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Method Article
Das vorliegende Protokoll beschreibt die Herstellung kostengünstiger Biosensor-Prototypen auf Basis nützlicher Nanosysteme für den genauen Nachweis viraler Proteine (auf Fg-Ebene). Eine solche winzige Sensorplattform ermöglicht Point-of-Care-Anwendungen, die in das Internet der medizinischen Dinge (IoMT) integriert werden können, um telemedizinische Ziele zu erreichen.
Dieses Sensor-Prototypmodell umfasst die Entwicklung eines wiederverwendbaren, zweifach mit Graphenoxid (GrO) glasierten, doppelt interdigitalisierten kapazitiven (DIDC) Detektionschips für die spezifische und schnelle Detektion des schweren akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus 2 Virus (SARS-CoV-2). Das hergestellte DIDC besteht aus einem Ti/Pt-haltigen Glassubstrat, das mit Graphenoxid (GrO) glasiert ist, das weiter chemisch mit EDC-NHS modifiziert wird, um Antikörper (Abs) zu immobilisieren, die SARS-CoV-2 feindlich gesinnt sind, basierend auf dem Spike-Protein (S1) des Virus. Die Ergebnisse aufschlussreicher Untersuchungen zeigten, dass GrO eine ideale technische Oberfläche für die Ab-Immobilisierung darstellt und die Kapazität erhöht, um eine höhere Empfindlichkeit und niedrige Erfassungsgrenzen zu ermöglichen. Diese abstimmbaren Elemente trugen dazu bei, einen großen Erfassungsbereich (1,0 mg/ml bis 1,0 fg/ml), eine minimale Erfassungsgrenze von 1 fg/ml, eine hohe Reaktionsfähigkeit und gute Linearität von 18,56 nF/g sowie eine schnelle Reaktionszeit von 3 s zu erreichen. Außerdem ist die Wiederverwendbarkeit des GrO-DIDC-Biochips in dieser Studie im Hinblick auf die Entwicklung finanziell tragfähiger Point-of-Care (POC)-Testrahmen gut. Bezeichnenderweise ist der Biochip spezifisch gegen durch Blut übertragbare Antigene und bis zu 10 Tage bei 5 °C stabil. Aufgrund seiner Kompaktheit hat dieser verkleinerte Biosensor das Potenzial für die POC-Diagnostik von COVID-19-Infektionen. Dieses System kann auch andere schwere Viruserkrankungen erkennen, obwohl ein Zulassungsschritt unter Verwendung anderer Virusbeispiele in der Entwicklung ist.
Ende 2019 trat in der Stadt Wuhan, China, eine Viruspandemie auf, die durch ein neues Beta-Coronavirus1 (d. h. 2019-nCoV) verursacht wurde, das später als schweres akutes respiratorisches Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2)2 (im Folgenden überwiegend als das Virus bezeichnet wurde) und ein Lungencluster und schwere akute Atemnot umfasste3. Aufgrund der schnellen weltweiten Übertragung von Mensch zu Mensch, der hohen Infektionsrate, der hohen Sterblichkeitsrate und der schwerwiegenden lebensbedrohlichen Nebenwirkungen4 entwickelte sich die virologische Forschung5 während der Pandemie schnell weiter, um die genomische Organisation und Struktur des Virus zu identifizieren 5,6. Zu den Symptomen von COVID-19 7,8 gehören hohes Fieber, trockener Husten und generalisierte Schmerzen9. Wichtig ist, dass unterschiedliche Serotypen des Virus zu unterschiedlichen Krankheitsschweregraden führen10. Darüber hinaus können asymptomatische Träger das Virus potenziell verbreiten. Normalerweise zeigen COVID-19-Viruspartikel unter dem Mikroskop keulenartige Fortsätze, die von Spike-Proteinen gebildet werden11. Um die Ausbreitung dieses neuen Erregers einzudämmen, muss die Erkennung der Fälle daher rechtzeitig und effizient erfolgen. Daher ist der hochempfindliche, schnelle und selektive Nachweis des Virus in den frühen Stadien der Virusinfektion von entscheidender Bedeutung geworden 2,11. Soziale/physische Distanzierung ist erforderlich, um die Übertragung12 des Virus zu vermeiden. Gesundheitsbehörden legen den Schwerpunkt auf die Entwicklung intelligenter Diagnoseinstrumente und Nanosysteme13. Wie von den Gesundheitsbehörden vorgeschlagen, sind gezielte und Massentests 14,15 erforderlich und nach wie vor gefragt.
Prinzipiell sind fortlaufende biologische Diagnosemethoden wie die Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) das beste Mittel zur massenhaften Identifizierung von SARS-CoV-2, wie bei dem Middle East Respiratory Syndrome-related Coronavirus (MERS-CoV)16 und SARS-CoV-117. In diesem Zusammenhang hängt die derzeitige Standardidentifizierung einer SARS-CoV-2-Kontamination von der Verbesserung infektionsspezifischer Merkmale ab18,19. Darüber hinaus sollte die Variation der SARS-CoV-2-Infektion je nach Gebiet, Alter, Rasse und Geschlecht berücksichtigt werden. Mit dem ultimativen Ziel, Leben zu retten, ist es von entscheidender Bedeutung, schnelle Diagnoseinstrumente für den Einsatz am Point-of-Care (POC) zu entwickeln20,21.
In diesem Zusammenhang weisen reguläre Strategien wie Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH), Protein-Immunsorbent-Untersuchung (ELISA), mikrosphärenbasierte Methoden, elektrochemische Tests sowie MRT, PET und NIRFOI22 eine geringe Sensitivität gegenüber niedrigen Viruskonzentrationen, eine geringe Selektivität und eine geringe Wiederverwendungskapazität auf. Darüber hinaus haben solche Verfahren Nachteile, darunter kostspielige Biosensor-Diagnosesysteme, nicht wiederverwendbare Reagenzien und den Bedarf an hochqualifizierten Arbeitskräften23. Daher können diese aufschlussreichen Techniken nicht als schnelle, vernünftige, außergewöhnlich spezifische oder empfindliche POC-Methoden angesehen werden24,25. Bemerkenswert ist, dass es verschiedene Arten von DNA- und Immunizer-basierten Biosensoren gibt, die verbindungsbezogene, kapazitive und elektrische Techniken verwenden 18,26,27,28. Zum Beispiel wurden elektrische DNA-Biosensoren, die eine hohe Reaktionsfähigkeit aufweisen, einfach verkleinert werden können und abstimmbar sind29,30, für den Nachweis von Ebola31, Zika, MERS-CoV und SARS-CoV 32,33,34 hergestellt. In ähnlicher Weise wurde effektiv ein Field-Impact-Halbleiter-Biosensor (FET) zum Nachweis des Spike-Proteins des Virus unter Verwendung bestimmter Antikörper (monoklonal) hergestellt, die auf Graphen-glasierten Geräten immobilisiert sind35,36. Nichtsdestotrotz ist diese neue Strategie weniger empfindlich als die RT-PCR. Darüber hinaus wurde in jüngerer Zeit ein mit Nanopartikeln (GrO) bedecktes 3D-Terminal-basiertes Detektionsframework für das Virus entwickelt, das eine niedrige Identifikationsgrenze aufweist (2,8 × 10-15 M); In jedem Fall ist die vorgeschlagene komplexe Biosensorstruktur35 im Hinblick auf die Verwendung von POC getestet und mit anderen bestehenden Biosensorstrategien verglichen worden, die zum Nachweis des Virus verwendet werden 35,37,38.
In dieser Studie haben wir einen verkleinerten und wiederverwendbaren GrO-basierten DIDC-Biosensor zur Identifizierung des Virus-Spike-Proteins ohne die oben beschriebenen Einschränkungen für andere Biosensoren entwickelt und hergestellt. Dieser Biosensor ermöglicht die Detektion auf Femtogramm-Ebene (fg) innerhalb von 3 s18,27 der Reaktionszeit. Um diese Forschung durchzuführen, wurden GrO-Nanoflocken für eine bessere Reaktionsfähigkeit und Selektivität ausgewählt, was bedeutet, dass niedrige Konzentrationen des Virusantigenproteins aus oropharyngealen oder nasopharyngealen Abstrichen nachgewiesen werden können. GrO ist ein geeignetes, synthetisch zuverlässiges, konsistentes und leitfähiges Material, das vorteilhaft für Biosensorik-Anwendungen verwendet werden kann 2,39,40,41. Zusätzlich wurde ein monoklonaler IgG-Antikörper-Markierungs-freier Hybridisierungsansatz verwendet, der sich auf das Virus-Spike-S1-Protein konzentriert. Der hergestellte SARS-CoV-2-GrO-DIDC-Biosensor ist nach fortschrittlicher Behandlung und Reinigung mit Piranha-Lösung wiederverwendbar. Dieser ultraschnelle, empfindliche, selektive, markierungsfreie und wiederverwendbare Biosensor kann für die Biosensorik klinischer Proben und Anwendungen in der personalisierten Medizin eingesetzt werden 26,42,43,44.
1. Reinigung des DIDC-Sensorchips
2. Herstellung der dünnen Schicht aus Graphenoxid auf dem DIDC-Sensorchip
3. Vernetzung und Funktionalisierung des GO-glazed DIDC Sensing Chips
4. Antikörpervorbereitung und Immobilisierung auf dem Chip für die Proteinsensorik
In dieser Arbeit wird ein Protokoll zur Detektion des S1-Proteins des SARS-CoV-2-Virus unter Verwendung eines Graphenoxid-glasierten doppelt interdigitalisierten kapazitiven (DIDC) Sensorchips vorgestellt. Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung (Herstellung mit dem Schaltungslayout) des extrem empfindlichen und recycelbaren Graphenoxid-modifizierten Double Interdigitated Capacitive (DIDC) Sensorchips. Der detaillierte schrittweise Herstellungsprozes...
Für die Herstellung eines produktiven DIDC-Chip-basierten Biosensors sind die Ladungsverteilung, die Leitfähigkeit und die Dielektrizitätskonstante des DIDC äußerst wichtig. Bezeichnenderweise beziehen sich die Verbesserungen dieser Detektionsgrenzen auf die kapazitive Reaktanz des DIDC 18,26,27. In dieser Studie wurde ein kapazitiver Immunsensor hergestellt, der dem Virus Abs feindlich ges...
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Diese Arbeit wurde bis zu einem gewissen Grad durch das Basic Science Research Program der National Research Foundation of Korea (NRF) unterstützt, das vom Bildungsministerium im Rahmen von Grant 2018R1D1A1A09083353 und Grant 2018R1A6A1A03025242 gesponsert wurde, etwas von der GCS Group Association Ltd. und von der Graduiertenschule des koreanischen Umweltministeriums (MOE) investierte enorme Energie in das Integrated Pollution Prevention and Control Project und ein Forschungsstipendium der Kwangwoon University im Jahr 2022.
E.M. bedankt sich für die Unterstützung durch das National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering (5T32EB009035).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Amyloid β1-42 Protein | Merck (Sigma-Aldrich) | 107761-42-2 | |
anti-SARS-CoV-2 Spike (S1) monoclonal IgG antibody | SinoBiological | 40150-R007 | |
EDC [N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride] | Thermo Fisher Scientific | A35391 | |
Ethyl alcohol (C2H5OH) | Sigma-Aldrich | ||
Hydrogen peroxide (H2O2) | |||
Kapton tape | polyimide tape | ||
NHS (NHydroxysuccinimide, 98+%; C4H5NO3) | Thermo Fisher Scientific | A39269 | |
PBS | |||
Prostate-specific antigen | Sigma-Aldrich | P3338-25UG | |
SARS-CoV-2 Spike S1-His recombinant protein | SinoBiological | 40591-V08H | |
Single layer Graphene Oxide | Graphene Supermarket | ||
Spin Coater | High Precision Spin Coater (Spin Coating System) | ACE-200 | |
Sulfuric acid (H2SO4) |
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