqu’à 100 mL d’eau ultrapure. Autoclave à 121 °C, 15 psig, pendant 30 min.
  5. Préparer des cristaux de polyacrylamide absorbant l’eau en dissolvant 1 g de polymère super absorbant de type S dans 150 mL d’eau ultrapure dans un flacon autoclavable. Coupez l’embout pour assurer une taille de distribution adéquate. Autoclave à 121 °C, 15 psig, pendant 30 min, coiffer de papier d’aluminium et agiter pour mélanger les cristaux.
  6. Préparer une solution détergente en combinant 3 mL de Tween-20 à 100 % avec 7 mL d’eau ultrapure dans un flacon conique de 15 mL.
  7. Préparez 5 mg/mL de cholestérol en combinant 2,5 g de cholestérol, 275 mL d’EtOH à 100 % et 25 mL d’eau ultrapure dans une bouteille de 500 mL.
  8. Préparer la solution de travail à l’acide palmitique
    1. Broyer 500 mg d’acide palmitique solide dans un mortier et un pilon et le combiner avec 15 mL de Tween-20 dans un flacon conique de 50 mL. Mélanger en tourbillonnant, en dissolvant autant de cristaux que possible.
    2. Ajouter 17,5 mL d’éthanol à 100 % et vortex la solution pour dissoudre autant d’acide palmitique que possible.
    3. Ajouter rigoureusement 17,5 mL d’eau ultrapure et de vortex. Chauffer doucement la solution dans un bain de billes à 80 °C jusqu’à ce que l’acide palmitique se dissolve complètement. Un peu d’acide palmitique peut précipiter pendant le refroidissement.
  9. Préparer le bouillon lysogénique (LB) en mélangeant 20 g de poudre LB dans 1 L d’eau désionisée dans un bécher de 1 L ou plus. Aliquote 500 mL du bouillon dans deux béchers de 500 mL. Autoclaver le bouillon à 121 °C, 15 psig, pendant 30 min. Conservez le bouillon préparé chez RT.
  10. Préparation de plaques de gélose au bouillon lysogénique (LB)
    1. Mélanger 10 g de poudre LB et 7,5 g de gélose Bacto dans 500 μL d’eau désionisée dans une fiole de 1 L. Autoclaver la solution sur un cycle liquide à 121 °C, 15 psig, pendant 30 min.
    2. Si vous le souhaitez, ajoutez des antibiotiques facultatifs (500 μL d’ampicilline à 100 μg/mL) après refroidir le milieu autoclavé à 55 °C. À l’aide d’une technique stérile, fabriquer des plaques de gélose LB en versant 20 ml de média dans chaque plaque de 100 mm (25 au total). Conserver les plaques à 4 °C.

2. Préparation d’une population de vers synchronisés selon l’âge

  1. Préparez une population de vers synchronisés selon l’âge qui sont prêts à être ajoutés au microplateau au stade larvaire 4 (L4). Alternativement, des vers à n’importe quel stade de la vie peuvent être ajoutés (FUdR doit être exclu du milieu du microplateau si des vers sont ajoutés à un stade de développement plus tôt que L4 pour prévenir l’arrêt du développement).
    REMARQUE: Cette étape doit être complétée 2 jours avant d’ajouter les vers au microbac si le stade de vie cible au début de l’expérience est L4. Le calendrier de synchronisation peut être ajusté pour permettre aux vers d’atteindre le stade de vie souhaité.
  2. La température peut avoir un impact sur la durée de vie. Pour des résultats cohérents, utiliser des plaques NGM standard (voir rubrique 1) pour maintenir C. elegans à 20 °C, et transférer les vers dans des assiettes fraîches s’ils manquent d’aliments bactériens.
  3. À partir des plaques de stock avec de nombreux vers jeunes adultes, utilisez une approche standard pour générer une population synchronisée selon l’âge, le plus souvent blanchissant20 ou ponçant21 œufs chronométrés.
  4. Isolez les œufs et ajoutez-les à une plaque NGM tachetée de bactéries. Si vous utilisez C. elegans de type sauvage, les œufs éclosent et forment des vers, atteignant le stade larvaire L4 en 2 jours.

3. Préparation de la culture bactérienne

  1. La veille du début de l’expérience, inoculez la source de nourriture bactérienne souhaitée. Préparer ~5 mL de culture bactérienne par plaque.
    REMARQUE: La traînée bactérienne peut être préparée jusqu’à 1 mois à l’avance et stockée à 4 ° C pour la source alimentaire E. coli.
    1. Strier les bactéries pour les colonies individuelles sur la plaque de gélose LB à partir d’un stock de glycérol congelé.
    2. Cultivez la culture à 37 °C pendant la nuit.
    3. Inoculer le bouillon LB liquide avec une seule colonie par inoculation.
    4. Agiter à ~250 tr/min à 37 °C pendant 12-16 h.

4. Application d’un revêtement d’acide palmitique sur un microplateau

REMARQUE: L’acide palmitique sert de barrière aversive pour empêcher les animaux de fuir des puits individuels. Le revêtement est appliqué sur toute la surface inférieure du microplateau, à l’exception des surfaces intérieures des puits. La nystatine est ajoutée à l’acide palmitique pour atténuer la contamination fongique. Cette étape peut être complétée 1 jour avant le début de l’expérience si vous le souhaitez.

  1. Régler le bain de billes à 80 °C pour laisser le temps de préchauffer.
  2. Immédiatement avant utilisation, aliquote de 1 mL de la solution de travail d’acide palmitique par microplateau dans un récipient stérile séparé (généralement un flacon conique de 15 mL) et ajouter 4 μL de 10 000 unités/mL de nystatine par 1 mL de solution d’acide palmitique avant chauffage.
  3. Vaporiser à l’intérieur et à l’extérieur du microplateau avec de l’éthanol (70% ou plus) jusqu’à saturation et secouer l’excès d’éthanol.
    NOTE: L’éthanol résiduel doit s’évaporer pendant le traitement dans la réticulation UV (étape 4.4).
  4. Utilisez un agent de réticulation UV pour stériliser le microplateau (les instructions suivantes s’appliquent à l’agent de réticulation UV utilisé dans cette étude) :
    1. Placez le microplateau et le couvercle dans la réticulation UV séparément (c.-à-d. ne placez pas les couvercles sur les plaques, car les UV ne pénètrent pas dans le plastique).
    2. Fermez la porte et allumez la réticulation UV.
    3. Appuyez sur Heure, entrez 20 minutes, puis appuyez sur Démarrer.
    4. Après 20 min, retourner la plaque et le couvercle et répéter les étapes 4.2.2-4.2.3.
    5. Lorsque vous portez des gants, placez les couvercles sur le microplateau pour éviter toute contamination après la stérilisation.
  5. Bien mélanger la solution de travail à l’acide palmitique en tourbillonnant et en inversant.
  6. Placer le flacon de 15 ml avec la solution de travail d’acide palmitique dans le bain de billes et laisser les cristaux visibles se dissoudre complètement avant utilisation.
  7. Placez le microplateau sur le rebord entourant le bain de perles avec les couvercles pendant ~2 minutes pour réchauffer.
  8. Retirez le couvercle du microplateau. Ajouter lentement 200 μL de solution de travail d’acide palmitique sur la paroi arrière (côté long) du microplateau. Replacez les couvercles et laissez le microplateau reposer sur le bain de billes pendant 2-3 minutes pour permettre à la solution d’acide palmitique de se déposer au fond du microplateau.
    REMARQUE: Bien que le fond complet du microplateau ne soit pas complètement recouvert avant l’étape 4.10, la solution doit être répartie uniformément sur plus de la moitié de la surface inférieure. Si la solution d’acide palmitique ne se propage pas uniformément, allumez un vortex ou un moteur vibrant près du microplateau. Cela fournira une petite quantité de vibrations qui peuvent aider à permettre à la solution d’acide palmitique de se propager plus facilement. Gardez les couvercles des microplateaux en place pour atténuer la contamination.
  9. Répétez l’étape 4.8.
    REMARQUE: Environ la moitié, ou plus, du fond du microplateau doit être visiblement recouvert d’acide palmitique liquide.
  10. Faites pivoter le microbac de 180° et répétez les étapes 4.8 et 4.9 de l’autre côté du plateau.
    REMARQUE: Le fond du plateau Terasaki ne sera recouvert d’une fine couche de solution d’acide palmitique qu’après que le volume combiné complet aura été ajouté des deux côtés (étapes 4.9 et 4.10). Plus ou moins de mélange d’acide palmitique peut être nécessaire en fonction de la préparation du mélange, de la température et d’autres facteurs. Généralement, entre 400 et 800 μL du mélange d’acide palmitique seront suffisants pour recouvrir tout le fond du microplateau. Dès que le fond du microplateau est visiblement recouvert, aucun acide palmitique supplémentaire ne doit être ajouté, car cela peut contaminer les puits.
  11. Sécher le plateau dans une boîte de séchage stérile ou une hotte à flux laminaire pendant au moins 1 h à découvert. Vous pouvez également effectuer cette étape la veille du chargement des plaques (section 5), en séchant le microplateau avec le couvercle à TA pendant au moins 16 h.

5. Chargement du microplateau avec un milieu de croissance de nématodes à faible point de fusion (lmNGM)

REMARQUE : Cette méthode utilise du NGM standard mélangé à de l’agarose à bas point de fusion au lieu de la gélose habituelle. La gélose peut commencer à geler à 45 °C. Lorsque vous travaillez avec les petits volumes nécessaires pour remplir les puits de microplateaux, le NGM à base d’agar obstrue souvent la pointe de la pipette et / ou produit des surfaces de puits inégales en raison de la gélification rapide. Le NGM utilisant de l’agarose à bas point de fusion commence à geler à ~28 °C, ce qui permet au milieu fondu d’être facilement pipeté et de former constamment des surfaces planes de puits. Préparez le lmNGM le jour même où les vers doivent être placés sur le microplateau. Si vous préparez le microplateau avec du lmNGM, ensemencez avec des bactéries et chargez le C. elegans dans la même journée, assurez-vous que les animaux ont atteint ou près de l’âge désiré avant de commencer cette série d’étapes.

  1. Placez une bassine à pipette dans un bain de perles à 80 °C pour vous réchauffer.
  2. Faire fondre un prémélange de 10 mL de NGM par microplateau en cours de préparation (étape 1.1) au micro-ondes pendant ~30-45 s.
    1. Placer les tubes à essai de prémélange de NGMlm dans un bécher de 200 mL, à découvert afin qu’ils ne basculent pas.
    2. Après ~10-15 s, ou lorsque le prémélange lmNGM commence à bouillonner, mettez le micro-ondes en pause, versez le prémélange de lmNGM dans un bécher stérile de 200 ml et reprenez le micro-ondes.
    3. Faites une pause au besoin pour l’empêcher de bouillir et remuez pour mélanger.
    4. Arrêtez de passer au micro-ondes une fois que tout le lmNGM s’est transformé en liquide sans morceaux.
      REMARQUE : Une seule partie aliquote de 10 mL est suffisante pour remplir un total de 192 puits (deux microplateaux).
  3. Préparer le lmNGM en ajoutant les composants suivants, dans l’ordre indiqué, à l’agarose chaude à bas point de fusion (les volumes sont par 10 mL d’agarose à bas point de fusion) : 250 μL de KPi 25 mM (pH 6), 10 μL de 1 M CaCl2, 10 μL de 1 M MgSO4 et 10 μL de 5 mg/mL de cholestérol
    1. Si le chercheur prévoit examiner des animaux adultes au fil du temps et doit empêcher la reproduction, ajoutez également 10 μL de 50 mM de FUdR.
    2. Si vous menez une expérience d’alimentation en ARNi en utilisant la souche commune d’E . coli ARNi HT115 et les plasmides ARNi associés, ajoutez également 5 μL de carbénicilline à 50 mg/mL (pour sélectionner le plasmide ARNi) et 12 μL de 1 mM IPTG (pour induire l’expression de l’ARN double brin à partir du plasmide ARNi).
      REMARQUE: Des additifs supplémentaires peuvent être inclus en fonction des antibiotiques sélectifs et d’autres produits chimiques nécessaires pour la source de nourriture souhaitée. Des médicaments ou des facteurs de stress chimiques peuvent également être ajoutés au lmNGM à ce stade. NGM et lmNGM contiennent la même concentration finale de NaCl mais diffèrent dans la façon dont le NaCl est ajouté au milieu. Pour NGM, tout le NaCl est ajouté lors de la préparation du milieu (étape 1.2). Pour le lmNGM, une partie du NaCl est ajoutée pendant la préparation du milieu (étape 5.3) et une portion avec l’aliment bactérien (section 6). La raison de ce changement provient du faible volume de média dans chaque microbac puits. L’ajout de 5 μL de bactéries concentrées en suspension dans la LB à un puits contenant 20 μL de milieu modifiera considérablement la composition nutritive du milieu (en ajoutant les composants de la LB à un volume comparable). Pour éviter cela, la bactérie est plutôt remise en suspension dans une solution de NaCl pour éliminer les composants LB tout en empêchant le stress osmotique sur les bactéries. Le NaCl ajouté au milieu est réduit en conséquence pour tenir compte du sel ajouté aux bactéries.
  4. Verser le lmNGM dans le bassin de pipette chauffé.
  5. Avec le microplateau sur une paillasse, pipeter 20 μL de lmNGM dans chaque microplateau. Couvrir le microplateau lors du remplissage de la pipette pour minimiser la contamination.
    REMARQUE: Cette étape est plus facile avec une pipette répétitive électronique.

6. Ensemencer les puits du microplateau avec de la nourriture bactérienne

REMARQUE : 5 μL d’aliments concentrés 10x provenant d’une culture inoculée pendant la nuit sont suffisants pour nourrir un seul C. elegans pendant toute sa durée de vie.

  1. Transférer les bactéries de la culture de nuit dans un flacon conique de 50 mL.
  2. Centrifuger à ~3 500 x g pendant 20 min.
  3. Retirez le surnageant. Resuspendre la culture bactérienne à une concentration de 10x (1/10 volume de la culture d’origine) avec une solution de NaCl à 85 mM.
  4. Avant d’ajouter des bactéries aux puits, inspectez visuellement le microplateau pour vous assurer que le NGM lm solide est complètement contenu dans chaque puits. Si du lmNGM est suspendu au côté d’un puits, grattez l’excès de lmNGl avec un embout de pipette. Cet excès de milieu peut provoquer l’écoulement de l’aliment dans l’acide palmitique s’il n’est pas éliminé.
  5. Pipeter soigneusement 5 μL de culture bactérienne concentrée 10x sur la surface du lmNGM dans chaque puits. Essayez d’éviter de laisser la culture bactérienne couler sur le côté du puits et dans l’acide palmitique, car cela inciterait les vers à quitter le puits.
  6. Laissez les microplateaux sécher dans une boîte de séchage stérile ou une hotte à flux laminaire pendant ~35 min. Vérifiez toutes les ~5 minutes et veillez à ne pas trop sécher. Retirer lorsque quelques puits sont visiblement légèrement humides, car les puits sècheront davantage pendant l’ajout des nématodes.

7. Enfermer chaque microplateau dans une plaque à puits unique

REMARQUE: Dans cette section, le microplateau est monté à l’intérieur d’une plaque standard à puits unique à l’aide d’un insert personnalisé imprimé en 3D et entouré de cristaux absorbant l’eau. La plaque à puits unique est ensuite fermée et scellée avec Parafilm. Cela permet l’échange d’oxygène tout en empêchant la contamination et en maintenant une humidité suffisante pour empêcher le lmNGM de se dessécher au cours d’expériences de plusieurs semaines (les expériences sur la durée de vie des vers peuvent durer de 6 à 8 semaines si l’on examine les mutations prolongeant la durée de vie ou les conditions environnementales). Pendant la préparation, assurez-vous de couvrir la plaque chaque fois que quelque chose n’est pas ajouté activement pour minimiser la contamination bactérienne ou fongique.

  1. Stérilisez une plaque à puits unique et un adaptateur et un couvercle imprimés en 3D en trempant chacun dans une solution d’eau de Javel à 10%. Rincer abondamment à l’eau DI stérile. Essuyez avec un essuyage de tâche.
  2. Vaporisez la plaque à puits unique et l’adaptateur imprimé en 3D ainsi que le couvercle avec une solution d’éthanol à 70 % ou plus et essuyez avec une lingette de tâche. Laissez sécher à l’air libre tout éthanol résiduel.
    NOTE: Le rayonnement UV peut également être utilisé après l’eau de Javel et l’éthanol avec les mêmes paramètres que le microplateau, comme décrit ci-dessus à l’étape 4.4.
  3. Placez l’insert stérile imprimé en 3D dans une plaque stérile à puits unique.
  4. Stérilisez l’extérieur du microplateau préparé en le pulvérisant avec de l’éthanol à 70%.
  5. Placez le microbac dans l’adaptateur imprimé en 3D dans la plaque à puits unique.
  6. Jetez le couvercle du microplateau.
  7. Distribuez généreusement des cristaux d’eau sur le dessus de l’insert imprimé en 3D entre la paroi extérieure du microplateau et la paroi interne de la plaque à puits unique.
  8. Ajoutez immédiatement les vers (section 8) ou scellez le microbac à utiliser le lendemain. Fermez le couvercle du plateau et utilisez un seul morceau de Parafilm pour envelopper les quatre côtés afin de sceller le microplateau. Répétez l’étape d’étanchéité avec Parafilm deux fois de plus pour un total de trois couches.
  9. Après avoir scellé le microplateau, laissez-le sur la paillasse à TA jusqu’à 4 jours avant d’ajouter les vers (section 8).

8. Ajout de vers au microbac

REMARQUE : Un ver peut être ajouté manuellement à chaque puits en transférant les animaux des populations de vers synchronisées selon l’âge (section 2) à l’aide d’un pic de platine. Ne transférez les animaux qu’au stade de vie souhaité. Si le processus de transfert prend plus de 1 h, le lmNGM dans les puits de microplateaux peut se dessécher. Le transfert de groupes de 10 à 20 vers à la fois peut accélérer cette étape, mais il faut un peu de pratique pour ne relâcher systématiquement qu’un seul animal par puits.

  1. Ajouter un nématode par puits une fois qu’il atteint le stade de vie désiré.
  2. Replacez le couvercle sur le microplateau lorsque vous cueillez des vers sur la plaque source afin de minimiser la contamination.

9. Finition de la préparation de l’environnement de culture pour une utilisation à long terme

REMARQUE: Les étapes ci-dessous sont effectuées pour s’assurer que les milieux et les vers dans le microbac restent hydratés pendant la durée de l’expérience.

  1. Ajouter ~40 μL de la solution détergente au couvercle d’une plaque à puits unique et utiliser une lingette de travail pour enduire uniformément le couvercle. Ce revêtement empêchera la condensation au fil du temps une fois la plaque scellée. Utilisez des lingettes de travail supplémentaires pour étaler la solution détergente jusqu’à ce que la vision à travers le couvercle ne soit pas déformée (cela prend généralement environ deux lingettes de travail).
  2. Examinez les cristaux d’eau pour vous assurer qu’ils sont tous deux au niveau du bord supérieur du microplateau et qu’ils ne débordent pas. Si nécessaire, ajoutez ou retirez des cristaux d’eau dans la plaque.
  3. En utilisant l’approche suivante, enveloppez le plateau avec Parafilm (trois pièces au total) pour vous assurer que le joint Parafilm durera à long terme.
    1. Étirez légèrement le premier morceau de Parafilm pour couvrir deux côtés du plateau.
    2. Étirez légèrement le deuxième morceau de Parafilm et couvrez les côtés restants du plateau.
    3. Étirez le dernier morceau de Parafilm et enveloppez complètement les quatre côtés du plateau, en couvrant les premier et deuxième morceaux de Parafilm. Un microplateau correctement scellé peut rester hydraté pendant ~ 2 mois.
      REMARQUE: Surveillez l’intégrité du parafilm toutes les 1-2 semaines tout au long de l’expérience et remplacez-le au besoin.
    4. Essuyez le haut du plateau avec une lingette de travail, humide avec de l’éthanol à 70%, pour enlever les empreintes digitales.
  4. Étiquetez la plaque à puits unique à l’aide de ruban adhésif. Le microbac est maintenant prêt pour l’imagerie et le stockage à long terme afin de surveiller les vers au fil du temps. Entre les séances d’imagerie, maintenez le plateau à 20 °C. Le microplateau peut être ouvert et refermé plusieurs fois pour le dosage du médicament ou d’autres procédures, mais doit être minimisé pour éviter la contamination et la perte d’humidité.

10. Imagerie de vers individuels dans des puits de microplateaux

REMARQUE : Le but de ce protocole est de fournir une description détaillée de la façon de préparer l’environnement de culture de microplateaux. Une fois préparés et peuplés de vers, les environnements de culture de vers uniques à microplateaux peuvent être utilisés pour surveiller longitudinalement de nombreux phénotypes à l’aide de techniques établies pour la culture standard sur des plaques de Petri. La section suivante fournit des instructions de base pour mesurer certains phénotypes courants. L’imagerie fluorescente doit être réalisée au microscope vertical. La réfraction de la lumière à travers le plateau de Terasaki est minimisée dans une pièce sombre.

  1. Durée de vie: Mesurez la durée de vie en tapotant doucement le côté ou le haut de l’assiette ou en faisant briller une lumière bleue brillante sur la plaque et en observant chaque animal. Marquez un animal « mort » s’il ne bouge pas en quelques secondes. Répétez cette tâche tous les 1 à 3 jours jusqu’à ce que tous les vers soient morts.
    REMARQUE: L’environnement de culture de microplateaux est compatible avec les systèmes qui automatisent la collecte et l’analyse d’images pour l’estimation de la durée de vie14,19.
  2. Microscopie standard : Effectuez des images en fond clair (ou fond noir) sur des puits individuels ou sur l’ensemble du plateau à l’aide d’une caméra ou d’un scanner haute résolution. Ces données d’imagerie peuvent être utilisées pour une variété de phénotypes, y compris la taille de l’animal 22,23,24, le développement 25,l’activité 14,19 et la durée de vie.
  3. Microscopie fluorescente : Effectuez l’imagerie fluorescente sur des puits uniques, manuellement ou avec un système de plate-forme motorisée. Les plateaux à puits unique sont compatibles avec les adaptateurs de plaques multipuits standard. Le rapport signal/bruit est minimisé si l’appareil est placé dans une boîte à paroi noire.
    REMARQUE: Parce que les vers sont imagés tout en restant libres de ramper, ce système de culture est bien adapté à l’imagerie à basse résolution pour capturer la fluorescence du corps entier et la localisation des tissus rugueux des fluorophores. L’imagerie à haute résolution et à fort grossissement nécessite généralement que les animaux soient immobilisés pour empêcher tout mouvement. Bien qu’il soit possible d’appliquer localement un agent paralysant (p. ex. azoture de sodium ou lévamisole) sur chaque puits et de procéder à une imagerie à plus haute résolution, cela empêcherait de répéter les mesures du même ver à des moments ultérieurs. Le système de culture, tel que décrit, n’est pas non plus destiné à être inversé, ce qui empêche l’utilisation de systèmes de microscope inversé.
    1. Si le fond clair n’est pas utilisé pour mesurer la durée de vie et que seule la fluorescence est capturée, mesurez la durée de vie manuellement. Laisser la lumière bleue (utilisée pour l’excitation GFP) sur le ver pendant 5 s incitera l’animal à bouger. Si l’animal n’a pas bougé dans les 5 s, considérez l’animal comme mort.

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Résultats

L’environnement de culture de vers uniques à base de microplateaux décrit ici peut être utilisé pour surveiller une variété de phénotypes, y compris la durée de vie et la durée de santé, l’activité et le mouvement, la forme du corps et la géométrie rampante, et l’expression de biomarqueurs fluorescents exprimés transgéniquement chez des animaux individuels au fil du temps. Le système de culture de microplateaux est compatible avec l’analyse de la durée de vie par notation manuelle ou collecte d?...

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Discussion

Ici, nous décrivons un nouveau système de culture qui adapte les microplateaux, développé à l’origine pour les tests de typage tissulaire de l’antigène leucocytaire humain, afin de permettre l’isolement et la caractérisation de C. elegans uniques au fil du temps dans un environnement de milieux solides qui est contextuellement similaire au NGM à base d’agar qui est la norme dans la recherche sur C. elegans. Ce système est compatible avec une variété d’interventions, y compris la re...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par NIH R35GM133588 à G.L.S., une subvention de formation NIHT32GM008659 à L.E., un prix Catalyst de l’Académie nationale de médecine des États-Unis à G.L.S. et le State of Arizona Technology and Research Initiative Fund administré par l’Arizona Board of Regents.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
3D-printed terasaki insertsCustom printing companyRobot_Terasaki_tray_insert_10-20
-2021.STL		FDM printing, nozzle size 0.6 mm using standard PLA plus filament
AirClean systems AC624LF vertical laminar flow fume hoodFisher Scientific36-100-4376
Bacto peptoneThermo Scientific211677
CaCl2Acros organics349615000
Caenorhabditis elegans N2Caenorhabditis Genetics Center (CGC)N2Wildtype strain
CarbenicillinGoldbioC-103-25
CholesterolICN Biomedicals Inc101380
Escherichia coli OP50 Caenorhabditis Genetics Center (CGC)OP50Standard labratory food for C. elegans
EthanolMilliporeex0276-4
Fisher Vortex Genie 2Fisher ScientificG-560
FUdR Research Products InternationalF10705-1.0
Hydrating water crystals M2 Polymer TechnologiesType SType S super absorbent polymer
Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)GoldBioI2481C100
K2HPO4Fisher ChemicalP288-500
KimwipesKimTech34155Task wipes
LB Broth, LennoxBD Difco240230
Leica K5 sCMOS monochrome cameraLeica Microsystems11547112
Leica M205 FCA Fluorescent Stereo MicroscopeLeica Microsystems10450826
Low-melt agaroseResearch Products InternationalA20070-250.0
MgSO4 Fisher ChemicalM-8900
NaClFisher bioreagentsBP358-1
Nunc OmniTray Single-Well PlateThermo Scientific264728
NystatinSigmaN1538
Palmitic acidAcros organics129700010
Paper towelsCoastwide Professional365374
Parafilm MParafilm16-101
Stratagene UV Stratalinker 2400Stratagene400075UV crosslinker
Terasaki trays (Lambda)One Lambda151431
Thermolyne Dri-bathThermolyneDB28125
Tween Thermo ScientificJ20605-AP

Références

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