Coltura a lungo termine di singoli Caenorhabditis elegans su terreni solidi per il monitoraggio longitudinale della fluorescenza e interventi avversivi

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per la coltura di singoli nematodi isolati su terreni solidi per il monitoraggio dei parametri fisiologici permanenti e la quantificazione della fluorescenza. Questo sistema di coltura include una barriera di acido palmitico attorno ai pozzi a singolo verme per impedire agli animali di fuggire, consentendo l'uso di interventi avversivi, inclusi batteri patogeni e fattori di stress chimici.

Abstract

Caenorhabditis elegans sono ampiamente utilizzati per studiare la biologia dell'invecchiamento. La pratica standard negli studi sull'invecchiamento di C. elegans è quella di coltivare gruppi di vermi su terreni di crescita di nematodi solidi (NGM), consentendo la raccolta efficiente di dati a livello di popolazione per la sopravvivenza e altri fenotipi fisiologici e il campionamento periodico delle sottopopolazioni per la quantificazione dei biomarcatori fluorescenti. I limiti di questo approccio sono l'incapacità di (1) seguire i singoli vermi nel tempo per sviluppare traiettorie di età per fenotipi di interesse e (2) monitorare biomarcatori fluorescenti direttamente nel contesto dell'ambiente di coltura. Gli approcci di coltura alternativi utilizzano la coltura liquida o la microfluidica per monitorare i singoli animali nel tempo, in alcuni casi inclusa la quantificazione della fluorescenza, con il compromesso che l'ambiente di coltura è contestualmente distinto dal NGM solido. Il WorMotel è un dispositivo multi-pozzo microfabbricato precedentemente descritto per la coltura di vermi isolati su NGM solido. Ogni verme è mantenuto in un pozzo contenente NGM solido circondato da un fossato riempito di solfato di rame, un repellente da contatto per C. elegans, che consente il monitoraggio longitudinale dei singoli animali. Troviamo che il solfato di rame non è sufficiente per impedire ai vermi di fuggire quando sottoposti a interventi avversivi comuni nella ricerca sull'invecchiamento, tra cui restrizioni dietetiche, batteri patogeni e agenti chimici che inducono stress cellulare. I dispositivi multi-pozzetto sono anche stampati da polidimetilsilossano, che produce artefatti di fondo elevati nell'imaging a fluorescenza. Questo protocollo descrive un nuovo approccio per la coltura di nematodi isolati su NGM solido utilizzando microvassoi di polistirene disponibili in commercio, originariamente progettati per la tipizzazione dell'antigene leucocitario umano (HLA), consentendo la misurazione della sopravvivenza, dei fenotipi fisiologici e della fluorescenza per tutta la durata della vita. Una barriera di acido palmitico impedisce ai vermi di fuggire, anche in presenza di condizioni avverse. Ogni piastra può coltivare fino a 96 animali e si adatta facilmente a una varietà di condizioni, tra cui restrizioni dietetiche, RNAi e additivi chimici, ed è compatibile con i sistemi automatizzati per la raccolta di dati sulla durata della vita e sull'attività.

Introduzione

C. elegans è un potente organismo modello per la ricerca in genetica, biologia cellulare e biologia molecolare, perché sono facilmente coltivabili in laboratorio, hanno un breve tempo di generazione e durata della vita, condividono un alto grado di omologia proteica con i mammiferi e hanno una struttura corporea trasparente che consente la visualizzazione in vivo di proteine fluorescenti e coloranti¹. Come risultato dell'uso di lunga data di C. elegans come importante sistema modello in una serie di campi, tra cui la biologia dello sviluppo e l'invecchiamento, la loro crescita e sviluppo sono ben compresi, il loro genoma è stato completamente sequenziato e sono stati creati una serie di potenti strumenti genetici, tra cui librerie di alimentazione RNAi a livello di genoma e migliaia di ceppi mutanti e transgenici. Storicamente, i C. elegans sono coltivati come popolazioni su terreni di crescita solidi di nematodi agar (NGM) e i fenotipi sono valutati manualmente mediante osservazione diretta o mediante imaging e analisi a valle. La microscopia fluorescente viene utilizzata per catturare una varietà di fenotipi molecolari utilizzando coloranti o tag fluorescenti espressi transgenicamente in singoli C. elegans. L'imaging fluorescente comporta tipicamente il fissaggio o la paralisi di un animale su vetrini contenenti sottili cuscinetti di agarosio, che è invasivo e spesso letale. Comporta anche l'uso di sostanze chimiche, come il levamisolo o l'azoturo di sodio, che possono potenzialmente interferire con il processo molecolare di interesse ^2,3. Insieme, questi approcci consentono di raccogliere dati trasversali a livello di popolazione su un'ampia gamma di fenotipi, ma non consentono il monitoraggio dei singoli animali nel tempo.

Negli ultimi anni, sono emersi diversi approcci per coltivare C. elegans isolati, consentendo ai ricercatori di catturare i cambiamenti dinamici nei fenotipi fisiologici e molecolari degli animali nel tempo utilizzando nuove tecnologie di imaging. Una categoria di approccio colturale di C. elegans sono i dispositivi microfluidici, tra cui WormFarm⁴, il chip Nemalife⁵ e il chip "behavior" di Chronis et ^al.6, tra i vari altri ^7,8,9. Correlati a questi sono metodi di coltura a base liquida, che utilizzano piastre multi-pozzetto per caratterizzare singoli vermi o piccole popolazioni nel tempo^10,11. I sistemi di microfluidica e micropiastre forniscono eccellenti misurazioni quantitative delle risposte fenotipiche in C. elegans fino a un singolo animale, ma l'ambiente di coltura presenta una limitazione chiave. La stragrande maggioranza delle ricerche passate su C. elegans, in particolare nel campo dell'invecchiamento, è stata completata su terreni solidi a base di agar. La coltura liquida fa sì che C. elegans nuoti continuamente e rappresenti un contesto ambientale distinto che può alterare la biologia sottostante. Ad esempio, gli animali allevati in terreni liquidi hanno drasticamente alterato il contenuto di grassi e l'espressione genica - in particolare per i geni coinvolti nella risposta allo stress - rispetto agli animali coltivati su NGM solido^12,13 a base di agar. Una categoria alternativa di metodi di imaging per singolo animale coinvolge dispositivi di polidimetilsilossano (PDMS) che isolano i singoli animali su supporti solidi, nel tentativo di imitare più da vicino l'ambiente standard sperimentato dai vermi coltivati su NGM solido in coltura di gruppo su piastre di Petri. Il WorMotel è un dispositivo PDMS a 240 pozzetti progettato per allevare singoli animali su supporti solidi. Ogni pozzetto è riempito con un NGM modificato utilizzando agarosio a basso punto di fusione al posto dell'agar e seminato con cibo batterico, creando un ambiente solido simile al sistema di coltura più comune che utilizza piastre di Petri. Le pareti del pozzo sono rotonde, consentendo a ciascun animale di essere ripreso indipendentemente dalla posizione nel pozzo (evitando l'oscuramento visivo causato da un animale vicino a un muro in una piastra multi-pozzo). Il solfato di rame in uno stretto fossato che circonda ogni pozzo è usato come deterrente per mantenere gli animali nei loro pozzi^14,15. Una limitazione di questo approccio è che il solfato di rame è inefficace nel prevenire la fuga dei vermi quando sono presenti condizioni ambientali avverse, tra cui restrizioni dietetiche, batteri patogeni o sostanze chimiche che inducono stress cellulare (ad esempio, paraquat).

Un secondo sistema che utilizza mezzi solidi è il Worm Corral, che impiega un idrogel per creare un piccolo ambiente sigillato per ogni verme su un vetrino, consentendo il monitoraggio a lungo termine di animali isolati individualmente¹⁶. Una limitazione chiave è che gli animali devono essere sigillati nell'ambiente come uova, richiedendo l'uso di animali sterili per prevenire la riproduzione e limitando i trattamenti farmacologici a una singola applicazione. Le sperimentazioni multidose di farmaci possono essere eseguite nel WorMotel conducendo più cicli di esposizione prima di trasferire i vermi al dispositivo o aggiungendo localmente ulteriori farmaci ai pozzetti durante l'esperimento; Tuttavia, in quest'ultimo caso, la dose di esposizione effettiva dopo l'aggiunta di un farmaco aggiuntivo a un pozzetto esistente è difficile da quantificare con precisione e dipende dalla rapidità con cui il farmaco si degrada. Sia il WorMotel che il Worm Corral sono eccellenti per l'imaging in campo chiaro o in campo oscuro per acquisire informazioni relative all'attività e alla fisiologia animale (ad esempio, crescita e sviluppo). Mentre questi sistemi possono essere utilizzati per monitorare la fluorescenza, nella nostra esperienza, il PDMS utilizzato per creare le altre tecnologie di imaging a singolo verme è incline a formare microbolle, catturare il particolato e altre piccole anomalie che generano artefatti fluorescenti irregolari che interferiscono con la visualizzazione e la quantificazione della fluorescenza coerente, specialmente nell'intervallo di emissione per GFP, il fluoroforo più comune utilizzato nella ricerca su C. elegans. Ad oggi, l'imaging a fluorescenza vivo di singoli animali di C. elegans in modo longitudinale si basa principalmente su dispositivi microfluidici¹⁷.

Qui, descriviamo un nuovo metodo per la coltura di singoli C. elegans su supporti solidi che è compatibile sia con gli interventi avversivi che con l'imaging fluorescente diretto. Questo approccio è concettualmente simile ad altre tecnologie di imaging a singolo verme, tranne per il fatto che il chip PDMS stampato su misura viene sostituito con microvassoi in polistirene disponibili in commercio originariamente sviluppati per saggi di microcitotossicità (comunemente chiamati anche vassoi Terasaki)¹⁸. Questi microvassoi sono dotati di pozzetti che possono essere riempiti con terreni solidi e seminati con cibo batterico, imitando da vicino l'ambiente sperimentato dagli animali con la metodologia standard di coltura NGM solida. Ogni pozzetto è circondato da una barriera avversiva di acido palmitico piuttosto che di solfato di rame. L'acido palmitico è comunemente usato per impedire ai vermi di fuggire dai mezzi solidi, utilizzando la coltura di gruppo standard su piastre di Petri in esperimenti in cui i vermi sono sfidati con un ambiente avversivo come la restrizione dietetica o l'esposizione a un fattore di stress chimico. I microvassoi producono anche uno sfondo fluorescente minimo e coerente, consentendo l'imaging fluorescente degli animali direttamente nel loro ambiente di coltura. Questo nuovo sistema di coltura a base di agar solido per singolo animale non solo consente di tracciare i singoli animali per tutta la vita e monitorare la crescita, lo sviluppo, l'attività e la durata della vita, ma è anche compatibile con la microscopia fluorescente diretta. Poiché i vermi possono essere fotografati senza paralisi o fissazione, i biomarcatori di fluorescenza in vivo possono essere quantificati longitudinalmente nei singoli animali che rimangono sui loro terreni di coltura, consentendo l'osservazione dei cambiamenti dinamici nel corso della vita di ciascun animale. Questo sistema di coltura è anche compatibile con i sistemi automatizzati di attuale generazione per il monitoraggio della durata della vita e altre metriche sanitarie^14,19. Forniamo un protocollo dettagliato per la coltura di singoli C. elegans in questo sistema basato su microvassoi, discutiamo potenziali insidie e risoluzione dei problemi e discutiamo i vantaggi e le limitazioni relativi ad altri sistemi e, in particolare, un protocollo WorMotel aggiornato e ottimizzato¹⁵.

Ogni ambiente di coltura a singolo verme è costituito da un microvassoio montato all'interno di un vassoio standard a pozzetto singolo utilizzando un adattatore personalizzato stampato in 3D (Figura 1A). I pozzetti sono riempiti con terreni di crescita di nematodi agarosio a basso punto di fusione (lmNGM), seminati con batteri concentrati come fonte di cibo e circondati da un rivestimento di acido palmitico per impedire ai vermi di fuggire (Figura 1B). Lo spazio tra il microvassoio e le pareti della piastra a pozzetto singolo è riempito con cristalli di acqua satura per mantenere l'umidità (Figura 1B). Un rivestimento detergente viene applicato al coperchio del vassoio per evitare la formazione di condensa. Un singolo verme viene aggiunto a ciascun pozzetto e il vassoio a pozzetto singolo viene sigillato con Parafilm per mantenere l'umidità e consentire lo scambio di ossigeno. Fino a sei microvassoi possono ragionevolmente essere preparati in parallelo da un singolo ricercatore praticato.

Protocollo

1. Ricette

NOTA: Preparare le soluzioni stock prima di iniziare la preparazione della piastra del microvassoio.

1. Soluzioni stock per terreni di crescita di nematodi agarosio a basso punto di fusione (lmNGM)
   1. Preparare 1 M K 2 HPO₄ sciogliendo 174,18 g di K₂HPO4 in 1 Ldi acqua deionizzata sterile in una bottiglia da 1 L. Autoclavare la soluzione a 121 °C, 15 psi, per 30 minuti e conservarla a temperatura ambiente (RT).
   2. Preparare 1 M KP_i (pH 6,0) sciogliendo 136,09 g di KH₂HPO₄ in 1 L di acqua deionizzata sterile in una bottiglia da 1 L. Titolare la soluzione con 1 M K₂HPO₄ per ottenere pH 6,0. Autoclavare la soluzione a 121 °C, 15 psig, per 30 minuti e conservarla a RT.
   3. Preparare 1 M CaCl 2 sciogliendo 73,5 g di CaCl₂ in 500 ml di acqua deionizzata sterile in un flacone da 500 ml. Autoclavare la soluzione a 121 °C, 15 psig, per 30 minuti e conservarla a RT
   4. Preparare 1 M MgSO 4 sciogliendo 123,25 g di MgSO₄ in 500 ml di acqua deionizzata sterile in un flacone da 500 ml. Autoclavare la soluzione a 121 °C, 15 psig, per 30 minuti e conservarla a RT.
   5. Preparare 3 M NaCl per lmNGM: In una bottiglia pulita da 100 ml, unire 100 ml di acqua ultrapura e 18,20 g di NaCl. Autoclave a 121 °C, 15 psig, per 30 min.
   6. Preparare 5 mg / ml di colesterolo combinando 2,5 g di colesterolo, 275 ml di etanolo al 100% e 25 ml di acqua deionizzata sterile in una bottiglia ambrata da 500 ml. Autoclavare la soluzione a 121 °C, 15 psig, per 30 minuti e conservarla a RT.
   7. Preparare 50 mM di fluorodesossiuridina (FUdR) sciogliendo 0,1231 g di FUdR in 10 mL di acqua deionizzata sterile in un tubo conico da 15 ml. Utilizzare una siringa da 10 ml e un filtro da 0,22 μm per sterilizzare la soluzione. Aliquot 1 mL della soluzione ciascuno in 10 provette da microcentrifuga e conservarle a -20 °C.
   8. Preparare 50 mg/mL di carbenicillina sciogliendo 500 mg di carbenicillina in 10 mL di acqua deionizzata sterile in un tubo conico da 15 ml. Utilizzare una siringa da 10 ml e un filtro da 0,22 μm per sterilizzare la soluzione. Aliquot 1 mL della soluzione ciascuno in 10 provette da microcentrifuga e conservarle a -20 °C.
   9. Preparare 1 mM di isopropile ß-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) sciogliendo 2,38 g di IPTG in 10 ml di acqua deionizzata sterile in un tubo conico da 15 ml. Utilizzare una siringa da 10 ml e un filtro da 0,22 μm per sterilizzare la soluzione. Aliquot 1 mL della soluzione ciascuno in 10 provette da microcentrifuga e conservarle a -20 °C.
   10. Preparare 100 mg/ml di ampicillina sciogliendo 1 g di ampicillina in 10 ml di acqua deionizzata sterile in un tubo conico da 15 ml. Utilizzare una siringa da 10 ml e un filtro da 0,22 μm per sterilizzare la soluzione. Aliquot 1 mL della soluzione di ampicillina da 100 mg/mL ciascuno in 10 provette da microcentrifuga e conservare le provette a -20 °C.
2. Preparazione dei terreni di crescita dei nematodi (NGM) per il mantenimento generale di C. elegans
   1. Per preparare 50 piatti, sciogliere 10 g di agar Bacro, 1,5 g di NaCl e 1,25 g di Bacto peptone in 486 ml di acqua ultrapura in un matraccio da 1 L. Sterilizzare il terreno mediante autoclave a ciclo liquido a 121 °C, 15 psig, per almeno 30 min.
   2. Dopo l'autoclave, lasciare raffreddare il mezzo a 55 °C. Quindi, aggiungere 12,5 ml di 1 M KP_i, 500 μL di 1 M MgSO₄, 500 μL di 1 M CaCl₂ e 500 μL di 5 mg / ml di colesterolo alla soluzione.
   3. Con una tecnica sterile, versare 10 ml del terreno preparato al punto 1.2.2 in ciascuna piastra da 60 mm (50 in totale). Lasciare le piastre con il supporto per almeno 30 minuti per solidificare. Pipettare 300 μL di coltura batterica cresciuta durante la notte sul centro della piastra e lasciare la piastra sul banco. Lasciare asciugare la coltura e crescere più spessa per 1-2 giorni. Conservare queste piastre NGM con batteri a 4 °C.
3. Preparazione della premiscela lmNGM
   1. In un matraccio Erlenmeyer da 250 ml, unire 2 g di agarosio a basso punto di fusione, 0,25 g di peptone, 1 ml di 3 M NaCl e 99 ml di acqua ultrapura. Autoclavare la soluzione a 121 °C, 15 psig, per 30 min.
   2. Aliquot 10 mL di lmNGM in provette e coprire con Parafilm per evitare la perdita di liquido. Tappare i tubi e lasciarli raffreddare e solidificare.
4. Preparare 85 mM di NaCl per alimenti batterici: in un flacone da 100 ml, combinare 515,61 mg di NaCl e riempire fino a 100 ml con acqua ultrapura. Autoclave a 121 °C, 15 psig, per 30 min.
5. Preparare cristalli di poliacrilammide che assorbono l'acqua sciogliendo 1 g di polimero super assorbente di tipo S in 150 ml di acqua ultrapura in un flacone autoclavabile. Tagliare la punta per garantire un'adeguata dimensione di erogazione. Autoclave a 121 °C, 15 psig, per 30 minuti, coprire con carta stagnola e agitare per amalgamare i cristalli.
6. Preparare una soluzione detergente combinando 3 ml di 100% Tween-20 con 7 ml di acqua ultrapura in un flaconcino conico da 15 ml.
7. Preparare 5 mg / ml di colesterolo combinando 2,5 g di colesterolo, 275 ml di 100% EtOH e 25 ml di acqua ultrapura in una bottiglia da 500 ml.
8. Preparare la soluzione di lavoro di acido palmitico
   1. Macinare 500 mg di acido palmitico solido in un mortaio e pestello e combinarlo con 15 ml di Tween-20 in una fiala conica da 50 mL. Mescolare a vortice, sciogliendo il maggior numero possibile di cristalli.
   2. Aggiungere 17,5 ml di etanolo al 100% e vortice la soluzione per sciogliere quanto più acido palmitico possibile.
   3. Aggiungere 17,5 ml di acqua ultrapura e vortice rigorosamente. Riscaldare delicatamente la soluzione in un bagno di perline a 80 °C fino a quando l'acido palmitico non si dissolve completamente. Alcuni acidi palmitici possono precipitare durante il raffreddamento.
9. Preparare il brodo lisogeno (LB) mescolando 20 g di polvere LB in 1 L di acqua deionizzata in un becher da 1 L o più grande. Aliquote 500 mL di brodo in due becher da 500 ml. Autoclavare il brodo a 121 °C, 15 psig, per 30 min. Conservare il brodo preparato su RT.
10. Preparazione di piastre di agar di brodo lisogenico (LB)
    1. Mescolare 10 g di polvere LB e 7,5 g di agar Bacto in 500 μL di acqua deionizzata in un matraccio da 1 L. Autoclavare la soluzione a ciclo liquido a 121 °C, 15 psig, per 30 min.
    2. Se lo si desidera, aggiungere antibiotici opzionali (500 μL di 100 μg/mL di ampicillina) dopo che il mezzo autoclavato è stato raffreddato a 55 °C. Utilizzando una tecnica sterile, realizzare piastre di agar LB versando 20 ml di terreno in ogni piastra da 100 mm (25 in totale). Conservare le piastre a 4 °C.

2. Preparare una popolazione di vermi sincronizzati con l'età

1. Preparare una popolazione di vermi sincronizzati per l'età che sono pronti per essere aggiunti al microvassoio allo stadio larvale 4 (L4). In alternativa, è possibile aggiungere vermi in qualsiasi fase di vita (FUdR deve essere escluso dal supporto del microvassoio se i vermi vengono aggiunti in una fase di sviluppo precedente a L4 per prevenire l'arresto dello sviluppo).
   NOTA: questo passaggio deve essere completato 2 giorni prima di aggiungere i worm al microvassoio se la fase di vita target all'inizio dell'esperimento è L4. I tempi di sincronizzazione possono essere regolati per consentire ai worm di raggiungere la fase di vita desiderata.
2. La temperatura può influire sulla durata della vita. Per risultati coerenti, utilizzare piastre NGM standard (vedere paragrafo 1) per mantenere C. elegans a 20 °C e trasferire i vermi in piastre fresche se esauriscono il cibo batterico.
3. Dalle piastre di riserva con molti vermi giovani adulti, utilizzare un approccio standard per generare una popolazione sincronizzata per età, più comunemente sbiancando²⁰ o deponendo uova a tempo²¹.
4. Isolare le uova e aggiungerle a una piastra NGM macchiata di batteri. Se si utilizza C. elegans wild-type, le uova si schiuderanno e formeranno vermi, raggiungendo lo stadio larvale L4 in 2 giorni.

3. Preparazione della coltura batterica

1. Il giorno prima dell'inizio dell'esperimento, inoculare la fonte di cibo batterica desiderata. Preparare ~ 5 ml di coltura batterica per piastra.
   NOTA: La striscia batterica può essere preparata fino a 1 mese prima e conservata a 4 °C per E. coli fonte alimentare.
   1. Striare i batteri per singole colonie sulla piastra di agar LB da uno stock di glicerolo congelato.
   2. Coltiva la coltura a 37 °C durante la notte.
   3. Inoculare il brodo liquido LB con una singola colonia per inoculazione.
   4. Agitare a ~250 giri/min a 37 °C per 12-16 ore.

4. Applicazione del rivestimento di acido palmitico al microvassoio

NOTA: L'acido palmitico funge da barriera avversiva per impedire la fuga degli animali dai singoli pozzi. Il rivestimento viene applicato su tutta la superficie inferiore del microvassoio, ad eccezione delle superfici interne dei pozzetti. La nistatina viene aggiunta all'acido palmitico per mitigare la contaminazione fungina. Questo passaggio può essere completato 1 giorno prima dell'inizio dell'esperimento, se lo si desidera.

1. Impostare il bagno di perline a 80 °C per consentire il preriscaldamento.
2. Immediatamente prima dell'uso, aliquote 1 mL della soluzione di lavoro di acido palmitico per microvassoio in un contenitore sterile separato (tipicamente un flaconcino conico da 15 mL) e aggiungere 4 μL di 10.000 unità/mL di nistatina per 1 mL di soluzione di acido palmitico prima del riscaldamento.
3. Spruzzare all'interno e all'esterno del microvassoio con etanolo (70% o superiore) fino alla saturazione e scrollarsi di dosso l'etanolo in eccesso.
   NOTA: L'etanolo residuo dovrebbe evaporare durante il trattamento in reticolazione UV (fase 4.4).
4. Utilizzare un reticolante UV per sterilizzare il microvassoio (le seguenti istruzioni sono per il reticolante UV utilizzato in questo studio):
   1. Posizionare separatamente il microvassoio e il coperchio nel reticolante UV (cioè, non posizionare i coperchi sulle piastre, poiché i raggi UV non penetrano nella plastica).
   2. Chiudere la porta e accendere il reticolante UV.
   3. Premere Ora, immettere 20 minuti e quindi premere Start.
   4. Dopo 20 minuti, capovolgere la piastra e il coperchio e ripetere i passaggi 4.2.2-4.2.3.
   5. Mentre si indossano i guanti, posizionare i coperchi sul microvassoio per prevenire la contaminazione dopo la sterilizzazione.
5. Mescolare accuratamente la soluzione di lavoro dell'acido palmitico vorticando e invertendo.
6. Introdurre il flaconcino conico da 15 mL con la soluzione di lavoro di acido palmitico nel bagno di perline e lasciare che eventuali cristalli visibili si dissolvano completamente prima dell'uso.
7. Posizionare il microvassoio sulla sporgenza che circonda il bagno di perline con i coperchi per ~ 2 minuti per riscaldarsi.
8. Rimuovere il coperchio del microvassoio. Aggiungere lentamente 200 μL di soluzione di lavoro di acido palmitico attraverso la parete posteriore (lato lungo) del microvassoio. Riposizionare i coperchi e lasciare riposare il microvassoio sul bagno di perline per 2-3 minuti per consentire alla soluzione di acido palmitico di depositarsi sul fondo del microvassoio.
   NOTA: Mentre l'intero fondo del microvassoio non sarà completamente rivestito fino al punto 4.10, la soluzione deve distribuirsi uniformemente su più della metà della superficie inferiore. Se la soluzione di acido palmitico non si diffonde uniformemente, accendere un vortice o un motore vibrante vicino al microvassoio. Ciò fornirà una piccola quantità di vibrazioni che possono aiutare a consentire alla soluzione di acido palmitico di diffondersi più facilmente. Tenere i coperchi dei microvassoi in posizione per mitigare la contaminazione.
9. Ripetere il passaggio 4.8.
   NOTA: Circa la metà o più del fondo del microvassoio deve essere visibilmente coperto con acido palmitico liquido.
10. Ruotare il microvassoio di 180° e ripetere i passaggi 4.8 e 4.9 sull'altro lato del vassoio.
    NOTA: Il fondo del vassoio Terasaki sarà coperto con un sottile strato di soluzione di acido palmitico solo dopo che il volume combinato completo è stato aggiunto su entrambi i lati (punti 4.9 e 4.10). Può essere necessaria una miscela di acido palmitico più o meno a seconda della preparazione della miscela, della temperatura e di altri fattori. Generalmente, tra 400 e 800 μL della miscela di acido palmitico saranno sufficienti per rivestire l'intero fondo del microvassoio. Non appena il fondo del microvassoio è visibilmente coperto, non deve essere aggiunto ulteriore acido palmitico, poiché ciò può contaminare i pozzetti.
11. Asciugare il vassoio in una scatola di asciugatura sterile o in una cappa a flusso laminare per almeno 1 ora scoperta. In alternativa, completare questo passaggio il giorno prima del caricamento delle piastre (sezione 5), asciugando il microvassoio con il coperchio acceso a RT per almeno 16 ore.

5. Caricamento del microvassoio con substrato di crescita di nematodi a basso punto di fusione (lmNGM)

NOTA: Questo metodo utilizza NGM standard miscelato con agarosio a basso punto di fusione al posto del solito agar. L'agar può iniziare a gelificare a 45 °C. Quando si lavora con i piccoli volumi necessari per riempire i pozzetti dei microvassoi, l'NGM a base di agar spesso ostruisce la punta della pipetta e/o produce superfici irregolari a causa della rapida gelificazione. NGM utilizzando agarosio a basso punto di fusione inizia a gelificare a ~ 28 ° C, consentendo al mezzo fuso di essere facilmente pipettato e formando costantemente superfici piane del pozzo. Preparare lmNGM lo stesso giorno in cui i vermi devono essere posizionati sul microvassoio. Se si prepara il microvassoio con lmNGM, si semina con batteri e si caricano i C. elegans tutti nello stesso giorno, assicurarsi che gli animali abbiano raggiunto o vicino all'età desiderata prima di iniziare questa serie di passaggi.

1. Posizionare una bacinella per pipette in un bagno di perline a 80 °C per riscaldarsi.
2. Fondere una premiscela lmNGM da 10 ml per ogni microvassoio in preparazione (fase 1.1) nel microonde per ~30-45 s.
   1. Collocare le provette di premiscela lmNGM in un becher da 200 ml, scoperte in modo che non si ribaltino.
   2. Dopo ~10-15 s, o quando la premiscela lmNGM inizia appena a bollire, mettere in pausa il microonde, versare la premiscela lmNGM in un becher sterile da 200 ml e riprendere il microonde.
   3. Mettere in pausa se necessario per evitare che bollisca e ruotare per mescolare.
   4. Smetti di cuocere al microonde una volta che tutto lmNGM si è trasformato in liquido senza pezzi.
      NOTA: Una singola aliquota da 10 mL è sufficiente per riempire un totale di 192 pozzetti (due microvassoi).
3. Preparare lmNGM aggiungendo i seguenti componenti nell'ordine elencato all'agarosio caldo a basso punto di fusione (i volumi sono per 10 ml di agarosio a basso punto di fusione): 250 μL di 25 mM KPi (pH 6), 10 μL di 1 M CaCl₂, 10 μL di 1 M MgSO₄ e 10 μL di 5 mg/ml di colesterolo
   1. Se il ricercatore prevede di esaminare gli animali adulti nel tempo e deve prevenire la riproduzione, aggiungere anche 10 μL di 50 mM FUdR.
   2. Se si esegue un esperimento di alimentazione con RNAi utilizzando il comune ceppo HT115 RNAi E. coli e plasmidi RNAi associati, aggiungere anche 5 μL di 50 mg/ml di carbenicillina (per selezionare il plasmide RNAi) e 12 μL di 1 mM IPTG (per indurre l'espressione dell'RNA a doppio filamento dal plasmide RNAi).
      NOTA: Ulteriori additivi possono essere inclusi a seconda degli antibiotici selettivi e di altre sostanze chimiche necessarie per la fonte alimentare desiderata. Farmaci o fattori di stress chimici possono anche essere aggiunti a lmNGM in questa fase. NGM e lmNGM contengono la stessa concentrazione finale di NaCl ma differiscono nel modo in cui il NaCl viene aggiunto al supporto. Per NGM, tutto il NaCl viene aggiunto durante la preparazione del supporto (passaggio 1.2). Per lmNGM, una porzione di NaCl viene aggiunta durante la preparazione del terreno (fase 5.3) e una porzione con il cibo batterico (paragrafo 6). La ragione di questo cambiamento deriva dal piccolo volume di supporto in ogni pozzetto microtray. L'aggiunta di 5 μL di batteri concentrati sospesi in LB a un pozzetto contenente 20 μL di terreno altererà sostanzialmente la composizione nutritiva del terreno (aggiungendo i componenti di LB ad un volume comparabile). Per evitare ciò, il batterio viene invece risospeso in una soluzione di NaCl per rimuovere i componenti LB evitando lo stress osmotico sui batteri. Il NaCl aggiunto al mezzo viene ridotto di conseguenza per tenere conto del sale aggiunto ai batteri.
4. Versare lmNGM nella vasca riscaldata per pipette.
5. Con il microvassoio su un banco, pipettare 20 μL di lmNGM in ciascun microvassoio. Coprire il microvassoio quando si riempie nuovamente la pipetta per ridurre al minimo la contaminazione.
   NOTA: questo passaggio è più semplice con una pipetta elettronica a ripetizione.

6. Seminare i pozzetti del microvassoio con cibo batterico

NOTA: 5 μL di 10x alimenti concentrati provenienti da una coltura inoculata durante la notte sono sufficienti per nutrire un singolo C. elegans per l'intera durata della sua vita.

1. Trasferire i batteri dalla coltura durante la notte a una fiala conica da 50 ml.
2. Centrifugare a ~3.500 x g per 20 min.
3. Rimuovere il surnatante. Risospendere la coltura batterica ad una concentrazione 10x (1/10 del volume della coltura originale) con 85 mM di soluzione di NaCl.
4. Prima di aggiungere batteri ai pozzetti, ispezionare visivamente il microvassoio per assicurarsi che lmNGM solido sia completamente contenuto all'interno di ciascun pozzetto. Se un lmNGM è appeso al lato di un pozzo, raschiare via lmNGM in eccesso con una punta di pipetta. Questo mezzo in eccesso può causare il cibo a correre in acido palmitico se non eliminato.
5. Pipettare accuratamente 5 μL di coltura batterica concentrata 10x sulla superficie del lmNGM in ciascun pozzetto. Cerca di evitare che la coltura batterica scorra sul lato del pozzo e nell'acido palmitico, poiché ciò attirerà i vermi a lasciare il pozzo.
6. Lasciare asciugare i microvassoi in una scatola di asciugatura sterile o in una cappa a flusso laminare per ~35 minuti. Controlla ogni ~ 5 minuti e fai attenzione a non asciugare eccessivamente. Rimuovere quando alcuni pozzetti sono visibilmente leggermente bagnati, poiché i pozzetti si asciugheranno ulteriormente mentre i nematodi vengono aggiunti.

7. Racchiudere ogni microvassoio all'interno di una piastra a pozzetto singolo

NOTA: In questa sezione, il microvassoio è montato all'interno di una piastra standard a pozzetto singolo utilizzando un inserto personalizzato stampato in 3D e circondato da cristalli che assorbono l'acqua. La piastra a pozzetto singolo viene quindi chiusa e sigillata con Parafilm. Ciò consente lo scambio di ossigeno prevenendo la contaminazione e mantenendo un'umidità sufficiente per evitare che lmNGM si secchi nel corso di esperimenti di più settimane (gli esperimenti sulla durata della vita dei vermi possono durare 6-8 settimane se si esaminano mutazioni che estendono la durata della vita o condizioni ambientali). Durante la preparazione, assicurarsi di coprire la piastra ogni volta che qualcosa non viene aggiunto attivamente per ridurre al minimo la contaminazione batterica o fungina.

1. Sterilizzare una piastra a pozzetto singolo e un adattatore e un coperchio stampati in 3D immergendoli in una soluzione di candeggina al 10%. Risciacquare abbondantemente con acqua DI sterile. Asciugare con una salvietta da attività.
2. Spruzzare la piastra a pozzetto singolo e l'adattatore stampato in 3D e il coperchio con una soluzione di etanolo al 70% o superiore e pulire con una salvietta da attività. Lasciare asciugare all'aria l'etanolo residuo.
   NOTA: la radiazione UV può essere utilizzata anche dopo candeggina ed etanolo con gli stessi parametri del microvassoio, come descritto sopra al punto 4.4.
3. Posizionare l'inserto sterile stampato in 3D in una piastra sterile a pozzetto singolo.
4. Sterilizzare l'esterno del microvassoio preparato spruzzandolo con etanolo al 70%.
5. Posizionare il microvassoio nell'adattatore stampato in 3D nella piastra a pozzetto singolo.
6. Eliminare il coperchio del microvassoio.
7. Erogare liberamente cristalli d'acqua sulla parte superiore dell'inserto stampato in 3D tra la parete esterna del microvassoio e la parete interna della piastra a pozzetto singolo.
8. Aggiungere immediatamente i vermi (sezione 8) o sigillare il microvassoio da utilizzare il giorno successivo. Chiudere il coperchio del vassoio e utilizzare un singolo pezzo di Parafilm per avvolgere tutti e quattro i lati per sigillare il microvassoio. Ripetere la fase di sigillatura con Parafilm altre due volte per un totale di tre strati.
9. Dopo aver sigillato il microvassoio, lasciarlo sul banco di RT per un massimo di 4 giorni prima di aggiungere i vermi (sezione 8).

8. Aggiunta di vermi al microvassoio

NOTA: Un verme può essere aggiunto manualmente a ciascun pozzetto trasferendo animali dalle popolazioni di vermi sincronizzate per età (sezione 2) utilizzando un plettro di platino. Trasferisci solo gli animali nella fase di vita desiderata. Se il processo di trasferimento richiede più di 1 ora, lmNGM nei pozzetti del microvassoio può essiccarsi. Il trasferimento di gruppi da 10 a 20 vermi alla volta può accelerare questo passaggio, ma ci vuole un po 'di pratica per rilasciare costantemente solo un singolo animale per pozzo.

1. Aggiungere un nematode per pozzetto una volta raggiunta la fase di vita desiderata.
2. Riposizionare il coperchio sul microvassoio quando si prelevano i vermi dalla piastra sorgente per ridurre al minimo la contaminazione.

9. Finire di preparare l'ambiente di coltura per l'uso a lungo termine

NOTA: i passaggi riportati di seguito vengono eseguiti per garantire che i supporti e i vermi nel microvassoio rimangano idratati per tutta la durata dell'esperimento.

1. Aggiungere ~ 40 μL della soluzione detergente al coperchio di una piastra a pozzetto singolo e utilizzare una pulizia per rivestire uniformemente il coperchio. Questo rivestimento eviterà la condensa nel tempo una volta sigillata la piastra. Utilizzare salviette aggiuntive per distribuire la soluzione detergente fino a quando la visione attraverso il coperchio non è distorta (questo di solito richiede circa due salviette da attività).
2. Esaminare i cristalli d'acqua per assicurarsi che siano entrambi a livello del bordo superiore del microvassoio e non traboccanti. Se necessario, aggiungere o rimuovere cristalli d'acqua sulla piastra.
3. Utilizzando il seguente approccio, avvolgere il vassoio con Parafilm (tre pezzi in totale) per garantire che il sigillo Parafilm duri a lungo termine.
   1. Allungare leggermente il primo pezzo di Parafilm per coprire due lati del vassoio.
   2. Allungare leggermente il secondo pezzo di Parafilm e coprire i lati rimanenti del vassoio.
   3. Allungare il pezzo finale di Parafilm e avvolgere completamente tutti e quattro i lati del vassoio, coprendo il primo e il secondo pezzo di Parafilm. Un microvassoio adeguatamente sigillato può rimanere idratato per ~ 2 mesi.
      NOTA: Monitorare l'integrità del parafilm ogni 1-2 settimane durante l'esperimento e sostituirlo secondo necessità.
   4. Pulire la parte superiore del vassoio con una salvietta da lavoro, umida con etanolo al 70%, per rimuovere eventuali impronte digitali.
4. Etichettare la piastra a pozzetto singolo usando del nastro adesivo. Il microvassoio è ora pronto per l'imaging e la conservazione a lungo termine per monitorare i worm nel tempo. Tra una sessione di imaging e l'altra, tenere il vassoio a 20 °C. Il microvassoio può essere aperto e risigillato più volte per il dosaggio del farmaco o altre procedure, ma deve essere ridotto al minimo per evitare contaminazione e perdita di umidità.

10. Imaging di singoli vermi nei pozzetti dei microvassoi

NOTA: lo scopo di questo protocollo è fornire una descrizione dettagliata di come preparare l'ambiente di coltura del microvassoio. Una volta preparati e popolati con vermi, gli ambienti di coltura a singolo verme microtray possono essere utilizzati per monitorare longitudinalmente molti fenotipi utilizzando tecniche stabilite per la coltura standard su piastre di Petri. La sezione seguente fornisce istruzioni di base per misurare alcuni fenotipi comuni. L'imaging fluorescente deve essere eseguito in un microscopio verticale. La rifrazione della luce attraverso il vassoio Terasaki è ridotta al minimo in una stanza buia.

1. Durata della vita: misura la durata della vita toccando delicatamente il lato o la parte superiore del piatto o facendo brillare una luce blu brillante sul piatto e osservando ogni animale. Segna un animale "morto" se non si muove entro pochi secondi. Ripeti questa attività ogni 1-3 giorni fino a quando tutti i vermi sono morti.
   NOTA: L'ambiente di coltura microtray è compatibile con i sistemi che automatizzano la raccolta e l'analisi delle immagini per la stima della durata di vita^14,19.
2. Microscopia standard: eseguire immagini in campo chiaro (o in campo scuro) su singoli pozzetti o sull'intero vassoio con una fotocamera o uno scanner ad alta risoluzione. Questi dati di imaging possono essere utilizzati per una varietà di fenotipi, tra cui dimensioni animali 22,23,24, sviluppo ²⁵, attività ^14,19 e durata della vita.
3. Microscopia fluorescente: esegue l'imaging fluorescente su singoli pozzetti manualmente o con un sistema di piattaforma motorizzato. I vassoi a pozzetto singolo sono compatibili con gli adattatori a piastre multipozzetto standard. Il rapporto segnale-rumore è ridotto al minimo se l'apparecchio è collocato in una scatola con pareti nere.
   NOTA: Poiché le immagini dei vermi rimangono libere di strisciare, questo sistema di coltura è adatto all'imaging a bassa risoluzione per catturare la fluorescenza di tutto il corpo e la localizzazione approssimativa dei tessuti dei fluorofori. L'imaging ad alta risoluzione e ad alto ingrandimento richiede in genere che gli animali siano immobilizzati per impedire il movimento. Mentre dovrebbe essere possibile applicare localmente un agente paralizzante (ad esempio, azoturo di sodio o levamisolo) a ciascun pozzetto e procedere con l'imaging ad alta risoluzione, ciò precluderebbe misurazioni ripetute dello stesso verme in punti temporali successivi. Anche il sistema di coltura, come descritto, non è destinato ad essere invertito, il che impedisce l'uso di sistemi di microscopi invertiti.
   1. Se il campo luminoso non viene utilizzato per misurare la durata della vita e viene catturata solo la fluorescenza, misurare manualmente la durata della vita. Lasciare la luce blu (utilizzata per l'eccitazione GFP) sul verme per 5 secondi richiederà all'animale di muoversi. Se l'animale non si è mosso entro 5 secondi, considera l'animale come morto.

Risultati

L'ambiente di coltura a singolo verme basato su microvassoi qui descritto può essere utilizzato per monitorare una varietà di fenotipi, tra cui durata della vita e durata della salute, attività e movimento, forma del corpo e geometria strisciante e l'espressione di biomarcatori fluorescenti espressi transgenicamente nei singoli animali nel tempo. Il sistema di coltura microtray è compatibile con l'analisi della durata di vita attraverso il punteggio manuale o la raccolta di immagini e l'analisi di imaging a valle. Co...

Discussione

Qui, descriviamo un nuovo sistema di coltura che adatta i microvassoi, originariamente sviluppati per i saggi di tipizzazione del tessuto dell'antigene leucocitario umano, per consentire l'isolamento e la caratterizzazione di singoli C. elegans nel tempo in un ambiente di media solidi che è contestualmente simile all'NGM basato su agar che è lo standard nella ricerca su C. elegans. Questo sistema è compatibile con una varietà di interventi, tra cui la restrizione dietetica, il trattamento farmacol...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D-printed terasaki inserts	Custom printing company	Robot_Terasaki_tray_insert_10-20 -2021.STL	FDM printing, nozzle size 0.6 mm using standard PLA plus filament
AirClean systems AC624LF vertical laminar flow fume hood	Fisher Scientific	36-100-4376
Bacto peptone	Thermo Scientific	211677
CaCl2	Acros organics	349615000
Caenorhabditis elegans N2	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	N2	Wildtype strain
Carbenicillin	Goldbio	C-103-25
Cholesterol	ICN Biomedicals Inc	101380
Escherichia coli OP50	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	OP50	Standard labratory food for C. elegans
Ethanol	Millipore	ex0276-4
Fisher Vortex Genie 2	Fisher Scientific	G-560
FUdR	Research Products International	F10705-1.0
Hydrating water crystals	M2 Polymer Technologies	Type S	Type S super absorbent polymer
Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	GoldBio	I2481C100
K2HPO4	Fisher Chemical	P288-500
Kimwipes	KimTech	34155	Task wipes
LB Broth, Lennox	BD Difco	240230
Leica K5 sCMOS monochrome camera	Leica Microsystems	11547112
Leica M205 FCA Fluorescent Stereo Microscope	Leica Microsystems	10450826
Low-melt agarose	Research Products International	A20070-250.0
MgSO4	Fisher Chemical	M-8900
NaCl	Fisher bioreagents	BP358-1
Nunc OmniTray Single-Well Plate	Thermo Scientific	264728
Nystatin	Sigma	N1538
Palmitic acid	Acros organics	129700010
Paper towels	Coastwide Professional	365374
Parafilm M	Parafilm	16-101
Stratagene UV Stratalinker 2400	Stratagene	400075	UV crosslinker
Terasaki trays (Lambda)	One Lambda	151431
Thermolyne Dri-bath	Thermolyne	DB28125
Tween	Thermo Scientific	J20605-AP