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Dans cet article

  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Le présent protocole décrit la fabrication de prototypes de biodétection à faible coût basés sur des nanosystèmes utiles pour détecter avec précision les protéines virales (au niveau Fg). Une plate-forme de capteur aussi minuscule permet des applications au point d’intervention qui peuvent être intégrées à l’Internet des objets médicaux (IoMT) pour répondre aux objectifs de télémédecine.

Résumé

Ce modèle prototype de détection implique le développement d’une puce de détection capacitive double interdigitée (DIDC) réutilisable et à double vitrage d’oxyde de graphène (GrO) pour détecter spécifiquement et rapidement le virus du coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2). Le DIDC fabriqué comprend un substrat de verre contenant du Ti/Pt vitré avec de l’oxyde de graphène (GrO), qui est ensuite modifié chimiquement avec l’EDC-NHS pour immobiliser les anticorps (Abs) hostiles au SRAS-CoV-2 basés sur la protéine de pointe (S1) du virus. Les résultats d’investigations perspicaces ont montré que GrO offrait une surface d’ingénierie idéale pour l’immobilisation des anticorps et améliorait la capacité pour permettre une sensibilité plus élevée et des limites de détection basses. Ces éléments réglables ont permis d’obtenir une large plage de détection (1,0 mg/mL à 1,0 fg/mL), une limite de détection minimale de 1 fg/mL, une réactivité élevée et une bonne linéarité de 18,56 nF/g, et un temps de réaction rapide de 3 s. De plus, en ce qui concerne le développement de cadres de test au point de service (POC) financièrement viables, la réutilisabilité de la biopuce GrO-DIDC dans cette étude est bonne. De manière significative, la biopuce est spécifique contre les antigènes transmissibles par le sang et est stable jusqu’à 10 jours à 5 °C. En raison de sa compacité, ce biocapteur à échelle réduite a le potentiel de diagnostiquer l’infection par le COVID-19 au point de service. Ce système peut également détecter d’autres maladies virales graves, bien qu’une étape d’approbation utilisant d’autres exemples de virus soit en cours de développement.

Introduction

Une pandémie virale causée par un nouveau coronavirusbêta 1 (c’est-à-dire 2019-nCoV), qui a ensuite été nommé coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2)2 (ci-après principalement appelé le virus), impliquant un cluster pulmonaire et une détresse respiratoire aiguë sévère, est apparue dans la ville de Wuhan, en Chine, à la fin de 20193. En raison de sa transmission interhumaine rapide à l’échelle mondiale, de son taux d’infection élevé, de son taux de mortalité élevé et de ses effets indésirables graves mettant la vie en danger4, pendant la pandémie, la recherche en virologie5 a évolué rapidement pour identifier l’organisation et la structure génomiques du virus 5,6. Les symptômes de la COVID-19 7,8 comprennent une forte fièvre, une toux sèche et une douleur généralisée9. Il est important de noter que les différents sérotypes du virus entraînent des sévérités différentes de la maladie10. De plus, les porteurs asymptomatiques peuvent potentiellement propager le virus. Habituellement, au microscope, les particules du virus COVID-19 montrent des projections en forme de massue formées par les protéines de pointe11. Par conséquent, pour contrôler la propagation de ce nouvel agent pathogène, la détection des cas doit être rapide et efficace. Ainsi, la détection ultra-sensible, rapide et sélective du virus aux premiers stades de l’infection virale est devenue cruciale 2,11. La distanciation sociale/physique est nécessaire pour éviter la transmission12 du virus. Les organismes de santé mettent l’accent sur le développement d’outils de diagnostic intelligents et de nanosystèmes13. En effet, comme le suggèrent les agences de santé, des tests ciblés et de masse14,15 sont nécessaires et sont toujours demandés.

En principe, les méthodes de diagnostic biologique continu telles que la réaction en chaîne par polymérase à transcription inverse (RT-PCR) sont les meilleurs moyens d’identification de masse du SRAS-CoV-2, comme pour le coronavirus lié au syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS-CoV)16 et le SRAS-CoV-117. Dans ce contexte, l’identification standard actuelle de la contamination par le SARS-CoV-2 dépend de l’amélioration des caractéristiques spécifiques à l’infection18,19. De plus, la variation de l’infection par le SRAS-CoV-2 en fonction de la région, de l’âge, de la race et du sexe doit être prise en compte. Dans le but ultime de sauver des vies, il est crucial de créer des outils de diagnostic rapides pour une utilisation sur le lieu d’intervention20,21.

Dans ce contexte, les stratégies habituelles telles que l’hybridation in situ en fluorescence (FISH), l’examen immuno-absorbant des protéines (ELISA), les méthodes basées sur les microsphères, les tests électrochimiques et l’IRM, la TEP et le NIRFOI22 ont une faible sensibilité aux faibles niveaux de virus, une faible sélectivité et une faible capacité de réutilisation ; De plus, ces procédures présentent des inconvénients, notamment des systèmes de diagnostic de biodétection coûteux, des réactifs non réutilisables et la nécessité d’une main-d’œuvre hautement qualifiée23. Par conséquent, ces techniques perspicaces ne peuvent pas être considérées comme des méthodes de POC rapides, raisonnables, exceptionnellement spécifiques ou sensibles24,25. Il convient de noter qu’il existe différents types de biocapteurs basés sur l’ADN et les immunisateurs qui utilisent des techniques composées, capacitives et électriques 18,26,27,28. À titre d’exemple, des biocapteurs d’ADN électriques, qui ont une grande réactivité, peuvent être réduits simplement et sont réglables29,30, ont été produits pour la détection d’Ebola31, de Zika, de MERS-CoV et de SARS-CoV 32,33,34. De même, un biocapteur à semi-conducteur à impact de champ (FET) permettant de détecter la protéine de pointe du virus à l’aide de certains anticorps (monoclonaux) immobilisés sur des dispositifs vitrés au graphène a été efficacement créé35,36. Néanmoins, cette nouvelle stratégie est moins sensible que la RT-PCR. De plus, plus récemment, un cadre de détection 3D du virus recouvert d’oxyde de graphène diminué par des nanoparticules (GrO) a été mis au point, qui a une limite d’identification basse (2,8 × 10-15 M) ; Quoi qu’il en soit, la structure complexe de biocapteursproposée 35 a été testée en ce qui concerne l’utilisation du POC et comparée à d’autres stratégies de biocapteurs existantes utilisées pour la détection du virus 35,37,38.

Dans cette étude, nous avons conçu et fabriqué un biocapteur DIDC à base de GrO réduit et réutilisable pour identifier la protéine de pointe du virus sans les limitations décrites ci-dessus pour d’autres biocapteurs. Ce biocapteur permet une détection au niveau du femtogramme (fg) dans les 3 s18,27 du temps de réponse. Pour mener à bien cette recherche, les nanoflocons GrO ont été choisis pour leur meilleure réactivité et leur sélectivité, ce qui signifie que de faibles concentrations de la protéine de l’antigène du virus provenant d’écouvillons oropharyngés ou nasopharyngés peuvent être détectées. GrO est un matériau approprié, synthétiquement fiable, cohérent et conducteur qui peut être utilisé de manière bénéfique pour les applications de biodétection 2,39,40,41. De plus, une approche d’hybridation sans marquage d’anticorps IgG monoclonaux a été utilisée, en se concentrant sur la protéine S1 de pointe du virus. Le biocapteur SARS-CoV-2-GrO-DIDC fabriqué est réutilisable après un traitement et un nettoyage avancés avec une solution de piranha. Ce biocapteur ultrarapide, sensible, sélectif, sans marquage et réutilisable peut être utilisé pour la biodétection d’échantillons cliniques et les applications de soins de santé personnalisées 26,42,43,44.

Protocole

1. Nettoyage de la puce de détection DIDC

  1. Au début de l’expérience, nettoyez la surface de la puce DIDC26 avec une solution de piranha (H2SO4 :H2O2dans un rapport de 3:1), et placez-la sur la plaque chauffante à 80 °C pendant 15 min. Ensuite, rincez la surface du capteur avec de l’eau distillée goutte à goutte à l’aide d’une pipette pour éliminer complètement les réactifs de nettoyage. Pour assurer l’élimination complète du réactif, rincez la surface avec quatre à cinq gouttes d’alcool éthylique.
    REMARQUE : La puce DIDC a été fabriquée à la suite d’un rapport26 précédemment publié.
  2. Ensuite, séchez la surface de la sonde à température ambiante pour l’élimination complète des réactifs afin d’obtenir une surface de sonde hydrophile. Cette puce peut être utilisée pour la fabrication ultérieure de la couche d’oxyde de graphène sur la puce (étape 2).
  3. Couvrez les électrodes de la puce du capteur avec du ruban adhésif.

2. Fabrication de la fine couche d’oxyde de graphène sur la puce de détection DIDC

  1. Placez la puce au centre de la machine de revêtement par centrifugation en position horizontale et ajoutez 4 μL d’une solution aqueuse d’oxyde de graphène monocouche (GO) disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux) sur la surface de la puce. Ensuite, fermez la chambre d’étanchéification et faites-la fonctionner pendant 2 min à 1 300 tr/min.
  2. Pour le recuit de la puce GO fabriquée, maintenez la puce sur la plaque chauffante horizontalement pendant 40 min à 80 °C.

3. Réticulation et fonctionnalisation de la puce de détection DIDC GO-glazed

  1. Effectuez la réticulation du chlorhydrate de N-(3-diméthylaminopropyl)-N'-éthylcarbodiimide (EDC) et du NHydroxysuccinimide (NHS) avec la puce GO à couche mince.
    1. Ajouter 4 μL (0,4 M et 0,1 M, respectivement) d’EDC-NHS (voir le tableau des matériaux) à la puce GO à couche mince pour générer la conjugaison covalente des groupes amine et carboxyle via la formation de liaisons amide26.

4. Préparation et immobilisation d’anticorps sur la puce pour la détection des protéines

  1. Pour lier la puce GO-DIDC fonctionnalisée à l’anticorps, dissoudre les anticorps anti-SARS-CoV-2 disponibles dans le commerce (reproduits par la protéine anti-S1 mAb de lapin, voir le tableau des matériaux) à l’aide du tampon de dilution (0,01 M PBS contenant 0,1 % de BSA [albumine sérique bovine] et 0,86 % de NaCl).
    1. À 1 μg d’anticorps purifiés, ajoutez 1 mL de PBS dilué. Ensuite, versez 4 μL de la solution d’anticorps sur la puce GO-DIDC activée réticulée. Laissez la puce dans la chambre fermée pendant 2 h pour lier l’Abs sur la surface de la puce fonctionnalisée à température ambiante.
      REMARQUE : La région Fab de l’Abs se compose généralement d’une abondance d’amines réactives et de groupes carboxyliques en raison de sa nature polaire26 ; par conséquent, l’immobilisation spécifique ultérieure conduit à une orientation covalente robuste et spécifique de l’Ab.
  2. Une fois l’immobilisation des anticorps à la surface du capteur terminée, versez 4 μL d’albumine sérique bovine (BSA) sur la puce pour bloquer les sites non spécifiques de la puce de détection immuno-capacitive. Placez la puce horizontalement dans la chambre fermée pendant 20 min à température ambiante.
  3. Lavez la puce de détection immuno-capacitive avec de l’eau DI, puis poursuivez le séchage à température ambiante.
    REMARQUE : Après séchage, l’immunocapteur capacitif basé sur le DIDC (SARS-CoV-2-Ab-EDC-NHS-GrO-Ti/Pt-SiO2-DIDCs) est prêt à effectuer la détection en série de l’antigène de pointe du virus.
  4. Pour une détection plus poussée de la protéine de spicule du virus, préparer différentes concentrations de 1,0 mg à 1,0 fg pour obtenir une large limite de détection.

Résultats

Ici, un protocole est présenté pour détecter la protéine S1 du virus SARS-CoV-2 à l’aide d’une puce de détection capacitive double interdigitée (DIDC) à vitrage d’oxyde de graphène. La figure 1 montre une représentation schématique (fabrication avec la disposition du circuit) de la puce de détection capacitive à double interdigitation modifiée par l’oxyde de graphène (DIDC), extrêmement sensible et recyclable. Le processus de fabricat...

Discussion

Pour fabriquer un biocapteur productif basé sur une puce DIDC, la distribution de charge, la conductivité et la constante diélectrique du DIDC sont extrêmement importantes. De manière significative, les améliorations apportées à ces limites de détection sont liées à la réactance capacitive du DIDC 18,26,27. Dans cette étude, on a fabriqué un immunocapteur capacitif hostile au virus...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu dans une certaine mesure par le programme de recherche en sciences fondamentales par l’intermédiaire de la Fondation nationale de la recherche de Corée (NRF) parrainé par le ministère de l’Éducation dans le cadre de la subvention 2018R1D1A1A09083353 et de la subvention 2018R1A6A1A03025242, un peu par la GCS Group Association Ltd., et par la Graduate School du ministère coréen de l’Environnement (MOE) a investi énormément d’énergie dans le projet intégré de prévention et de contrôle de la pollution et une subvention de recherche de l’Université de Kwangwoon en 2022.

E.M. tient à souligner le soutien de l’Institut national d’imagerie biomédicale et de bio-ingénierie (5T32EB009035).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Amyloid β1-42 ProteinMerck (Sigma-Aldrich)107761-42-2
anti-SARS-CoV-2 Spike (S1) monoclonal IgG antibody SinoBiological40150-R007
EDC [N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride]Thermo Fisher ScientificA35391
Ethyl alcohol (C2H5OH)Sigma-Aldrich
Hydrogen peroxide (H2O2)
Kapton tapepolyimide tape
NHS (NHydroxysuccinimide, 98+%; C4H5NO3)Thermo Fisher ScientificA39269
PBS
Prostate-specific antigen Sigma-AldrichP3338-25UG
SARS-CoV-2 Spike S1-His recombinant proteinSinoBiological40591-V08H
Single layer Graphene OxideGraphene Supermarket
Spin CoaterHigh Precision Spin Coater (Spin Coating System)ACE-200 
Sulfuric acid (H2SO4)

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