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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Il presente protocollo descrive la fabbricazione di prototipi di biorilevamento a basso costo basati su nanosistemi utili per rilevare con precisione le proteine virali (a livello di Fg). Una piattaforma di sensori così piccola consente applicazioni point-of-care che possono essere integrate con l'Internet of Medical Things (IoMT) per soddisfare gli obiettivi di telemedicina.

Abstract

Questo prototipo di modello di rilevamento prevede lo sviluppo di un chip di rilevamento riutilizzabile, a doppio rivestimento in ossido di grafene (GrO), doppio capacitivo interdigitato (DIDC) per rilevare in modo specifico e rapido il virus del coronavirus 2 della sindrome respiratoria acuta grave (SARS-CoV-2). Il DIDC fabbricato comprende un substrato di vetro contenente Ti/Pt smaltato con ossido di grafene (GrO), che viene ulteriormente modificato chimicamente con EDC-NHS per immobilizzare gli anticorpi (Abs) ostili al SARS-CoV-2 sulla base della proteina spike (S1) del virus. I risultati di indagini approfondite hanno dimostrato che il GrO ha fornito una superficie ingegnerizzata ideale per l'immobilizzazione Ab e ha migliorato la capacità per consentire una maggiore sensibilità e bassi limiti di rilevamento. Questi elementi sintonizzabili hanno contribuito a realizzare un ampio intervallo di rilevamento (da 1,0 mg/mL a 1,0 fg/mL), un limite di rilevamento minimo di 1 fg/mL, un'elevata reattività e una buona linearità di 18,56 nF/g e un tempo di reazione rapido di 3 s. Inoltre, in termini di sviluppo di framework di test point-of-care (POC) finanziariamente sostenibili, la riutilizzabilità del biochip GrO-DIDC in questo studio è buona. Significativamente, il biochip è specifico contro gli antigeni trasmissibili per via ematica ed è stabile fino a 10 giorni a 5 °C. Grazie alla sua compattezza, questo biosensore in scala ridotta ha il potenziale per la diagnostica POC dell'infezione da COVID-19. Questo sistema è in grado di rilevare anche altre gravi malattie virali, sebbene sia in fase di sviluppo una fase di approvazione che utilizza altri esempi di virus.

Introduzione

Alla fine del 2019, alla fine del 2019, nella città di Wuhan, in Cina, è emersa una pandemia virale causata da un nuovo coronavirusbeta 1 (ossia 2019-nCoV), che è stata successivamente denominata sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2)2 (di seguito prevalentemente indicato come virus), che coinvolge un cluster polmonare e un grave distress respiratorio acuto.. A causa della sua rapida trasmissione da uomo a uomo in tutto il mondo, dell'alto tasso di infezione, dell'alto tasso di mortalità e dei gravi effetti avversi potenzialmente letali4, durante la pandemia, la ricerca virologica5 si è evoluta rapidamente per identificare l'organizzazione e la struttura genomica del virus 5,6. I sintomi di COVID-19 7,8 includono febbre alta, tosse secca e dolore generalizzato9. È importante sottolineare che diversi sierotipi del virus portano a diverse gravità della malattia10. Inoltre, i portatori asintomatici possono potenzialmente diffondere il virus. Di solito, al microscopio, le particelle del virus COVID-19 mostrano proiezioni simili a clava formate da proteine spike11. Pertanto, per controllare la diffusione di questo nuovo agente patogeno, l'individuazione dei casi deve essere tempestiva ed efficiente. Pertanto, il rilevamento ultrasensibile, rapido e selettivo del virus nelle prime fasi dell'infezione virale è diventato cruciale 2,11. Il distanziamento sociale/fisico è necessario per evitare la trasmissione12 del virus. Le agenzie sanitarie stanno ponendo l'accento sullo sviluppo di strumenti diagnostici intelligenti e di nanosistemi13. Infatti, come suggerito dalle agenzie sanitarie, i test mirati e di massa14,15 sono richiesti e sono ancora richiesti.

In linea di principio, i metodi di diagnosi biologica in corso come la reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa (RT-PCR) sono i mezzi migliori per l'identificazione di massa di SARS-CoV-2, come nel caso del coronavirus correlato alla sindrome respiratoria mediorientale (MERS-CoV)16 e SARS-CoV-117. In questo contesto, l'attuale identificazione standard della contaminazione da SARS-CoV-2 dipende dal miglioramento delle caratteristiche specifiche dell'infezione18,19. Inoltre, dovrebbe essere presa in considerazione la variazione dell'infezione da SARS-CoV-2 in base all'area, all'età, alla razza e al sesso. Con l'obiettivo finale di salvare vite umane, è fondamentale creare strumenti di diagnosi rapida per l'uso presso il punto di cura (POC)20,21.

In questo contesto, strategie regolari come l'ibridazione in situ a fluorescenza (FISH), l'esame con immunoassorbimento proteico (ELISA), i metodi basati su microsfere, i test elettrochimici e la risonanza magnetica, la PET e il NIRFOI22 hanno una bassa sensibilità ai bassi livelli di virus, bassa selettività e bassa capacità di riutilizzo; Inoltre, tali procedure presentano degli svantaggi, tra cui costosi sistemi diagnostici di biorilevamento, reagenti non riutilizzabili e la necessità di una forza lavoro altamente qualificata23. Pertanto, queste tecniche approfondite non possono essere viste come metodi POC veloci, ragionevoli, eccezionalmente specifici o sensibili24,25. Da notare che esistono diversi tipi di biosensori basati su DNA e immunizzatori che utilizzano tecniche composte, capacitive ed elettriche 18,26,27,28. Ad esempio, i biosensori elettrici del DNA, che hanno un'elevata reattività, possono essere ridimensionati semplicemente e sono sintonizzabili29,30, sono stati prodotti per il rilevamento di Ebola31, Zika, MERS-CoV e SARS-CoV 32,33,34. Allo stesso modo, è stato creato un biosensore a semiconduttore a impatto di campo (FET) per rilevare la proteina spike del virus utilizzando determinati anticorpi (monoclonali) immobilizzati su dispositivi rivestiti di grafene35,36. Tuttavia, questa nuova strategia è meno sensibile della RT-PCR. Inoltre, più recentemente, è stato sviluppato un framework di rilevamento 3D basato su terminali ricoperti di ossido di grafene diminuito (GrO) con nanoparticelle di aerosol per il virus, che ha un basso limite di identificazione (2,8 × 10-15 M); in ogni caso, la complessa struttura del biosensore proposta35 è stata testata per quanto riguarda l'uso del POC e confrontata con altre strategie di biosensori esistenti utilizzate per il rilevamento del virus 35,37,38.

In questo studio, abbiamo progettato e fabbricato un biosensore DIDC basato su GrO in scala ridotta e riutilizzabile per identificare la proteina spike del virus senza le limitazioni descritte sopra per altri biosensori. Questo biosensore consente il rilevamento a livello del femtogramma (fg) entro 3 s 18,27 dal tempo di risposta. Per realizzare questa ricerca, sono stati scelti nanofiocchi di GrO per una migliore reattività e selettività, il che significa che è possibile rilevare basse concentrazioni della proteina dell'antigene virale da tamponi orofaringei o nasofaringei. Il GrO è un materiale appropriato, sinteticamente affidabile, coerente e conduttivo che può essere utilizzato in modo vantaggioso per applicazioni di biorilevamento 2,39,40,41. Inoltre, è stato utilizzato un approccio di ibridazione label-free con anticorpi IgG monoclonali, concentrandosi sulla proteina spike S1 del virus. Il biosensore SARS-CoV-2-GrO-DIDC fabbricato è riutilizzabile dopo un trattamento avanzato e la pulizia con una soluzione piranha. Questo biosensore ultraveloce, sensibile, selettivo, senza etichetta e riutilizzabile può essere utilizzato per il biorilevamento di campioni clinici e per applicazioni sanitarie personalizzate 26,42,43,44.

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Protocollo

1. Pulizia del chip di rilevamento DIDC

  1. All'inizio dell'esperimento, pulire la superficie del chip DIDC26 con una soluzione piranha (H2SO4:H2O2in rapporto 3:1) e posizionarla sulla piastra calda a 80 °C per 15 minuti. Quindi, sciacquare la superficie del sensore con acqua distillata goccia a goccia utilizzando una pipetta per rimuovere completamente i reagenti di pulizia. Per garantire la completa rimozione del reagente, sciacquare la superficie con quattro o cinque gocce di alcol etilico.
    NOTA: Il chip DIDC è stato fabbricato a seguito di un rapporto precedentemente pubblicato26.
  2. Quindi, asciugare la superficie del sensore a temperatura ambiente per la completa rimozione dei reagenti per ottenere una superficie del sensore idrofila. Questo chip può essere utilizzato per l'ulteriore fabbricazione dello strato di ossido di grafene sul chip (passaggio 2).
  3. Coprire i cuscinetti degli elettrodi del chip del sensore puliti con nastro di poliimmide.

2. Fabbricazione del sottile strato di ossido di grafene sul chip di rilevamento DIDC

  1. Posizionare il chip al centro della macchina di rivestimento rotante in posizione orizzontale e aggiungere 4 μl di una soluzione acquosa di ossido di grafene monostrato (GO) disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali) sulla superficie del chip. Quindi, chiudere la camera di centrifuga e far funzionare per 2 minuti a 1.300 giri/min.
  2. Per la ricottura del truciolo di GO fabbricato, tenere il truciolo sulla piastra calda orizzontalmente per 40 minuti a 80 °C.

3. Reticolazione e funzionalizzazione del chip di rilevamento DIDC GO-glazed

  1. Eseguire la reticolazione del cloridrato di N-(3-dimetilamminopropil)-N'-etilcarbodiimmide (EDC) e della NHidrossisuccinimide (NHS) con il chip GO a film sottile.
    1. Aggiungere 4 μL (0,4 M e 0,1 M, rispettivamente) di EDC-NHS (vedi Tabella dei materiali) al chip GO a film sottile per generare la coniugazione covalente di ammina e gruppi carbossilici tramite la formazione di legami ammidici26.

4. Preparazione e immobilizzazione dell'anticorpo sul chip per il rilevamento delle proteine

  1. Per legare il chip GO-DIDC funzionalizzato con l'anticorpo, sciogliere gli anticorpi anti-SARS-CoV-2 disponibili in commercio (riprodotti dalla proteina anti-S1 mAb di coniglio, vedere la Tabella dei materiali) utilizzando il tampone di diluizione (0,01 M PBS contenente lo 0,1% di BSA [albumina sierica bovina] e lo 0,86% di NaCl).
    1. A 1 μg di anticorpo purificato, aggiungere 1 mL di PBS diluito. Quindi, far cadere 4 μL della soluzione anticorpale sul chip GO-DIDC attivato reticolato. Lasciare il chip nella camera chiusa per 2 ore per legare l'Abs sulla superficie del chip funzionalizzata a temperatura ambiente.
      NOTA: La regione Fab degli Abs è solitamente costituita da abbondanti ammine reattive e gruppi carbossilici a causa della sua natura polare26; pertanto, la successiva immobilizzazione specifica porta a un robusto orientamento covalente "tail-on" specifico per gli Ab.
  2. Una volta terminata l'immobilizzazione degli anticorpi sulla superficie del sensore, versare 4 μL di albumina sierica bovina (BSA) sul chip per bloccare i siti non specifici del chip di rilevamento immunocapacitivo. Posizionare il truciolo orizzontalmente nella camera chiusa per 20 minuti a temperatura ambiente.
  3. Lavare il chip di rilevamento immunocapacitivo con acqua deionizzata, quindi continuare l'asciugatura a temperatura ambiente.
    NOTA: Dopo l'essiccazione, l'immunosensore capacitivo basato su DIDC (SARS-CoV-2-Ab-EDC-NHS-GrO-Ti/Pt-SiO2-DIDCs) è pronto per eseguire il rilevamento seriale dell'antigene spike del virus.
  4. Per un ulteriore rilevamento della proteina spike del virus, preparare diverse concentrazioni da 1,0 mg a 1,0 fg per ottenere un ampio limite di rilevamento.

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Risultati

Qui, viene presentato un protocollo per il rilevamento della proteina S1 del virus SARS-CoV-2 utilizzando un chip di rilevamento capacitivo a doppia interdigitazione (DIDC) smaltato di ossido di grafene. La Figura 1 mostra una rappresentazione schematica (fabbricazione con il layout del circuito) del chip di rilevamento capacitivo a doppia intercifra (DIDC) modificato con ossido di grafene, estremamente sensibile e riciclabile. Il processo di fabbricazione g...

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Discussione

Per la realizzazione di un biosensore produttivo basato su chip DIDC, la distribuzione della carica, la conduttività e la costante dielettrica del DIDC sono estremamente importanti. Significativamente, i miglioramenti in questi limiti di rilevamento si riferiscono alla reattanza capacitiva del DIDC 18,26,27. In questo studio, è stato fabbricato un immunosensore capacitivo ostile al virus Abs e...

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Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto in una certa misura dal Programma di ricerca scientifica di base attraverso la National Research Foundation of Korea (NRF) sponsorizzato dal Ministero dell'Istruzione nell'ambito della sovvenzione 2018R1D1A1A09083353 e della sovvenzione 2018R1A6A1A03025242, in parte dalla GCS Group Association Ltd. e dalla Korea Ministry of Environment (MOE) Graduate School ha investito enormi energie nel progetto integrato di prevenzione e controllo dell'inquinamento e in una sovvenzione di ricerca dell'Università di Kwangwoon nel 2022.

E.M. ringrazia il supporto dell'Istituto Nazionale di Imaging Biomedico e Bioingegneria (5T32EB009035).

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Amyloid β1-42 ProteinMerck (Sigma-Aldrich)107761-42-2
anti-SARS-CoV-2 Spike (S1) monoclonal IgG antibody SinoBiological40150-R007
EDC [N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride]Thermo Fisher ScientificA35391
Ethyl alcohol (C2H5OH)Sigma-Aldrich
Hydrogen peroxide (H2O2)
Kapton tapepolyimide tape
NHS (NHydroxysuccinimide, 98+%; C4H5NO3)Thermo Fisher ScientificA39269
PBS
Prostate-specific antigen Sigma-AldrichP3338-25UG
SARS-CoV-2 Spike S1-His recombinant proteinSinoBiological40591-V08H
Single layer Graphene OxideGraphene Supermarket
Spin CoaterHigh Precision Spin Coater (Spin Coating System)ACE-200 
Sulfuric acid (H2SO4)

Riferimenti

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