Microvascular and Macrovascular Endothelial Cell Isolation and Purification from Lung-Derived Samples(폐 유래 샘플에서 미세혈관 및 대혈관 내피 세포 분리 및 정제)

요약

어렵지만 폐 내피 세포의 분리는 폐 염증 연구에 필수적입니다. 본 프로토콜은 대혈관 및 미세혈관 내피 세포의 고수율, 고순도 단리를 위한 절차를 설명한다.

초록

건강하고 병든 조직 및 기관에서 분리된 세포의 가용성은 개인화된 의학 접근의 핵심 요소입니다. 바이오뱅크는 생물의학 연구를 위한 광범위한 1차 및 불멸화 세포 컬렉션을 제공할 수 있지만, 이러한 것들이 모든 실험 요구, 특히 특정 질병이나 유전자형과 관련된 것들을 충족시키지는 못합니다. 혈관 내피 세포(EC)는 면역 염증 반응의 핵심 구성 요소이므로 다양한 장애의 발병기전에서 중심적인 역할을 합니다. 특히, 서로 다른 부위의 EC는 서로 다른 생화학적 및 기능적 특성을 나타내므로 신뢰할 수 있는 실험을 설계하는 데 특정 EC 유형(즉, 대혈관, 미세혈관, 동맥 및 정맥)의 가용성이 필수적입니다. 여기에서는 폐동맥 및 폐 실질로부터 고수율, 사실상 순수한 인간 대혈관 및 미세혈관 내피 세포를 얻기 위한 간단한 절차가 상세히 설명된다. 이 방법론은 상업적 출처로부터 독립성을 달성하고 아직 사용할 수 없는 EC 표현형/유전자형을 얻기 위해 모든 실험실에서 비교적 저렴한 비용으로 쉽게 재현할 수 있습니다.

서문

혈관 내피는 혈관의 내부 표면을 따라 늘어서 있습니다. 혈액 응고, 혈관 긴장도 및 면역 염증 반응을 조절하는 데 중요한 역할을 합니다 1,2,3,4. 인간 표본에서 분리된 내피 세포(EC)의 배양은 연구 목적에 필수적이지만 다른 혈관(동맥, 정맥, 모세혈관)의 EC는 특정 기능을 가지고 있다는 점에 유의해야 합니다. 이들은 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC)에 의해 완전히 요약 될 수 없으며, 이는 혈관 내피 병태 생리학 ^5,6에 대한 연구에서 쉽게 이용 가능하고 널리 사용된다. 예를 들어, 인간 폐 미세혈관 내피 세포(HLMVEC)는 백혈구 모집 및 축적을 조절하여 폐 염증에 중요한 역할을 합니다 ^4,7. 따라서 높은 충실도로 폐 염증을 재현하는 것을 목표로 하는 실험 환경에는 HLMVEC가 포함되어야 합니다. 반면에 EC 기능 장애는 여러 병리에서 관찰 될 수 있습니다. 따라서 환자의 EC는 질병의 신뢰할 수 있는 시험관 내 모델을 구축하는 데 기본이 됩니다. 예를 들어, 낭포성 섬유증(CF)에 걸린 사람들의 이식된 폐에서 해부된 폐동맥(HPAEC)에서 EC 조각을 분리함으로써 이 질병에서 내피 기능 장애의 메커니즘을 밝힐 수 있었습니다 ^8,9.

따라서 질병 상태에서도 다양한 소스/기관으로부터 EC의 분리를 최적화하는 것을 목표로 하는 프로토콜은 특히 이러한 도구가 상업적으로 이용 가능하지 않은 경우 연구자에게 귀중한 연구 도구를 제공하는 데 필수적입니다. HLMVEC 및 HPAEC 격리 프로토콜은 이전에 보고되었습니다 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. 모든 경우에, 폐 표본의 효소적 소화는 혼합 세포 집단을 초래했으며, 이는 임시 선택적 배지 및 자기 비드 또는 세포 분석 기반 세포 분류를 사용하여 정제되었습니다. 이러한 프로토콜의 추가 최적화는 EC 분리의 두 가지 주요 문제를 해결해야 합니다: (1) EC 복제 노화를 최소화하기 위해 가능한 한 빠른 배양 통로에서 해결되어야 하는 세포 및 조직 오염²⁰; (2) 1차 EC 분리주의 낮은 수율.

이 연구는 HLMVEC 및 HPAEC의 고수율, 고순도 분리를 위한 새로운 프로토콜을 설명합니다. 이 절차는 쉽게 적용할 수 있으며 몇 단계로 거의 순수한 대혈관 및 미세혈관 EC를 제공할 수 있습니다.

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프로토콜

이 연구는 승인되었으며 프로토콜은 키에티-페스카라 대학교(#237_2018bis)의 인간 연구 윤리 위원회의 지침을 따랐습니다. 그림 1은 기흉 또는 폐엽 절제술과 같은 다양한 이유로 흉부 수술을 받는 비식별화된 인간 피험자(서면 동의 하에)로부터 폐 실질 또는 폐동맥의 세그먼트(1-3cm 길이)에서 내피 세포를 분리하는 것을 보여줍니다. 이 후자의 경우 외과의는 폐동맥 부분도 수집했습니다. 특히, 외과의는 암이 없는 샘플을 수집하도록 정확하게 지시받았습니다. 제시된 프로토콜은 가능한 최고의 수율과 순도를 얻기 위해 최적화되었습니다.

1. 실험 준비

1. 콜라게나제 재구성
   1. 콜라게나제 분말을 CaCl 2 및 MgCl₂(PBS^--, 재료 표 참조)가 없는 인산염 완충 식염수에 2mg/mL 농도로 용해하고 0.22μm 공극 필터를 사용하여 용액을 여과합니다.
   2. 5mL 분취량을 준비하고 -20°C에서 보관합니다. 사용하기 전에 분취량을 해동하고 37°C로 예열합니다.
2. 플레이트 코팅
   1. 플레이트 코팅의 경우 1.5% 젤라틴 용액 또는 50μg/mL 피브로넥틴( 재료 표 참조)을 배양 플레이트(500μL는 6웰 플레이트의 각 웰 표면을 덮기에 충분함)에 넣고 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.
   2. 배양 후, 과량의 젤라틴을 제거하고, PBS^로 웰을 세척한다. PBS를 흡인하고 멸균 후드에서 플레이트^를 건조시킵니다.
      참고: 젤라틴 재구성을 위해 분말을 물에 용해시켜 1.5% 용액을 만든 다음 오토클레이브하고 4°C에서 보관합니다. 1.5 %의 젤라틴은 4 °C에서 액체가 아닙니다. 따라서 플레이트 코팅 전에 예열해야 합니다. 대안적으로, 세포 배양에 적합한 임의의 상업적 젤라틴 용액을 플레이트 코팅에 사용할 수 있다.

2. 시료 전처리

1. 폐 실질
   1. 수집된 샘플을 PBS^가 들어 있는 50mL 튜브에 담가 세척합니다.- - .
   2. 샘플을 멸균 페트리 접시에 옮기고 수술 용 가위 (최적 크기 : >2cm)를 사용하여 샘플을 각각 약 3-4mm의 작은 조각으로 수동으로 자릅니다.
2. 동맥 세그먼트
   1. 수집된 샘플을 PBS^가 들어 있는 50mL 튜브에 담가 세척합니다.- - .
   2. 단편화는 동맥 분절의 단면의 표면적을 증가시켜 비 EC를 분리 할 가능성을 증가시키기 때문에 자르지 않고 멸균 된 페트리 접시로 옮깁니다.

3. 효소 소화

1. 깍둑썰기한 폐 실질 또는 폐동맥 분절을 PBS^--로 두 번 세척합니다. 이 단계는 잔류 혈액의 많은 부분을 제거합니다.
2. 샘플을 15 mL 튜브에 넣고, 37°C 및 5%_CO2에서 10분 동안 5 mL의 타입 2 콜라게나제(재료 표 참조)와 함께 인큐베이션한다. 이 배양 동안, 세포 외 기질의 분해는 단일 세포 및 세포 응집체를 방출한다.

4. 소화된 세포의 회복

1. 멸균 강철/금속 여과기(즉, ~1mm 메쉬 크기의 차 여과기)를 50mL 수집 튜브 상단에 놓습니다.
2. 15mL 튜브의 전체 내용물을 여과기에 붓고 주걱으로 소화된 조직을 부드럽게 마사지한 다음 수집 튜브가 채워질 때까지 PBS^-로 샘플을 헹굽니다.
   참고: 이 단계는 밀리미터 단위의 큰 조직 조각을 제거하여 후속 여과 단계의 효율성을 높입니다.

5. 여과에 의한 Non-EC 제거

1. 4.2 단계에서 수집된 유출물을 70 μm 메쉬 크기의 셀 스트레이너를 이용하여 여과하고, 유출물을 새로운 50 mL 튜브에 수집하였다.
2. 그런 다음 메쉬 크기가 40μm인 셀 스트레이너를 사용하여 유출물을 새 50mL 튜브에 수집합니다. 이 튜브에 "튜브 1"이라는 레이블을 붙입니다.
   참고: 5.1단계와 5.2단계의 이러한 여과는 종종 혼합 세포 집단으로 구성된 큰 세포 응집체를 제거합니다.

6. 세포 클러스터의 침전 및 세포 파종

1. 실온에서 5분 동안 30 x g 에서 샘플을 원심분리하여 세포 클러스터를 침전시킵니다.
2. 멸균 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거하고(붓지 마십시오) 새 50mL 튜브("튜브 2")에 넣습니다.
3. 펠릿을 "튜브 1"에 현탁하고 PBS^--로 최대 50mL까지 튜브를 채웁니다. "튜브 2"를 PBS^--로 최대 50mL까지 채웁니다.
   알림: 이 단계부터 두 튜브는 동일한 방식으로 처리됩니다.
4. 샘플을 실온에서 5분 동안 300 x g 로 원심분리합니다.
5. 펠릿을 2mL의 성장 배지로 현탁하고( 재료 표 참조), 미리 코팅된 6웰 플레이트의 두 개의 별도 웰에 현탁액을 시딩합니다(단계 1.2).
   참고: 이 단계부터 정렬을 위한 합리적인 수의 세포를 얻기 위해 밀도에 도달할 때까지(샘플 크기에 따라 약 1주) 성장 배지를 2일마다 세포에 공급합니다.

7. 세포 확장

1. _CaCl2 및_MgCl2(PBS++, 재료 표 참조)가 포함된 PBS 2mL로 세포를 세척하여 잔류 혈액 세포를 제거합니다(PBS⁺⁺를 사용하는 것은 세포 분리를 방지하는 데 중요합니다).
2. PBS⁺⁺를 제거하고 새로운 배양 배지를 추가합니다.
3. 세포가 밀도에 도달할 때까지 7.1단계와 7.2단계를 반복합니다(샘플 크기에 따라 약 1주).

8. 세포 분류

1. 500 μL의 트립신-EDTA(0.05%, 재료 표 참조)를 사용하여 세포를 분리하고, 원심분리하고, 190 μL의 PBS^로 펠릿을 재현탁합니다.
2. 형광 접합체 항-인간 CD31-FITC 항체 10μL(1:20 희석, 표 참조)를 추가하고 세포 현탁액을 4°C에서 30분 동안 배양합니다.
3. 10mL의 PBS-를 사용하여 세포를 세척하고, 실온에서 5분 동안 300 x g에서 원심분리하고, 300μL의 PBS^-에 펠릿을 재현탁합니다.
4. 100μm 노즐을 사용하여 형광 활성화 세포 분류(FACS)로 CD31 양성(CD31+) 세포를 분리 및 수집하고 튜브에 수집합니다.
   1. 게이팅 전략에 따라 먼저 측면 산란 영역 매개변수인 SSC-A 및 FSC-A를 사용하여 세포 형태를 정의합니다. 그런 다음 FSC-Area/FSC-Height 또는 SSC-Area/SSC-Height 도트 플롯을 사용하여 단일 세포를 선택하고, 표시된 샘플의 양성 세포를 염색되지 않은 대조군 샘플과 비교하여 정의하고, 형광 세포를 수집 튜브⁽²¹)로 향하게 합니다.
5. 세포 현탁액을 실온에서 5분 동안 300 x g 에서 원심분리하고, 펠릿을 6-웰 플레이트의 사전 코팅된 웰에 파종하기 위해 성장 배지 2 mL에 현탁시켰다.

9. 사후 분류 확장

1. 세포 분류 2일 후, 조절된 배지를 신선한 성장 배지로 교체한다.
2. 세포 확장을 위해 7.1 단계와 7.2 단계를 2 일마다 반복하십시오.

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결과

HLMEC 격리
HLMVEC를 분리하는 동안 가장 큰 문제는 미세한 모세 혈관이 간질 조직에서 쉽게 분리 될 수 없기 때문에 오염 된 세포의 존재입니다. 따라서 분리 공정의 초기 단계에서 가능한 가장 높은 순도를 달성하는 것은 배양 계대 및 세포 노화를 줄이기 위해 중요합니다. 마찬가지로, 최적의 격리 프로토콜은 순수 HLMVEC의 가능한 가장 높은 수율을 제공해야 합니다. 이러한 목표를 달...

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토론

인간 병태생리학에서 혈관 내피 세포가 수행하는 다양한 역할은 이러한 세포를 체외 병인 및 약리학 연구에 없어서는 안될 도구로 만듭니다. 다른 혈관 부위/기관의 EC는 독특한 특징과 기능을 나타내기 때문에 관심 기관에서 건강하고 병든 EC를 사용할 수 있는 것이 연구 목적에 이상적입니다. 예를 들어, HLMVEC는 폐 염증에 대한 연구에 필수적입니다. 따라서 이러한 세포의 고수율, 고순도 ?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% trypsin-EDTA 1X	GIBCO	25300-054	Used to detach cells from the culture plates
Anti CD31 Antibody, clone WM59	Dako	M0823	Used for CD-31 staining in immunocytochemistry. Dilution used: 1:50
Anti vWF Antibody	Thermo Fisher Scientific	MA5-14029	Used for von Willebrand factor staining in immunocytochemistry. Working dilution: 1:100
Autoclavable surgical scissors	Any		Used for chopping specimens
Cell strainers 40 µm	Corning	431750	Used during the second filtration
Cell strainers 70 µm	Corning	431751	Using during the first filtration
Collagenase, Type 2	Worthington	LS004177	Type 2 Collagenase used for enzymatic digestion. Working concentration: 2 mg/mL
Conjugated anti CD31 Antibody	BD Biosciences	555445	Used for cell sorting (1:20 dilution)
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) with  CaCl2 and MgCl2	Sigma-Aldrich	D8662	Used for cell washing before medium change
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) without CaCl2 and MgCl2	Sigma-Aldrich	D8537	Used for washing surgical specimens and cells before trypsinization
Endothelial Cell Growth Medium MV	PromoCell	C-22020	HLMVEC growth medium
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F0895	Fibronectin from human plasma used for plate coating. Working concentration: 50 µg/mL
Gelatin from porcine skin, type A	Sigma-Aldrich	G2500	Used for plate coating
Type A gelatin	Sigma-Aldrich	g-2500	Gelatin from porcine skin used for plate coating. Working concentration: 1.5%