Akciğer Kaynaklı Örneklerden Mikrovasküler ve Makrovasküler Endotel Hücre İzolasyonu ve Saflaştırma

Özet

Zor olmasına rağmen, pulmoner endotel hücrelerinin izolasyonu, akciğer iltihabı ile ilgili çalışmalar için gereklidir. Bu protokol, makrovasküler ve mikrovasküler endotel hücrelerinin yüksek verimli, yüksek saflıkta izolasyonu için bir prosedürü tanımlamaktadır.

Özet

Sağlıklı ve hastalıklı doku ve organlardan izole edilen hücrelerin mevcudiyeti, kişiselleştirilmiş tıp yaklaşımları için kilit bir unsurdur. Biyobankalar, biyomedikal araştırmalar için geniş bir birincil ve ölümsüzleştirilmiş hücre koleksiyonu sağlayabilse de, bunlar tüm deneysel ihtiyaçları, özellikle de belirli hastalıklar veya genotiplerle ilgili olanları kapsamaz. Vasküler endotel hücreleri (ECs), immün inflamatuar reaksiyonun anahtar bileşenleridir ve bu nedenle çeşitli hastalıkların patogenezinde merkezi bir rol oynamaktadır. Özellikle, farklı bölgelerden gelen EC'ler farklı biyokimyasal ve fonksiyonel özellikler göstererek, güvenilir deneyler tasarlamak için spesifik EC tiplerinin (yani makrovasküler, mikrovasküler, arteriyel ve venöz) kullanılabilirliğini gerekli kılar. Burada, pulmoner arter ve akciğer parankiminden yüksek verimli, neredeyse saf insan makrovasküler ve mikrovasküler endotel hücreleri elde etmek için basit prosedürler ayrıntılı olarak gösterilmiştir. Bu metodoloji, ticari kaynaklardan bağımsızlık elde etmek ve henüz mevcut olmayan EC fenotiplerini / genotiplerini elde etmek için herhangi bir laboratuvar tarafından nispeten düşük bir maliyetle kolayca çoğaltılabilir.

Giriş

Vasküler endotel, kan damarlarının iç yüzeyini kaplar. Kan pıhtılaşmasının, vasküler tonusun ve immün-inflamatuar yanıtların düzenlenmesinde anahtar rol oynar 1,2,3,4. İnsan örneklerinden izole edilen endotel hücrelerinin (ECs) kültürü araştırma amaçları için gerekli olmasına rağmen, farklı kan damarlarından (arterler, damarlar, kılcal damarlar) gelen EC'lerin spesifik işlevleri olduğu belirtilmelidir. Bunlar, vasküler endotel patofizyolojisi ile ilgili çalışmalarda kolayca bulunabilen ve yaygın olarak kullanılan insan umbilikal ven endotel hücreleri (HUVEC) tarafından tam olarak özetlenemez ^5,6. Örneğin, insan akciğer mikrovasküler endotel hücreleri (HLMVEC'ler), lökosit alımını ve birikimini kontrol ederek akciğer iltihabında anahtar rol oynamaktadır ^4,7. Bu nedenle, akciğer iltihabını yüksek doğrulukla çoğaltmayı amaçlayan deneysel bir ortam, HLMVEC'leri içermelidir. Öte yandan, EC disfonksiyonu çeşitli patolojilerde görülebilir; Bu nedenle, hastadan alınan ECs, hastalığın güvenilir bir in vitro modelini oluşturmak için esastır. Örneğin, kistik fibrozdan (KF) etkilenen kişilerin eksplante akciğerlerinden diseke edilen ECs fragmanlarının pulmoner arterden (HPAEC'ler) izole edilmesi, bu hastalıkta endotel disfonksiyonunun mekanizmalarını ortaya çıkarmamızı sağlamıştır ^8,9.

Bu nedenle, hastalık durumlarında da EC'lerin farklı kaynaklardan / organlardan izolasyonunu optimize etmeyi amaçlayan protokoller, araştırmacılara, özellikle bu araçlar ticari olarak mevcut olmadığında, değerli araştırma araçları sağlamak için gereklidir. HLMVEC ve HPAEC izolasyon protokolleri daha önce 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 olarak bildirilmiştir. Her durumda, akciğer örneklerinin enzimatik sindirimi, geçici seçici ortam ve manyetik boncuklar veya sitometrik tabanlı hücre sıralama kullanılarak saflaştırılan karışık hücre popülasyonları ile sonuçlandı. Bu protokollerin daha fazla optimizasyonu, EC izolasyonundaki iki ana konuyu ele almalıdır: (1) EC replikatif yaşlanmasını en aza indirmek için mümkün olan en erken kültür pasajlarında çözülmesi gereken hücre ve doku kontaminasyonu²⁰; ve (2) birincil EC izolatlarının düşük verimi.

Bu çalışma, HLMVEC'lerin ve HPAEC'lerin yüksek verimli, yüksek saflıkta izolasyonu için yeni bir protokolü açıklamaktadır. Bu prosedür kolayca uygulanabilir ve birkaç adımda neredeyse saf makrovasküler ve mikrovasküler ECs verir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Bu çalışma onaylandı ve protokol, Chieti-Pescara Üniversitesi (#237_2018bis) insan araştırma etik komitesinin yönergelerini izledi. Şekil 1, endotel hücrelerinin pulmoner parankim veya pulmoner arter segmentlerinden (1-3 cm uzunluğunda) pnömotoraks veya lobektomi gibi çeşitli nedenlerle göğüs cerrahisi geçiren tanımlanmamış insan deneklerden (yazılı rıza ile) izolasyonunu göstermektedir. Bu son durumda, cerrahlar ayrıca bir pulmoner arter segmenti topladılar. Özellikle, cerrahlara kansersiz örnekler toplamaları için doğru bir şekilde talimat verildi. Sunulan protokol, mümkün olan en yüksek verimi ve saflığı elde etmek için optimize edilmiştir.

1. Deneysel hazırlık

1. Kollajenaz sulandırma
   1. Kollajenaz tozunu CaCl 2 ve MgCl₂ (PBS−⁻, bakınız Malzeme Tablosu) olmadan fosfat tamponlu salin içinde₂ mg/mL konsantrasyonda çözün ve çözeltiyi 0,22 μm gözenek filtresi kullanarak filtreleyin.
   2. 5 mL alikot hazırlayın ve bunları -20 ° C'de saklayın. Alikotları kullanımdan önce çözün ve 37 ° C'ye ısıtın.
2. Plaka kaplama
   1. Plaka kaplama için, kültür plakasına pipet% 1.5 jelatin çözeltisi veya 50 μg / mL fibronektin (bakınız Malzeme Tablosu) (6 delikli bir plakanın her bir kuyucuğunun yüzeyini kaplamak için 500 μL yeterlidir) ve 37 ° C'de 1 saat boyunca inkübe edin.
   2. Kuluçkadan sonra, fazla jelatini çıkarın ve kuyucukları PBS⁻⁻ ile yıkayın. ^{PBS'yi aspire} edin ve plakanın steril bir başlıkta kurumasını bekleyin.
      NOT: Jelatinin sulandırılması için,% 1.5'lik bir çözelti oluşturmak için tozu suda çözün, daha sonra otoklavlayın ve 4 ° C'de saklayın. % 1.5'teki jelatin, 4 ° C'de sıvı değildir; Bu nedenle, plaka kaplamadan önce ısıtılmalıdır. Alternatif olarak, hücre kültürleri için uygun herhangi bir ticari jelatin çözeltisi plaka kaplaması için kullanılabilir.

2. Numune hazırlama

1. Akciğer parankimleri
   1. Toplanan numuneleri PBS⁻⁻ içeren 50 mL'lik bir tüpe batırarak yıkayın.
   2. Numuneleri steril bir Petri kabına aktarın ve cerrahi makas (optimum boyut: >2 cm) kullanarak numuneyi her biri yaklaşık 3-4 mm'lik küçük parçalar halinde manuel olarak doğrayın.
2. Arter segmenti/segmentleri
   1. Toplanan numuneleri PBS⁻⁻ içeren 50 mL'lik bir tüpe batırarak yıkayın.
   2. Doğrama yapmadan steril bir Petri kabına aktarın, çünkü parçalanma arter segmentinin enine kesitinin yüzey alanını artıracak ve böylece EC olmayanları izole etme olasılığını artıracaktır.

3. Enzimatik sindirim

1. Doğranmış akciğer parankimini veya pulmoner arter segmentini / s'yi PBS⁻⁻ ile iki kez yıkayın. Bu adım, kalan kanın büyük bir bölümünü çıkaracaktır.
2. Numuneleri 15 mL'lik tüplere yerleştirin ve 37 ° C'de 10 dakika boyunca 5 mL tip 2 kollajenaz ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve% 5 CO₂ ile inkübe edin. Bu inkübasyon sırasında, hücre dışı matrisin bozulması tek hücreleri ve hücre agregalarını serbest bırakır.

4. Sindirilmiş hücrelerin geri kazanılması

1. 50 mL'lik bir toplama tüpünün üstüne steril bir çelik/metal süzgeç (yani, ~ 1 mm ağ boyutunda bir çay süzgeci) yerleştirin.
2. Tüm içeriği 15 mL tüpten süzgecin üzerine dökün, sindirilmiş dokuya bir spatula ile hafifçe masaj yapın ve toplama tüpü dolana kadar numuneyi PBS ^ile durulayın.
   NOT: Bu adım, milimetre ölçeğinde büyük doku parçalarını ortadan kaldıracak ve sonraki filtreleme adımlarının daha fazla verimliliğini sağlayacaktır.

5. Filtreleme ile EC olmayan giderim

1. Adım 4.2'de toplanan çıkışı 70 μm ağ boyutunda bir hücre süzgeci kullanarak filtreleyin ve çıkışı yeni bir 50 mL tüpte toplayın.
2. Ardından, 40 μm ağ boyutuna sahip bir hücre süzgeci kullanın ve çıkışı taze bir 50 mL tüpte toplayın. Bu tüpü "tüp 1" olarak etiketleyin.
   NOT: Adım 5.1 ve adım 5.2'deki bu filtrelemeler, genellikle karışık hücre popülasyonlarından oluşan büyük hücre agregalarını kaldıracaktır.

6. Hücre kümelerinin çökelmesi ve hücre tohumlaması

1. Hücre kümelerini çökeltmek için numuneleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 30 x g'de santrifüj edin.
2. Süpernatantı steril bir pipet kullanarak dikkatlice çıkarın (dökmeyin) ve taze bir 50 mL tüpe ("tüp 2") yerleştirin.
3. Peletleri "tüp 1" de askıya alın ve tüpü PBS⁻⁻ ile 50 mL'ye kadar doldurun. 50 mL'ye kadar "tüp 2" yi PBS−⁻ ile doldurun.
   NOT: Bu adımdan itibaren, her iki tüp de aynı şekilde tedavi edilir.
4. Numuneleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj edin.
5. Peletleri 2 mL büyüme ortamı ile askıya alın (bakınız Malzeme Tablosu) ve süspansiyonu önceden kaplanmış 6 delikli bir plakanın iki ayrı kuyucuğuna tohumlayın (adım 1.2).
   NOT: Bu adımdan itibaren, sıralama için makul sayıda hücre elde etmek için hücreleri her 2 günde bir büyüme ortamıyla (numune büyüklüğüne bağlı olarak yaklaşık 1 hafta) birleşime ulaşana kadar besleyin.

7. Hücre genişlemesi

1. Artık kan hücrelerini çıkarmak için hücreleri CaCl 2 ve MgCl 2 (PBS ⁺⁺, Malzeme Tablosuna bakınız) ile₂ mL PBS ile yıkayın (PBS ⁺⁺ kullanmak hücre ayrılmasını önlemek için önemlidir).
2. PBS⁺⁺'ı çıkarın ve taze kültür ortamı ekleyin.
3. Hücreler akıcılığa ulaşana kadar adım 7.1 ve adım 7.2'yi tekrarlayın (örnek boyutuna bağlı olarak yaklaşık 1 hafta).

8. Hücre sıralama

1. 500 μL tripsin-EDTA (% 0.05, bakınız Malzeme Tablosu) kullanarak hücreleri ayırın, santrifüj yapın ve peleti 190 μL PBS−⁻ ile yeniden askıya alın.
2. 10 μL floresan konjuge anti-insan CD31-FITC antikoru ekleyin (1:20 seyreltme, Malzeme Tablosuna bakınız) ve hücre süspansiyonunu 4 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
3. Hücreleri 10 mL PBS−− kullanarak yıkayın, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın ve peletleri 300 μL PBS⁻⁻ içinde tekrar askıya alın.
4. CD31 pozitif (CD31+) hücreleri, 100 μm'lik bir nozul kullanarak floresanla aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) ile izole edin ve toplayın ve bunları bir tüpte toplayın.
   1. Geçit stratejisine göre, önce yan saçılma alanı parametreleri olan SSC-A ve FSC-A'yı kullanarak hücre morfolojisini tanımlayın. Ardından, FSC-Alan/FSC-Yükseklik veya SSC-Alan/SSC-Yükseklik nokta grafiğini kullanarak tek hücreleri seçin, işaretli numunedeki pozitif hücreleri lekesiz kontrol örneğine karşı tanımlayın ve floresan hücreleri toplama tüpü^21'e yönlendirin.
5. Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj edin ve peleti 6 delikli bir plakanın önceden kaplanmış kuyucuklarında tohumlamak için 2 mL büyüme ortamında askıya alın.

9. Sıralama sonrası genişletme

1. Hücre sıralamasından iki gün sonra, şartlandırılmış ortamı taze büyüme ortamı ile değiştirin.
2. Hücre genişlemesi için adım 7.1 ve adım 7.2'yi her 2 günde bir yineleyin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

HLMEC izolasyonu
HLMVEC'lerin izolasyonu sırasındaki asıl sorun, mikroskobik kılcal damarlar stromal dokudan kolayca ayrılamadığı için kirletici hücrelerin varlığıdır. Bu nedenle, izolasyon sürecinin en erken aşamalarında mümkün olan en yüksek saflığa ulaşmak, kültür geçişlerini ve dolayısıyla hücre yaşlanmasını azaltmak için çok önemlidir. Benzer şekilde, optimal bir izolasyon protokolü, saf HLMVEC'lerin mümkün olan en yüksek verimini vermelidir. Bu hedeflere ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Vasküler endotel hücrelerinin insan patofizyolojisinde oynadığı çoklu roller, bu hücreleri in vitro patogenetik ve farmakolojik çalışmalar için vazgeçilmez bir araç haline getirmektedir. Farklı vasküler bölgelerden/organlardan gelen EC'ler kendine özgü özellikler ve işlevler gösterdiğinden, ilgili organdan sağlıklı ve hastalıklı ECs'lerin mevcudiyeti araştırma amaçları için ideal olacaktır. Örneğin, HLMVEC'ler akciğer iltihabı ile ilgili çalışmalar için gereklidir; Bu ned...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% trypsin-EDTA 1X	GIBCO	25300-054	Used to detach cells from the culture plates
Anti CD31 Antibody, clone WM59	Dako	M0823	Used for CD-31 staining in immunocytochemistry. Dilution used: 1:50
Anti vWF Antibody	Thermo Fisher Scientific	MA5-14029	Used for von Willebrand factor staining in immunocytochemistry. Working dilution: 1:100
Autoclavable surgical scissors	Any		Used for chopping specimens
Cell strainers 40 µm	Corning	431750	Used during the second filtration
Cell strainers 70 µm	Corning	431751	Using during the first filtration
Collagenase, Type 2	Worthington	LS004177	Type 2 Collagenase used for enzymatic digestion. Working concentration: 2 mg/mL
Conjugated anti CD31 Antibody	BD Biosciences	555445	Used for cell sorting (1:20 dilution)
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) with  CaCl2 and MgCl2	Sigma-Aldrich	D8662	Used for cell washing before medium change
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) without CaCl2 and MgCl2	Sigma-Aldrich	D8537	Used for washing surgical specimens and cells before trypsinization
Endothelial Cell Growth Medium MV	PromoCell	C-22020	HLMVEC growth medium
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F0895	Fibronectin from human plasma used for plate coating. Working concentration: 50 µg/mL
Gelatin from porcine skin, type A	Sigma-Aldrich	G2500	Used for plate coating
Type A gelatin	Sigma-Aldrich	g-2500	Gelatin from porcine skin used for plate coating. Working concentration: 1.5%