Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.
Method Article
Mevcut protokol, viral proteinleri (Fg seviyesinde) doğru bir şekilde tespit etmek için yararlı nanosistemlere dayalı düşük maliyetli biyo-algılama prototiplerinin üretimini açıklamaktadır. Bu kadar küçük bir sensör platformu, teletıp hedeflerini karşılamak için Tıbbi Nesnelerin İnterneti (IoMT) ile entegre edilebilen bakım noktası uygulamalarına olanak tanır.
Bu algılama prototip modeli, şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2 virüsünü (SARS-CoV-2) spesifik ve hızlı bir şekilde tespit etmek için yeniden kullanılabilir, iki katlı grafen oksit (GrO) sırlı çift sayısallaştırılmış kapasitif (DIDC) tespit çipinin geliştirilmesini içerir. Fabrikasyon DIDC, virüsün spike (S1) proteinine dayalı olarak SARS-CoV-2'ye düşman antikorları (Abs) hareketsiz hale getirmek için EDC-NHS ile kimyasal olarak daha da modifiye edilen grafen oksit (GrO) ile sırlanmış Ti/Pt içeren bir cam substrat içerir. Kapsamlı araştırmaların sonuçları, GrO'nun Ab immobilizasyonu için ideal bir mühendislik yüzeyi sağladığını ve daha yüksek hassasiyet ve düşük algılama limitlerine izin vermek için kapasitansı geliştirdiğini gösterdi. Bu ayarlanabilir elemanlar, geniş bir algılama aralığı (1,0 mg/mL ila 1,0 fg/mL), minimum 1 fg/mL algılama sınırı, yüksek yanıt verme ve 18,56 nF/g'lik iyi doğrusallık ve 3 s'lik hızlı tepki süresi elde edilmesine yardımcı oldu. Ayrıca, finansal olarak uygulanabilir bakım noktası (POC) test çerçevelerinin geliştirilmesi açısından, bu çalışmada GrO-DIDC biyoçipinin yeniden kullanılabilirliği iyidir. Önemli bir şekilde, biyoçip kan yoluyla bulaşan antijenlere karşı spesifiktir ve 5 ° C'de 10 güne kadar stabildir. Kompaktlığı nedeniyle, bu küçültülmüş biyosensör, COVID-19 enfeksiyonunun POC teşhisi potansiyeline sahiptir. Bu sistem aynı zamanda diğer ciddi viral hastalıkları da tespit edebilir, ancak diğer virüs örneklerini kullanan bir onay adımı geliştirilme aşamasındadır.
Yeni bir beta koronavirüs1'in (yani 2019-nCoV) neden olduğu ve daha sonra şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2 (SARS-CoV-2)2 (bundan sonra ağırlıklı olarak virüs olarak anılacaktır) olarak adlandırılan, pnömonik bir küme ve şiddetli akut solunum sıkıntısı içeren viral bir pandemi, 2019'un sonunda Çin'in Wuhan şehrinde ortaya çıktı3. Dünya çapında insandan insana hızlı bulaşması, yüksek enfeksiyon oranı, yüksek ölüm oranı ve yaşamı tehdit eden ciddi yan etkileri4 nedeniyle, pandemi sırasında viroloji araştırmaları5 virüsün genomik organizasyonunu ve yapısını tanımlamak için hızla gelişti 5,6. COVID-19 7,8'in semptomları arasında yüksek ateş, kuru öksürük ve yaygın ağrıbulunur 9. Daha da önemlisi, virüsün farklı serotipleri farklı hastalık şiddetlerine yol açar10. Ayrıca, asemptomatik taşıyıcılar virüsü potansiyel olarak yayabilir. Genellikle, mikroskop altında, COVID-19 virüs parçacıkları, spike proteinleri11 tarafından oluşturulan kulüp benzeri projeksiyonlar gösterir. Bu nedenle, bu yeni patojenin yayılmasını kontrol etmek için vakaların tespiti zamanında ve verimli olmalıdır. Bu nedenle, viral enfeksiyonun erken aşamalarında virüsün ultra hassas, hızlı ve seçici tespiti çok önemli hale gelmiştir 2,11. Virüsün12 bulaşmasını önlemek için sosyal/fiziksel mesafeye ihtiyaç vardır. Sağlık kurumları, akıllı teşhis araçlarının ve nano sistemlerin geliştirilmesine vurgu yapıyor13. Gerçekten de, sağlık kurumlarının önerdiği gibi, hedefli ve toplu test14,15 gereklidir ve hala talep edilmektedir.
Prensip olarak, ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) gibi devam eden biyolojik tanı yöntemleri, Orta Doğu solunum sendromu ile ilişkili koronavirüs (MERS-CoV)16 ve SARS-CoV-117'de olduğu gibi SARS-CoV-2'nin toplu olarak tanımlanması için en iyi araçtır. Bu bağlamda, SARS-CoV-2 kontaminasyonunun mevcut standart tanımlaması, enfeksiyona özgü özellikleringeliştirilmesine bağlıdır 18,19. Ek olarak, SARS-CoV-2 enfeksiyonundaki bölgeye, yaşa, ırka ve cinsiyete göre varyasyon dikkate alınmalıdır. Hayat kurtarma nihai hedefiyle, bakım noktası (POC)20,21 kullanımı için hızlı tanı araçları oluşturmak çok önemlidir.
Bu bağlamda, floresan in situ hibridizasyon (FISH), protein immünosorbent incelemesi (ELISA), mikroküre tabanlı yöntemler, elektrokimyasal testler ve MRI, PET ve NIRFOI22 gibi düzenli stratejilerin düşük virüs seviyelerine duyarlılığı, düşük seçiciliği ve düşük yeniden kullanım kapasitesi vardır; Ek olarak, bu tür prosedürlerin maliyetli biyo-algılama teşhis sistemleri, yeniden kullanılamayan reaktifler ve yüksek vasıflı bir işgücü gereksinimi dahil olmak üzere dezavantajları vardır23. Bu nedenle, bu anlayışlı teknikler hızlı, makul, istisnai olarak spesifik veya hassas POC yöntemleri olarak görülemez 24,25. Dikkat çekici bir şekilde, bileşik, kapasitif ve elektrik tekniklerini kullanan farklı türde DNA ve bağışıklayıcı tabanlı biyosensörler vardır 18,26,27,28. Örnek olarak, Ebola31, Zika, MERS-CoV ve SARS-CoV32,33,34'ün tespiti için yüksek duyarlılığa sahip, basit bir şekilde küçültülebilen ve ayarlanabilir29,30 olan elektriksel DNA biyosensörleri üretilmiştir. Benzer şekilde, grafen sırlı cihazlar üzerinde hareketsiz hale getirilmiş belirli antikorları (monoklonal) kullanarak virüsün spike proteinini tespit etmek için bir alan etkili yarı iletken (FET) biyosensörü etkili bir şekilde oluşturulmuştur35,36. Bununla birlikte, bu yeni strateji RT-PCR'den daha az hassastır. Ayrıca, daha yakın zamanlarda, virüs için düşük bir tanımlama sınırına (2,8 × 10-15 M) sahip olan, aerosol jet nanopartikül ile azaltılmış grafen oksit (GrO) kaplı bir 3D terminal tabanlı algılama çerçevesi geliştirilmiştir; her durumda, önerilen karmaşık biyosensör yapısı35, POC kullanımı açısından test edilmiş ve virüsün 35,37,38 tespiti için kullanılan diğer mevcut biyosensör stratejileriyle karşılaştırılmıştır.
Bu çalışmada, diğer biyosensörler için yukarıda belirtilen sınırlamalar olmaksızın virüs spike proteinini tanımlamak için küçültülmüş ve yeniden kullanılabilir bir GrO tabanlı DIDC biyosensörü tasarladık ve ürettik. Bu biyosensör, yanıt süresinin 3 s 18,27'si içinde femtogram (fg) seviyesinde algılamaya izin verir. Bu araştırmayı gerçekleştirmek için, daha iyi yanıt verme ve seçicilik için GrO nanopulları seçildi, bu da orofaringeal veya nazofaringeal sürüntülerden virüs antijen proteininin düşük konsantrasyonlarının tespit edilebileceği anlamına geliyor. GrO, biyoalgılama uygulamaları için faydalı bir şekilde kullanılabilecekuygun, sentetik olarak güvenilir, tutarlı ve iletken bir malzemedir 2,39,40,41. Ek olarak, virüs spike S1 proteinine odaklanan bir monoklonal IgG antikoru etiketsiz hibridizasyon yaklaşımı kullanıldı. Fabrikasyon SARS-CoV-2-GrO-DIDC biyosensörü, piranha çözeltisi ile ileri tedavi ve temizlikten sonra tekrar kullanılabilir. Bu ultra hızlı, hassas, seçici, etiketsiz ve yeniden kullanılabilir biyosensör, klinik numune biyoalgılama ve kişiselleştirilmiş sağlık hizmetleri uygulamaları için kullanılabilir 26,42,43,44.
1. DIDC algılama çipinin temizlenmesi
2. DIDC algılama çipi üzerinde ince grafen oksit tabakasının imalatı
3. GO camlı DIDC algılama çipinin çapraz bağlanması ve işlevselleştirilmesi
4. Protein algılama için çip üzerinde antikor hazırlama ve immobilizasyon
Burada, SARS-CoV-2 virüsünün S1 proteinini grafen oksit sırlı çift sayısallar arası kapasitif (DIDC) algılama çipi kullanarak algılamak için bir protokol sunulmaktadır. Şekil 1 , son derece hassas ve geri dönüştürülebilir grafen oksit modifiyeli çift sayısallaştırılmış kapasitif (DIDC) algılama çipinin şematik bir temsilini (devre düzeni ile fabrikasyon) göstermektedir. Ayrıntılı adım adım imalat süreci
Verimli bir DIDC çip tabanlı biyosensör oluşturmak için DIDC'nin yük dağılımı, iletkenliği ve dielektrik sabiti son derece önemlidir. Önemli ölçüde, bu algılama sınırlarındaki iyileştirmeler, DIDC 18,26,27'nin kapasitif reaktansı ile ilgilidir. Bu çalışmada, Abs virüsüne düşman olan ve grafen oksit-DIDC bazlı SiO2substratı27 üzer...
Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.
Bu çalışma, Eğitim Bakanlığı tarafından Hibe 2018R1D1A1A09083353 ve Hibe 2018R1A6A1A03025242 kapsamında desteklenen Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NRF) aracılığıyla Temel Bilim Araştırma Programı tarafından bir dereceye kadar onaylandı, bir şekilde GCS Group Association Ltd. ve Kore Çevre Bakanlığı (MOE) Enstitüsü tarafından Entegre Kirlilik Önleme ve Kontrol Projesi'ne büyük enerji yatırdı ve 2022'de Kwangwoon Üniversitesi'nin Araştırma Bursu.
EM, Ulusal Biyomedikal Görüntüleme ve Biyomühendislik Enstitüsü'nün (5T32EB009035) desteğini kabul eder.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Amyloid β1-42 Protein | Merck (Sigma-Aldrich) | 107761-42-2 | |
anti-SARS-CoV-2 Spike (S1) monoclonal IgG antibody | SinoBiological | 40150-R007 | |
EDC [N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride] | Thermo Fisher Scientific | A35391 | |
Ethyl alcohol (C2H5OH) | Sigma-Aldrich | ||
Hydrogen peroxide (H2O2) | |||
Kapton tape | polyimide tape | ||
NHS (NHydroxysuccinimide, 98+%; C4H5NO3) | Thermo Fisher Scientific | A39269 | |
PBS | |||
Prostate-specific antigen | Sigma-Aldrich | P3338-25UG | |
SARS-CoV-2 Spike S1-His recombinant protein | SinoBiological | 40591-V08H | |
Single layer Graphene Oxide | Graphene Supermarket | ||
Spin Coater | High Precision Spin Coater (Spin Coating System) | ACE-200 | |
Sulfuric acid (H2SO4) |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır