Mikrovaskuläre und makrovaskuläre Endothelzellisolierung und -reinigung aus Lungenproben

Zusammenfassung

Obwohl die Isolierung von pulmonalen Endothelzellen eine Herausforderung darstellt, ist sie für Studien zur Lungenentzündung unerlässlich. Das vorliegende Protokoll beschreibt ein Verfahren zur hochwirksamen, hochreinen Isolierung von makrovaskulären und mikrovaskulären Endothelzellen.

Zusammenfassung

Die Verfügbarkeit von Zellen, die aus gesunden und kranken Geweben und Organen isoliert wurden, stellt ein Schlüsselelement für Ansätze der personalisierten Medizin dar. Obwohl Biobanken eine große Sammlung von primären und immortalisierten Zellen für die biomedizinische Forschung bereitstellen können, decken diese nicht alle experimentellen Bedürfnisse ab, insbesondere nicht solche, die sich auf bestimmte Krankheiten oder Genotypen beziehen. Vaskuläre Endothelzellen (ECs) sind Schlüsselkomponenten der immunen Entzündungsreaktion und spielen daher eine zentrale Rolle in der Pathogenese einer Vielzahl von Erkrankungen. Bemerkenswert ist, dass ECs von verschiedenen Standorten unterschiedliche biochemische und funktionelle Eigenschaften aufweisen, so dass die Verfügbarkeit spezifischer EC-Typen (d. h. makrovaskulär, mikrovaskulär, arteriell und venös) für die Planung zuverlässiger Experimente unerlässlich ist. Hier werden einfache Verfahren zur Gewinnung hochergiebiger, nahezu reiner humaner makrovaskulärer und mikrovaskulärer Endothelzellen aus der Pulmonalarterie und dem Lungenparenchym detailliert dargestellt. Diese Methodik kann von jedem Labor zu relativ geringen Kosten leicht reproduziert werden, um Unabhängigkeit von kommerziellen Quellen zu erreichen und EC-Phänotypen/Genotypen zu erhalten, die noch nicht verfügbar sind.

Einleitung

Das vaskuläre Endothel kleidet die innere Oberfläche der Blutgefäße aus. Es spielt eine Schlüsselrolle bei der Regulierung der Blutgerinnung, des Gefäßtonus und der immuninflammatorischen Reaktionen ^1,2,3,4. Obwohl die Kultivierung von Endothelzellen (ECs), die aus menschlichen Proben isoliert wurden, für Forschungszwecke unerlässlich ist, muss beachtet werden, dass die ECs aus verschiedenen Blutgefäßen (Arterien, Venen, Kapillaren) spezifische Funktionen haben. Diese können von humanen Nabelvenen-Endothelzellen (HUVEC), die leicht verfügbar sind und in Studien zur Pathophysiologie des vaskulären Endothels weit verbreitet sind, nicht vollständig rekapituliert werden ^5,6. So spielen beispielsweise humane mikrovaskuläre Endothelzellen der Lunge (HLMVECs) eine Schlüsselrolle bei Lungenentzündungen, indem sie die Rekrutierung und Akkumulation von Leukozyten kontrollieren ^4,7. Daher sollte ein experimentelles Setting, das darauf abzielt, Lungenentzündungen mit hoher Genauigkeit zu reproduzieren, HLMVECs umfassen. Auf der anderen Seite kann eine EC-Dysfunktion bei mehreren Pathologien beobachtet werden; Daher sind ECs des Patienten von grundlegender Bedeutung, um ein zuverlässiges In-vitro-Modell der Krankheit zu erstellen. So konnten wir beispielsweise durch die Isolierung von EC-Fragmenten aus der Pulmonalarterie (HPAECs), die aus der explantierten Lunge von Mukoviszidose-Patienten (Mukoviszidose) entnommen wurden, Mechanismen der endothelialen Dysfunktion bei dieser Erkrankung aufdecken ^8,9.

Daher sind Protokolle, die darauf abzielen, die Isolierung von ECs aus verschiedenen Quellen/Organen auch in Krankheitsstadien zu optimieren, unerlässlich, um Forschern wertvolle Forschungswerkzeuge zur Verfügung zu stellen, insbesondere wenn diese Werkzeuge nicht kommerziell erhältlich sind. HLMVEC- und HPAEC-Isolationsprotokolle wurden bereits berichtet 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. In allen Fällen führte der enzymatische Aufschluss der Lungenproben zu gemischten Zellpopulationen, die mit Hilfe von Ad-hoc-Selektionsmedien und magnetischer Beads- oder zytometrischer Zellsortierung aufgereinigt wurden. Weitere Optimierungen dieser Protokolle müssen zwei Hauptprobleme bei der EC-Isolierung angehen: (1) Zell- und Gewebekontamination, die zum frühestmöglichen Zeitpunkt behoben werden sollte, um die replikative Seneszenz der EC^{zu minimieren 20}; und (2) die geringe Ausbeute an primären EC-Isolaten.

In dieser Arbeit wird ein neues Protokoll für die hochreine Isolierung von HLMVECs und HPAECs mit hoher Ausbeute und Reinheit beschrieben. Dieses Verfahren ist einfach anwendbar und liefert in wenigen Schritten nahezu reine makrovaskuläre und mikrovaskuläre ECs.

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Protokoll

Diese Studie wurde genehmigt und das Protokoll folgte den Richtlinien der Ethikkommission für Humanforschung der Universität Chieti-Pescara (#237_2018bis). Abbildung 1 zeigt die Isolierung von Endothelzellen aus Segmenten (1-3 cm lang) des Lungenparenchyms oder der Pulmonalarterie von nicht identifizierten menschlichen Probanden (mit schriftlicher Zustimmung), die sich aus verschiedenen Gründen, wie z. B. Pneumothorax oder Lobektomie, einer Thoraxoperation unterziehen. In letzterem Fall entnahmen die Chirurgen auch ein Lungenarteriensegment. Bemerkenswert ist, dass die Chirurgen genau angewiesen wurden, krebsfreie Proben zu entnehmen. Das vorgestellte Protokoll wurde optimiert, um die größtmögliche Ausbeute und Reinheit zu erzielen.

1. Versuchsvorbereitung

1. Kollagenase-Rekonstitution
   1. Kollagenasepulver wird in phosphatgepufferter Kochsalzlösung ohne CaCl 2 und MgCl 2 (PBS⁻⁻, siehe Materialtabelle) bei einer Konzentration von₂ mg/ml gelöst und die Lösung mit einem 0,22 μm Porenfilter filtriert.
   2. Bereiten Sie 5-ml-Aliquots vor und lagern Sie sie bei −20 °C. Die Aliquots vor Gebrauch auftauen und auf 37 °C vorheizen.
2. Plattenbeschichtung
   1. Für die Plattenbeschichtung pipettieren Sie 1,5%ige Gelatinelösung oder 50 μg/ml Fibronektin (siehe Materialtabelle) in die Kulturplatte (500 μl reichen aus, um die Oberfläche jeder Vertiefung einer 6-Well-Platte zu bedecken) und inkubieren Sie sie 1 h lang bei 37 °C.
   2. Entfernen Sie nach der Inkubation die überschüssige Gelatine und waschen Sie die Vertiefungen mit PBS^−−. Saugen Sie das PBS⁻⁻ ab und lassen Sie die Platte in einer sterilen Haube trocknen.
      Anmerkungen: Für die Rekonstitution von Gelatine lösen Sie das Pulver in Wasser auf, um eine 1,5%ige Lösung herzustellen, autoklavieren Sie es dann und lagern Sie es bei 4 °C. Gelatine mit 1,5 % ist bei 4 °C nicht flüssig; Daher muss es vor der Plattenbeschichtung erwärmt werden. Alternativ kann jede handelsübliche Gelatinelösung, die für Zellkulturen geeignet ist, für die Plattenbeschichtung verwendet werden.

2. Probenvorbereitung

1. Lungenparenchym
   1. Waschen Sie die gesammelten Proben, indem Sie sie in ein 50-ml-Röhrchen mit PBS−⁻ tauchen.
   2. Übertragen Sie die Proben in eine sterile Petrischale und zerkleinern Sie die Probe manuell mit einer chirurgischen Schere (optimale Größe: >2 cm) in kleine Fragmente von jeweils ca. 3-4 mm.
2. Arteriensegment(e)
   1. Waschen Sie die gesammelten Proben, indem Sie sie in ein 50-ml-Röhrchen mit PBS−⁻ tauchen.
   2. Übertragen Sie es in eine sterile Petrischale, ohne es zu zerkleinern, da die Fragmentierung die Oberfläche des Querschnitts des Arteriensegments vergrößert und somit die Möglichkeit erhöht, Nicht-ECs zu isolieren.

3. Enzymatische Verdauung

1. Waschen Sie das gewürfelte Lungenparenchym oder das/die Lungenarteriensegment(e) zweimal mit PBS^−−. In diesem Schritt wird ein großer Teil des Restblutes entfernt.
2. Die Proben werden in 15-ml-Röhrchen gegeben und mit 5 ml Kollagenase Typ 2 (siehe Materialtabelle) 10 Minuten lang bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubiert. Während dieser Inkubation werden durch den Abbau der extrazellulären Matrix einzelne Zellen und Zellaggregate freigesetzt.

4. Rückgewinnung der verdauten Zellen

1. Stellen Sie ein steriles Stahl-/Metallsieb (d. h. ein Teesieb mit einer Maschenweite von ~1 mm) auf ein 50-ml-Sammelröhrchen.
2. Gießen Sie den gesamten Inhalt des 15-ml-Röhrchens auf das Sieb, massieren Sie das verdaute Gewebe vorsichtig mit einem Spatel und spülen Sie die Probe mit PBS⁻⁻ ab, bis das Sammelröhrchen gefüllt ist.
   HINWEIS: Dieser Schritt eliminiert große Gewebefragmente im Millimeterbereich, wodurch eine höhere Effizienz der nachfolgenden Filtrationsschritte gewährleistet wird.

5. Nicht-EC-Entfernung durch Filtration

1. Filtern Sie den in Schritt 4.2 gesammelten Abfluss mit einem Zellsieb mit einer Maschenweite von 70 μm und sammeln Sie den Abfluss in einem frischen 50-ml-Röhrchen.
2. Verwenden Sie dann ein Zellsieb mit einer Maschenweite von 40 μm und sammeln Sie den Abfluss in einem frischen 50-ml-Röhrchen. Beschriften Sie diese Röhre als "Röhre 1".
   HINWEIS: Durch diese Filtrationen in Schritt 5.1 und Schritt 5.2 werden großzellige Aggregate entfernt, die häufig aus gemischten Zellpopulationen bestehen.

6. Sedimentation von Zellclustern und Zellaussaat

1. Zentrifugieren Sie die Proben bei 30 x g für 5 min bei Raumtemperatur, um die Zellcluster zu sedimentieren.
2. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer sterilen Pipette (nicht gießen) und legen Sie ihn in ein frisches 50-ml-Röhrchen ("Röhrchen 2").
3. Suspendieren Sie das Pellet in "Röhrchen 1" und füllen Sie das Röhrchen bis zu 50 ml mit PBS⁻⁻. Füllen Sie "Röhrchen 2" bis zu 50 mL mit PBS−⁻.
   Anmerkungen: Ab diesem Schritt werden beide Röhrchen auf die gleiche Weise behandelt.
4. Zentrifugieren Sie die Proben bei 300 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
5. Suspendieren Sie die Pellets mit 2 ml Wachstumsmedium (siehe Materialtabelle) und säen Sie die Suspension in zwei separate Vertiefungen einer vorbeschichteten 6-Well-Platte (Schritt 1.2).
   HINWEIS: Füttern Sie die Zellen ab diesem Schritt alle 2 Tage mit dem Wachstumsmedium, bis sie die Konfluenz erreichen (ca. 1 Woche, abhängig von der Probengröße), um eine angemessene Anzahl von Zellen für die Sortierung zu erhalten.

7. Zellenausdehnung

1. Waschen Sie die Zellen mit 2 ml PBS mit CaCl 2 und MgCl₂ (PBS++, siehe Materialtabelle), um die verbleibenden Blutzellen zu entfernen (die Verwendung von PBS⁺⁺ ist wichtig, um eine Zellablösung zu vermeiden).
2. Entfernen Sie PBS⁺⁺ und fügen Sie frisches Nährmedium hinzu.
3. Wiederholen Sie die Schritte 7.1 und 7.2, bis die Zellen die Konfluenz erreicht haben (ca. 1 Woche, abhängig von der Stichprobengröße).

8. Sortierung der Zellen

1. Die Zellen werden mit 500 μl Trypsin-EDTA (0,05 %, siehe Materialtabelle) abgelöst, zentrifugiert und das Pellet mit 190 μl PBS−⁻ resuspendiert.
2. Fügen Sie 10 μl eines fluoreszierenden konjugierten Anti-Human-CD31-FITC-Antikörpers hinzu (1:20 Verdünnung, siehe Materialtabelle) und inkubieren Sie die Zellsuspension bei 4 °C für 30 min.
3. Waschen Sie die Zellen mit 10 ml PBS−−^, zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 300 x g und resuspendieren Sie das Pellet in 300 μl PBS−⁻.
4. Isolieren und sammeln Sie CD31-positive (CD31+) Zellen durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) mit einer 100-μm-Düse und sammeln Sie sie in einem Röhrchen.
   1. Definieren Sie gemäß der Gating-Strategie zunächst die Zellmorphologie mit den Parametern SSC-A und FSC-A. Wählen Sie dann einzelne Zellen unter Verwendung eines FSC-Area/FSC-Height- oder SSC-Area/SSC-Height-Punktdiagramms aus, definieren Sie die positiven Zellen in der markierten Probe im Vergleich zur ungefärbten Kontrollprobe und leiten Sie die fluoreszierenden Zellen in das Sammelröhrchen²¹.
5. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 300 x g für 5 Minuten bei Raumtemperatur und suspendieren Sie das Pellet in 2 ml Wachstumsmedium zur Aussaat in den vorbeschichteten Vertiefungen einer 6-Well-Platte.

9. Erweiterung der Nachsortierung

1. Ersetzen Sie zwei Tage nach der Zellsortierung das konditionierte Medium durch frisches Wachstumsmedium.
2. Wiederholen Sie Schritt 7.1 und Schritt 7.2 alle 2 Tage, um die Zellen zu erweitern.

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Ergebnisse

HLMEC-Isolation
Das Hauptproblem bei der Isolierung von HLMVECs ist das Vorhandensein kontaminierender Zellen, da die mikroskopisch kleinen Kapillaren nicht leicht vom Stromagewebe getrennt werden können. Daher ist es entscheidend, in den frühesten Phasen des Isolationsprozesses eine möglichst hohe Reinheit zu erreichen, um die Kulturpassagen und damit die Zellalterung zu reduzieren. Ebenso sollte ein optimales Isolationsprotokoll die höchstmögliche Ausbeute an reinen HLMVECs liefern. Um diese Zi...

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Diskussion

Die vielfältigen Rollen, die vaskuläre Endothelzellen in der humanen Pathophysiologie spielen, machen diese Zellen zu einem unverzichtbaren Werkzeug für pathogenetische und pharmakologische In-vitro-Studien . Da ECs aus verschiedenen Gefäßstellen/Organen besondere Merkmale und Funktionen aufweisen, wäre die Verfügbarkeit von gesunden und kranken ECs aus dem interessierenden Organ ideal für Forschungszwecke. Zum Beispiel sind HLMVECs für Studien zu Lungenentzündungen unerlässlich; Daher wird eine Metho...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% trypsin-EDTA 1X	GIBCO	25300-054	Used to detach cells from the culture plates
Anti CD31 Antibody, clone WM59	Dako	M0823	Used for CD-31 staining in immunocytochemistry. Dilution used: 1:50
Anti vWF Antibody	Thermo Fisher Scientific	MA5-14029	Used for von Willebrand factor staining in immunocytochemistry. Working dilution: 1:100
Autoclavable surgical scissors	Any		Used for chopping specimens
Cell strainers 40 µm	Corning	431750	Used during the second filtration
Cell strainers 70 µm	Corning	431751	Using during the first filtration
Collagenase, Type 2	Worthington	LS004177	Type 2 Collagenase used for enzymatic digestion. Working concentration: 2 mg/mL
Conjugated anti CD31 Antibody	BD Biosciences	555445	Used for cell sorting (1:20 dilution)
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) with  CaCl2 and MgCl2	Sigma-Aldrich	D8662	Used for cell washing before medium change
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) without CaCl2 and MgCl2	Sigma-Aldrich	D8537	Used for washing surgical specimens and cells before trypsinization
Endothelial Cell Growth Medium MV	PromoCell	C-22020	HLMVEC growth medium
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F0895	Fibronectin from human plasma used for plate coating. Working concentration: 50 µg/mL
Gelatin from porcine skin, type A	Sigma-Aldrich	G2500	Used for plate coating
Type A gelatin	Sigma-Aldrich	g-2500	Gelatin from porcine skin used for plate coating. Working concentration: 1.5%