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  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

El presente protocolo describe la fabricación de prototipos de biodetección de bajo coste basados en nanosistemas útiles para la detección precisa de proteínas virales (a nivel de Fg). Una plataforma de sensores tan pequeña permite aplicaciones en el punto de atención que se pueden integrar con el Internet de las cosas médicas (IoMT) para cumplir con los objetivos de la telemedicina.

Resumen

Este modelo prototipo de detección implica el desarrollo de un chip de detección reutilizable y bipartidista con doble esmalte de óxido de grafeno (GrO) capacitivo (DIDC) para detectar el virus del coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2) de manera específica y rápida. El DIDC fabricado comprende un sustrato de vidrio que contiene Ti/Pt esmaltado con óxido de grafeno (GrO), que se modifica químicamente con EDC-NHS para inmovilizar anticuerpos (Abs) hostiles al SARS-CoV-2 basados en la proteína de pico (S1) del virus. Los resultados de investigaciones perspicaces mostraron que GrO proporcionó una superficie de ingeniería ideal para la inmovilización de Ab y mejoró la capacitancia para permitir una mayor sensibilidad y bajos límites de detección. Estos elementos sintonizables ayudaron a lograr un amplio rango de detección (1,0 mg/mL a 1,0 fg/mL), un límite mínimo de detección de 1 fg/mL, alta capacidad de respuesta y buena linealidad de 18,56 nF/g, y un tiempo de reacción rápido de 3 s. Además, en términos de desarrollo de marcos de pruebas en el punto de atención (POC) financieramente viables, la reutilización del biochip GrO-DIDC en este estudio es buena. Significativamente, el biochip es específico contra antígenos transmitidos por la sangre y es estable hasta 10 días a 5 °C. Debido a su compacidad, este biosensor a escala reducida tiene el potencial de realizar diagnósticos POC de infección por COVID-19. Este sistema también puede detectar otras enfermedades virales graves, aunque se está desarrollando un paso de aprobación que utiliza otros ejemplos de virus.

Introducción

A finales de 2019, se produjo en la ciudad de Wuhan (China) una pandemia viral causada por un nuevo coronavirusbeta 1 (es decir, 2019-nCoV), que posteriormente se denominó coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo grave (SARS-CoV-2)2 (en lo sucesivo denominado predominantemente el virus), que implicó un grupo neumónico y dificultad respiratoria aguda grave3. Debido a su rápida transmisión mundial de persona a persona, su alta tasa de infección, su alta tasa de mortalidad y sus graves efectos adversos potencialmente mortales4, durante la pandemia, la investigación en virología5 evolucionó rápidamente para identificar la organización y estructura genómica del virus 5,6. Los síntomas de la COVID-19 7,8 incluyen fiebre alta, tos seca y dolor generalizado9. Es importante destacar que los diferentes serotipos del virus conducen a diferentes gravedades de la enfermedad10. Además, los portadores asintomáticos pueden propagar el virus. Por lo general, bajo el microscopio, las partículas del virus COVID-19 muestran proyecciones en forma de garrote formadas por proteínas de pico11. Por lo tanto, para controlar la propagación de este nuevo patógeno, la detección de casos debe ser oportuna y eficiente. Así, la detección ultrasensible, rápida y selectiva del virus en las primeras etapas de la infección viral se ha vuelto crucial 2,11. El distanciamiento social/físico es necesario para evitarla transmisión del virus. Los organismos de salud están haciendo hincapié en el desarrollo de herramientas de diagnóstico inteligentes y nanosistemas13. De hecho, como sugieren las agencias de salud, las pruebas dirigidas y masivas14,15 son necesarias y siguen siendo demandadas.

En principio, los métodos de diagnóstico biológico en curso, como la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR), son los mejores medios para la identificación masiva del SARS-CoV-2, al igual que con el coronavirus relacionado con el síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS-CoV)16 y el SARS-CoV-117. En este contexto, la identificación estándar actual de la contaminación por SARS-CoV-2 depende de la mejora de las características específicas de la infección18,19. Además, se debe tener en cuenta la variación de la infección por SARS-CoV-2 según la zona, la edad, la raza y el sexo. Con el objetivo final de salvar vidas, es crucial crear herramientas de diagnóstico rápido para su uso en el punto de atención (POC)20,21.

En este contexto, las estrategias regulares como la hibridación fluorescente in situ (FISH), el examen de inmunoabsorción de proteínas (ELISA), los métodos basados en microesferas, las pruebas electroquímicas y la resonancia magnética, la PET y la NIRFOI22 tienen baja sensibilidad a los niveles bajos del virus, baja selectividad y baja capacidad de reutilización; Además, estos procedimientos tienen desventajas, como los costosos sistemas de diagnóstico por biodetección, los reactivos no reutilizables y la necesidad de una mano de obra altamente cualificada23. Por lo tanto, estas técnicas perspicaces no pueden ser vistas como métodos POC rápidos, razonables, excepcionalmente específicos o sensibles24,25. Cabe destacar que existen diferentes tipos de biosensores basados en ADN e inmunizantes que utilizan técnicas compuestas, capacitivas y eléctricas 18,26,27,28. A modo de ejemplo, se han producido biosensores eléctricos de ADN, que tienen una alta capacidad de respuesta, se pueden reducir fácilmente y son sintonizables29,30, para la detección de Ébola31, Zika, MERS-CoV y SARS-CoV 32,33,34. Del mismo modo, se ha creado eficazmente un biosensor semiconductor de impacto de campo (FET) para detectar la proteína de pico del virus utilizando ciertos anticuerpos (monoclonales) inmovilizados en dispositivos vidriados con grafeno35,36. No obstante, esta nueva estrategia es menos sensible que la RT-PCR. Además, más recientemente, se ha desarrollado un marco de detección 3D basado en terminales cubierto de óxido de grafeno (GrO) en aerosol y con nanopartículas disminuidas en aerosol para el virus, que tiene un límite bajo de identificación (2,8 × 10-15 M); en cualquier caso, la estructura compleja de biosensores propuesta35 ha sido probada con respecto al uso de POC y comparada con otras estrategias de biosensores existentes que se utilizan para la detección del virus 35,37,38.

En este estudio, diseñamos y fabricamos un biosensor DIDC a escala reducida y reutilizable basado en GrO para identificar la proteína de pico del virus sin las limitaciones descritas anteriormente para otros biosensores. Este biosensor permite la detección a nivel de femtogramo (fg) dentro de los 3 s18,27 de tiempo de respuesta. Para llevar a cabo esta investigación, se eligieron nanocopos de GrO por su mejor capacidad de respuesta y selectividad, lo que significa que se pueden detectar bajas concentraciones de la proteína del antígeno del virus en hisopos orofaríngeos o nasofaríngeos. El GrO es un material apropiado, sintéticamente confiable, consistente y conductor que puede utilizarse de manera beneficiosa para aplicaciones de biodetección 2,39,40,41. Además, se utilizó un enfoque de hibridación sin marcadores de anticuerpos monoclonales IgG, centrándose en la proteína S1 de la espícula del virus. El biosensor fabricado para el SARS-CoV-2-GrO-DIDC es reutilizable después de un tratamiento avanzado y una limpieza con solución de piraña. Este biosensor ultrarrápido, sensible, selectivo, sin etiquetas y reutilizable se puede utilizar para la biodetección de muestras clínicas y aplicaciones de atención médica personalizada 26,42,43,44.

Protocolo

1. Limpieza del chip de detección DIDC

  1. Al comienzo del experimento, limpie la superficie del chip DIDC26 con solución de piraña (H2SO4:H2O2en una proporción de 3:1) y colóquela en la placa calefactora a 80 °C durante 15 min. A continuación, enjuague la superficie del sensor con agua destilada gota a gota utilizando una pipeta para eliminar completamente los reactivos de limpieza. Para asegurar la eliminación completa del reactivo, enjuague la superficie con cuatro o cinco gotas de alcohol etílico.
    NOTA: El chip DIDC se fabricó a partir de un informe publicado anteriormente26.
  2. A continuación, seque la superficie del sensor a temperatura ambiente para eliminar por completo los reactivos y obtener una superficie de sensor hidrófila. Este chip se puede utilizar para la fabricación posterior de la capa de óxido de grafeno en el chip (paso 2).
  3. Cubra las almohadillas de electrodos del chip del sensor limpias con cinta de poliimida.

2. Fabricación de la fina capa de óxido de grafeno en el chip de detección DIDC

  1. Coloque la viruta en el centro de la máquina de recubrimiento por rotación en posición horizontal y agregue 4 μL de una solución acuosa de óxido de grafeno (GO) de una sola capa disponible comercialmente (consulte la Tabla de materiales) sobre la superficie de la viruta. A continuación, cierre la cámara de recubrimiento por centrifugado y hágala funcionar durante 2 minutos a 1.300 rpm.
  2. Para el recocido del chip GO fabricado, mantenga el chip en la placa calefactora horizontalmente durante 40 minutos a 80 °C.

3. Reticulación y funcionalización del chip de detección DIDC glaseado GO

  1. Realice la reticulación del clorhidrato de N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida (EDC) y NHydroxysuccinimida (NHS) con el chip GO de película delgada.
    1. Agregue 4 μL (0,4 M y 0,1 M, respectivamente) de EDC-NHS (ver Tabla de Materiales) al chip GO de película delgada para generar la conjugación covalente de grupos amina y carboxílico a través de la formación de enlaces amida26.

4. Preparación e inmovilización de anticuerpos en el chip para la detección de proteínas

  1. Para unir el chip GO-DIDC funcionalizado con el anticuerpo, disuelva los Abs anti-SARS-CoV-2 disponibles comercialmente (reproducidos por la proteína mAb anti-S1 de conejo, consulte la Tabla de materiales) utilizando el tampón de dilución (0,01 M PBS que contiene 0,1% de BSA [albúmina sérica bovina] y 0,86% de NaCl).
    1. A 1 μg de anticuerpo purificado, añadir 1 mL de PBS diluido. A continuación, coloque 4 μL de la solución de anticuerpos en el chip GO-DIDC activado reticulado. Deje el chip en la cámara cerrada durante 2 h para unir el Abs a la superficie funcionalizada del chip a temperatura ambiente.
      NOTA: La región Fab de los Abs suele estar formada por abundantes aminas reactivas y grupos carboxílicos debido a su naturaleza polar26; por lo tanto, la inmovilización específica posterior conduce a una orientación covalente robusta "en cola" Ab-específica.
  2. Una vez realizada la inmovilización de anticuerpos en la superficie del sensor, se colocan 4 μL de albúmina sérica bovina (BSA) en el chip para bloquear los sitios no específicos del chip de detección inmunocapacitivo. Coloque el chip horizontalmente en la cámara cerrada durante 20 minutos a temperatura ambiente.
  3. Lave el chip sensor inmunocapacitivo con agua desionizada y luego continúe secando a temperatura ambiente.
    NOTA: Después del secado, el inmunosensor capacitivo basado en DIDC (SARS-CoV-2-Ab-EDC-NHS-GrO-Ti/Pt-SiO2-DIDCs) está listo para realizar la detección en serie del antígeno de la espícula del virus.
  4. Para una mayor detección de la proteína de pico del virus, prepare diferentes concentraciones de 1,0 mg a 1,0 fg para obtener un límite de detección amplio.

Resultados

Aquí, se presenta un protocolo para detectar la proteína S1 del virus SARS-CoV-2 utilizando un chip de detección capacitivo doble interdigitado (DIDC) glaseado con óxido de grafeno. La Figura 1 muestra una representación esquemática (fabricación con el diseño del circuito) del chip de detección capacitivo de doble interdigitación (DIDC) modificado con óxido de grafeno extremadamente sensible y reciclable. El proceso de fabricación paso a paso det...

Discusión

Para crear un biosensor productivo basado en un chip DIDC, la distribución de carga, la conductividad y la constante dieléctrica del DIDC son extremadamente importantes. Significativamente, las mejoras en estos límites de detección se relacionan con la reactancia capacitiva del DIDC 18,26,27. En este estudio, se fabricó un inmunosensor de capacitancia que es hostil al virus Abs y se funcion...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue respaldado hasta cierto punto por el Programa de Investigación en Ciencias Básicas a través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) patrocinado por el Ministerio de Educación en virtud de la Subvención 2018R1D1A1A09083353 y la Subvención 2018R1A6A1A03025242, en parte por la GCS Group Association Ltd., y por la Escuela de Posgrado del Ministerio de Medio Ambiente de Corea (MOE) que invirtió una gran energía en el Proyecto Integrado de Prevención y Control de la Contaminación y una Beca de Investigación de la Universidad de Kwangwoon en 2022.

E.M. desea agradecer el apoyo del Instituto Nacional de Imágenes Biomédicas y Bioingeniería (5T32EB009035).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Amyloid β1-42 ProteinMerck (Sigma-Aldrich)107761-42-2
anti-SARS-CoV-2 Spike (S1) monoclonal IgG antibody SinoBiological40150-R007
EDC [N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride]Thermo Fisher ScientificA35391
Ethyl alcohol (C2H5OH)Sigma-Aldrich
Hydrogen peroxide (H2O2)
Kapton tapepolyimide tape
NHS (NHydroxysuccinimide, 98+%; C4H5NO3)Thermo Fisher ScientificA39269
PBS
Prostate-specific antigen Sigma-AldrichP3338-25UG
SARS-CoV-2 Spike S1-His recombinant proteinSinoBiological40591-V08H
Single layer Graphene OxideGraphene Supermarket
Spin CoaterHigh Precision Spin Coater (Spin Coating System)ACE-200 
Sulfuric acid (H2SO4)

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