Выделение и очистка микрососудистых и макрососудистых эндотелиальных клеток из образцов, полученных из легких

Резюме

Несмотря на сложную задачу, выделение эндотелиальных клеток легких имеет важное значение для исследований воспаления легких. В настоящем протоколе описана процедура выделения макрососудистых и микрососудистых эндотелиальных клеток с высоким выходом и высокой чистотой.

Аннотация

Наличие клеток, выделенных из здоровых и больных тканей и органов, представляет собой ключевой элемент для подходов персонализированной медицины. Хотя биобанки могут предоставить широкую коллекцию первичных и иммортализированных клеток для биомедицинских исследований, они не покрывают все экспериментальные потребности, особенно те, которые связаны с конкретными заболеваниями или генотипами. Эндотелиальные клетки сосудов (ЭК) являются ключевыми компонентами иммунной воспалительной реакции и, таким образом, играют центральную роль в патогенезе различных заболеваний. Примечательно, что ЭК из разных сайтов демонстрируют разные биохимические и функциональные свойства, что делает наличие определенных типов ЭК (т. е. макрососудистых, микрососудистых, артериальных и венозных) необходимым для разработки надежных экспериментов. Здесь подробно проиллюстрированы простые процедуры получения высокопродуктивных, практически чистых макрососудистых и микрососудистых эндотелиальных клеток человека из легочной артерии и паренхимы легких. Эта методология может быть легко воспроизведена с относительно низкими затратами любой лабораторией для достижения независимости от коммерческих источников и получения фенотипов/генотипов ЕС, которые еще недоступны.

Введение

Эндотелий сосудов выстилает внутреннюю поверхность кровеносных сосудов. Он играет ключевую роль в регуляции свертываемости крови, сосудистого тонуса и иммунно-воспалительных реакций 1,2,3,4. Хотя культура эндотелиальных клеток (ЭК), выделенных из образцов человека, имеет важное значение для исследовательских целей, следует отметить, что ЭК из разных кровеносных сосудов (артерий, вен, капилляров) выполняют определенные функции. Они не могут быть полностью воспроизведены эндотелиальными клетками пупочной вены человека (HUVEC), которые легко доступны и широко используются в исследованиях патофизиологии эндотелия сосудов ^5,6. Например, микрососудистые эндотелиальные клетки легких человека (HLMVEC) играют ключевую роль в воспалении легких, контролируя рекрутирование и накопление лейкоцитов ^4,7. Таким образом, экспериментальная установка, направленная на воспроизведение воспаления легких с высокой точностью, должна включать HLMVEC. С другой стороны, дисфункция ЭК может наблюдаться при нескольких патологиях; таким образом, ЭК от пациента имеют основополагающее значение для построения надежной модели заболевания in vitro. Например, выделение фрагментов ЭК из легочной артерии (ГПАЭК), рассеченных из эксплантированных легких людей, страдающих муковисцидозом (МВ), позволило выявить механизмы эндотелиальной дисфункции при этом заболевании ^8,9.

Таким образом, протоколы, направленные на оптимизацию выделения ЭК из различных источников/органов, в том числе в болезненных состояниях, необходимы для предоставления исследователям ценных исследовательских инструментов, особенно когда эти инструменты не являются коммерчески доступными. Ранее сообщалось о протоколах изоляции HLMVEC и HPAEC 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Во всех случаях ферментативное переваривание образцов легких приводило к смешанным клеточным популяциям, которые очищали с использованием специальных селективных сред и сортировки клеток на основе магнитных шариков или цитометрических данных. Дальнейшая оптимизация этих протоколов должна быть направлена на решение двух основных проблем при выделении ЕС: (1) загрязнение клеток и тканей, которое должно быть решено при как можно более раннем прохождении культивирования, чтобы свести к минимуму репликативное старение ЭК²⁰; и (2) низкий выход первичных изолятов ЕС.

В этом исследовании описывается новый протокол для выделения высокопроизводительных и высокочистых HLMVEC и HPAEC. Эта процедура может быть легко применима и дает практически чистые макрососудистые и микрососудистые ЭК за несколько шагов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Это исследование было одобрено, и протокол соответствовал рекомендациям комитета по этике исследований на людях Университета Кьети-Пескара (#237_2018bis). На рисунке 1 показано выделение эндотелиальных клеток из сегментов (длиной 1-3 см) легочной паренхимы или легочной артерии у идентифицированных людей (с письменного согласия), перенесших торакальную операцию по различным причинам, таким как пневмоторакс или лобэктомия. В последнем случае хирурги также собрали сегмент легочной артерии. Примечательно, что хирурги были точно проинструктированы собирать образцы без рака. Представленный протокол был оптимизирован для получения максимально возможного выхода и чистоты.

1. Экспериментальная подготовка

1. Восстановление коллагеназы
   1. Растворите порошок коллагеназы в фосфатно-буферном физиологическом растворе без CaCl 2 и MgCl 2 (PBS-, см. Таблицу материалов) в концентрации₂ мг / мл и отфильтруйте раствор с помощью порового фильтра ^0,22 мкм.
   2. Приготовьте аликвоты объемом 5 мл и храните их при температуре -20 °C. Перед использованием разморозьте и разогрейте аликвоты до 37 °C.
2. Покрытие пластин
   1. Для покрытия пластины пипеткой вводят 1,5% раствор желатина или 50 мкг/мл фибронектина (см. Таблицу материалов) в культуральную пластину (500 мкл достаточно, чтобы покрыть поверхность каждой лунки 6-луночной пластины) и инкубируют в течение 1 ч при 37 °C.
   2. После инкубации удалите излишки желатина и промойте лунки PBS⁻-. Аспирируйте PBS⁻⁻ и дайте пластине высохнуть в стерильном колпаке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для восстановления желатина растворите порошок в воде до получения 1,5% раствора, затем автоклавируйте его и храните при температуре 4 ° C. Желатин при 1,5% не является жидким при 4 ° C; Поэтому перед нанесением покрытия на плиту его необходимо прогреть. В качестве альтернативы, для покрытия пластины можно использовать любой коммерческий раствор желатина, подходящий для клеточных культур.

2. Пробоподготовка

1. Паренхима легких
   1. Вымойте собранные образцы, погрузив их в пробирку объемом 50 мл, содержащую PBS^-.
   2. Переложите образцы в стерильную чашку Петри и вручную измельчите образец хирургическими ножницами (оптимальный размер: >2 см) на мелкие фрагменты размером около 3-4 мм каждый.
2. Сегмент(ы) артерии
   1. Вымойте собранные образцы, погрузив их в пробирку объемом 50 мл, содержащую PBS^-.
   2. Перенесите его в стерильную чашку Петри, не измельчая, так как фрагментация увеличит площадь поверхности поперечного сечения сегмента артерии, тем самым увеличивая возможность выделения не-EC.

3. Ферментативное пищеварение

1. Дважды промойте нарезанную кубиками паренхиму легких или сегмент (сегменты) легочной артерии с помощью PBS^-. Этот шаг удалит большую часть остаточной крови.
2. Поместите образцы в пробирки объемом 15 мл и инкубируйте с 5 мл коллагеназы типа 2 (см. Таблицу материалов) в течение 10 мин при 37 ° C и 5% CO₂. Во время этой инкубации деградация внеклеточного матрикса высвобождает отдельные клетки и клеточные агрегаты.

4. Восстановление переваренных клеток

1. Поместите стерильное ситечко из стали/металла (т. е. ситечко для чая с размером ячеек ~ 1 мм) в верхнюю часть пробирки для сбора объемом 50 мл.
2. Вылейте все содержимое из пробирки объемом 15 мл на ситечко, аккуратно помассируйте переваренную ткань шпателем и промойте образец PBS^-− до тех пор, пока пробирка для сбора не будет заполнена.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг устранит крупные фрагменты тканей в миллиметровом масштабе, обеспечивая большую эффективность последующих этапов фильтрации.

5. Удаление без EC путем фильтрации

1. Отфильтруйте отток, собранный на шаге 4.2, с помощью клеточного сетчатого фильтра с размером ячеек 70 мкм и соберите отток в свежую пробирку объемом 50 мл.
2. Затем используйте клеточный фильтр с размером ячеек 40 мкм и соберите отток в свежую пробирку объемом 50 мл. Пометьте эту трубку как «трубка 1».
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эти фильтрации на шагах 5.1 и 5.2 удаляют крупные клеточные агрегаты, которые часто состоят из смешанных клеточных популяций.

6. Седиментация клеточных кластеров и засев клеток

1. Центрифугируют образцы при 30 x g в течение 5 мин при комнатной температуре, чтобы осаждать кластеры клеток.
2. Осторожно извлеките надосадочную жидкость с помощью стерильной пипетки (не наливайте) и поместите ее в свежую пробирку объемом 50 мл («пробирка 2»).
3. Суспендируйте гранулы в «пробирке 1» и заполните пробирку до 50 мл PBS^-−. Заполните «пробирку 2» до 50 мл PBS⁻.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с этого этапа, обе трубки обрабатываются одинаково.
4. Центрифугируют образцы при 300 x g в течение 5 мин при комнатной температуре.
5. Суспендируйте гранулы с 2 мл питательной среды (см. Таблицу материалов) и засейте суспензию в две отдельные лунки предварительно покрытой 6-луночной пластины (шаг 1.2).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с этого этапа, кормите клетки питательной средой каждые 2 дня до тех пор, пока они не достигнут слияния (примерно 1 неделя, в зависимости от размера выборки), чтобы получить разумное количество клеток для сортировки.

7. Расширение ячеек

1. Промойте клетки 2 мл PBS с CaCl 2 и MgCl₂ (PBS++, см. Таблицу материалов), чтобы удалить остаточные клетки крови (использование PBS⁺⁺ важно для предотвращения отслоения клеток).
2. Удалите PBS⁺⁺ и добавьте свежую питательную среду.
3. Повторяйте шаги 7.1 и 7.2 до тех пор, пока ячейки не достигнут слияния (примерно 1 неделя, в зависимости от размера выборки).

8. Сортировка ячеек

1. Отделите клетки, используя 500 мкл трипсина-ЭДТА (0,05%, см. Таблицу материалов), центрифугу и ресуспендируйте гранулу 190 мкл PBS^-.
2. Добавьте 10 мкл флуоресцентного конъюгированного антитела CD31-FITC против человека (разведение 1:20, см. Таблицу материалов) и инкубируйте клеточную суспензию при 4 ° C в течение 30 мин.
3. Промойте клетки, используя 10 мл PBS-^, центрифугу при 300 x g в течение 5 мин при комнатной температуре и ресуспендируйте гранулу в 300 мкл PBS^-.
4. Изолируйте и собирайте CD31-положительные (CD31+) клетки с помощью флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS) с помощью сопла 100 мкм и собирайте их в пробирку.
   1. В соответствии со стратегией стробирования сначала определите морфологию клеток, используя параметры площади бокового рассеяния, SSC-A и FSC-A. Затем выберите отдельные ячейки, используя точечную диаграмму FSC-Area/FSC-Height или SSC-Area/SSC-Height, определите положительные ячейки в отмеченном образце по сравнению с неокрашенным контрольным образцом и направьте флуоресцентные ячейки в сборную пробирку²¹.
5. Центрифугируют клеточную суспензию при 300 х г в течение 5 мин при комнатной температуре и суспендируют гранулу в 2 мл питательной среды для посева в предварительно покрытые лунки 6-луночной пластины.

9. Расширение постсортировки

1. Через два дня после сортировки клеток замените кондиционированную среду свежей питательной средой.
2. Повторяйте шаги 7.1 и 7.2 каждые 2 дня для расширения клеток.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Изоляция HLMEC
Основной проблемой при выделении HLMVEC является наличие загрязняющих клеток, поскольку микроскопические капилляры не могут быть легко отделены от стромальной ткани. Таким образом, достижение максимально возможной чистоты на самых ранних стадиях процесса выделе?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Многочисленные роли, которые играют сосудистые эндотелиальные клетки в патофизиологии человека, делают эти клетки незаменимым инструментом для патогенетических и фармакологических исследований in vitro . Поскольку ЭК из разных сосудистых участков/органов проявляют специфические ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% trypsin-EDTA 1X	GIBCO	25300-054	Used to detach cells from the culture plates
Anti CD31 Antibody, clone WM59	Dako	M0823	Used for CD-31 staining in immunocytochemistry. Dilution used: 1:50
Anti vWF Antibody	Thermo Fisher Scientific	MA5-14029	Used for von Willebrand factor staining in immunocytochemistry. Working dilution: 1:100
Autoclavable surgical scissors	Any		Used for chopping specimens
Cell strainers 40 µm	Corning	431750	Used during the second filtration
Cell strainers 70 µm	Corning	431751	Using during the first filtration
Collagenase, Type 2	Worthington	LS004177	Type 2 Collagenase used for enzymatic digestion. Working concentration: 2 mg/mL
Conjugated anti CD31 Antibody	BD Biosciences	555445	Used for cell sorting (1:20 dilution)
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) with  CaCl2 and MgCl2	Sigma-Aldrich	D8662	Used for cell washing before medium change
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) without CaCl2 and MgCl2	Sigma-Aldrich	D8537	Used for washing surgical specimens and cells before trypsinization
Endothelial Cell Growth Medium MV	PromoCell	C-22020	HLMVEC growth medium
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F0895	Fibronectin from human plasma used for plate coating. Working concentration: 50 µg/mL
Gelatin from porcine skin, type A	Sigma-Aldrich	G2500	Used for plate coating
Type A gelatin	Sigma-Aldrich	g-2500	Gelatin from porcine skin used for plate coating. Working concentration: 1.5%