Isolamento e Purificação de Células Endoteliais Microvasculares e Macrovasculares a partir de Amostras Derivadas de Pulmão

Resumo

Apesar de desafiador, o isolamento das células endoteliais pulmonares é essencial para estudos sobre inflamação pulmonar. O presente protocolo descreve um procedimento para o isolamento de alto rendimento e pureza de células endoteliais macrovasculares e microvasculares.

Resumo

A disponibilidade de células isoladas de tecidos e órgãos saudáveis e doentes representa um elemento-chave para abordagens de medicina personalizada. Embora os biobancos possam fornecer uma ampla coleção de células primárias e imortalizadas para pesquisa biomédica, estes não cobrem todas as necessidades experimentais, particularmente aquelas relacionadas a doenças ou genótipos específicos. As células endoteliais vasculares (CEs) são componentes-chave da reação inflamatória imune e, portanto, desempenham um papel central na patogênese de uma variedade de doenças. Notavelmente, CE de diferentes sítios exibem diferentes propriedades bioquímicas e funcionais, tornando a disponibilidade de tipos específicos de CE (isto é, macrovascular, microvascular, arterial e venosa) essencial para o planejamento de experimentos confiáveis. Aqui, procedimentos simples para a obtenção de células endoteliais macrovasculares e microvasculares humanas de alto rendimento, virtualmente puras, da artéria pulmonar e do parênquima pulmonar são ilustrados em detalhes. Esta metodologia pode ser facilmente reproduzida a um custo relativamente baixo por qualquer laboratório para alcançar independência de fontes comerciais e obter fenótipos/genótipos CE que ainda não estão disponíveis.

Introdução

O endotélio vascular reveste a superfície interna dos vasos sanguíneos. Desempenha papéis fundamentais na regulação da coagulação sanguínea, do tônus vascular e da resposta imune-inflamatória 1,2,3,4. Embora a cultura de células endoteliais (CEs) isoladas de espécimes humanos seja essencial para fins de pesquisa, deve-se ressaltar que as CE de diferentes vasos sanguíneos (artérias, veias, capilares) têm funções específicas. Estas não podem ser totalmente recapituladas pelas células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC), que são facilmente disponíveis e amplamente utilizadas em estudos sobre a fisiopatologia do endotélio^vascular5,6. Por exemplo, as células endoteliais microvasculares pulmonares humanas (HLMVECs) desempenham papéis fundamentais na inflamação pulmonar, controlando o recrutamento e o acúmulo de leucócitos ^4,7. Assim, um cenário experimental que vise reproduzir a inflamação pulmonar com alta fidelidade deve incluir os HLMVECs. Por outro lado, a disfunção do CE pode ser observada em diversas patologias; portanto, as CE do paciente são fundamentais para a construção de um modelo in vitro confiável da doença. Por exemplo, o isolamento de fragmentos de CE da artéria pulmonar (CEAP), dissecados dos pulmões explantados de pessoas acometidas pela fibrose cística (FC), permitiu desvendar mecanismos de disfunção endotelial nessa doença ^8,9.

Assim, protocolos que visem otimizar o isolamento de CEs de diferentes fontes/órgãos também em estados patológicos são essenciais para fornecer aos investigadores ferramentas valiosas de pesquisa, particularmente quando essas ferramentas não estão disponíveis comercialmente. Protocolos de isolamento de HLMVEC e HPAEC foram previamente relatados 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Em todos os casos, a digestão enzimática dos espécimes pulmonares resultou em populações de células mistas, que foram purificadas usando meios seletivos ad hoc e classificação celular baseada em esferas magnéticas ou citométricas. Otimizações adicionais desses protocolos devem abordar duas questões principais no isolamento da CE: (1) contaminação celular e tecidual, que deve ser resolvida o mais cedo possível para minimizar a senescência replicativa da CE²⁰; e (2) o baixo rendimento de isolados primários de CE.

Este estudo descreve um novo protocolo para o isolamento de alto rendimento e alta pureza de HLMVECs e HPAECs. Este procedimento pode ser facilmente aplicável e fornecer CE macrovascular e microvascular virtualmente puras em poucos passos.

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Protocolo

Este estudo foi aprovado e o protocolo seguiu as diretrizes do comitê de ética em pesquisa com seres humanos da Universidade de Chieti-Pescara (#237_2018bis). A Figura 1 ilustra o isolamento de células endoteliais de segmentos (1-3 cm de comprimento) de parênquima pulmonar ou artéria pulmonar de indivíduos humanos não identificados (com consentimento por escrito) submetidos à cirurgia torácica por vários motivos, como pneumotórax ou lobectomia. Neste último caso, os cirurgiões também coletaram um segmento de artéria pulmonar. Notavelmente, os cirurgiões foram instruídos com precisão para coletar amostras livres de câncer. O protocolo apresentado foi otimizado para obter o maior rendimento e pureza possíveis.

1. Preparação experimental

1. Reconstituição da colagenase
   1. Dissolver a colagenase em pó em solução salina tamponada com fosfato sem CaCl 2 e MgCl 2 (PBS⁻⁻, ver Tabela de Materiais) na concentração de₂ mg/mL e filtrar a solução usando um filtro de poros de 0,22 μm.
   2. Preparar alíquotas de 5 ml e armazená-las a -20 °C. Descongelar e pré-aquecer as alíquotas a 37 °C antes da utilização.
2. Revestimento de chapas
   1. Para revestimento de placas, pipetar solução de gelatina a 1,5% ou fibronectina de 50 μg/mL (ver Tabela de Materiais) para a placa de cultura (500 μL é suficiente para cobrir a superfície de cada poço de uma placa de 6 poços) e incubar por 1 h a 37 °C.
   2. Após a incubação, retire o excesso de gelatina e lave os poços com PBS−⁻. Aspirar o PBS−⁻ e deixar a placa secar em uma capa estéril.
      NOTA: Para a reconstituição da gelatina, dissolver o pó em água para fazer uma solução a 1,5%, depois autoclavá-lo e armazenar a 4 °C. A gelatina a 1,5% não é líquida a 4 °C; portanto, deve ser aquecido antes do revestimento da placa. Alternativamente, qualquer solução de gelatina comercial adequada para culturas de células pode ser usada para o revestimento da placa.

2. Preparo da amostra

1. Parênquima pulmonar
   1. Lave as amostras coletadas imergindo-as em um tubo de 50 mL contendo PBS−⁻.
   2. Transfira as amostras para uma placa de Petri estéril e pique manualmente a amostra com uma tesoura cirúrgica (tamanho ideal: >2 cm) em pequenos fragmentos de cerca de 3-4 mm cada.
2. Segmento(s) arterial(is)
   1. Lave as amostras coletadas imergindo-as em um tubo de 50 mL contendo PBS−⁻.
   2. Transfira para uma placa de Petri estéril sem picar, pois a fragmentação aumentará a área de superfície do corte transversal do segmento arterial, aumentando a possibilidade de isolamento de não-CE.

3. Digestão enzimática

1. Lave o parênquima pulmonar cortado em cubos ou o(s) segmento(s) da artéria pulmonar duas vezes com PBS−⁻. Esta etapa removerá uma grande parte do sangue residual.
2. Colocar as amostras em tubos de 15 ml e incubar com 5 ml de colagenase tipo 2 (ver Tabela de Materiais) durante 10 minutos a 37 °C e 5% de CO₂. Durante essa incubação, a degradação da matriz extracelular libera células únicas e agregados celulares.

4. Recuperação das células digeridas

1. Coloque um filtro estéril de aço/metal (ou seja, um filtro de chá com um tamanho de malha de ~1 mm) na parte superior de um tubo de coleta de 50 mL.
2. Despeje todo o conteúdo do tubo de 15 mL no filtro, massageie suavemente o tecido digerido com uma espátula e lave a amostra com PBS−⁻ até que o tubo de coleta esteja cheio.
   NOTA: Esta etapa eliminará grandes fragmentos de tecido na escala milimétrica, garantindo maior eficiência das etapas subsequentes de filtração.

5. Remoção não-CE por filtração

1. Filtrar o fluxo de saída coletado na etapa 4.2 usando um filtro de células com malha de 70 μm e coletar o fluxo de saída em um tubo fresco de 50 mL.
2. Em seguida, use um filtro celular com malha de 40 μm e colete a saída em um tubo fresco de 50 mL. Rotule este tubo como "tubo 1".
   NOTA: Essas filtrações na etapa 5.1 e na etapa 5.2 removerão grandes agregados celulares, que geralmente são compostos por populações de células mistas.

6. Sedimentação de aglomerados celulares e semeadura celular

1. Centrifugar as amostras a 30 x g durante 5 min à temperatura ambiente para sedimentar os aglomerados celulares.
2. Retire cuidadosamente o sobrenadante usando uma pipeta estéril (não despeje) e coloque-o em um tubo fresco de 50 mL ("tubo 2").
3. Suspender o pellet no "tubo 1" e encher o tubo até 50 mL com PBS−⁻. Encher o "tubo 2" até 50 mL com PBS−⁻.
   NOTA: A partir desta etapa, ambos os tubos são tratados da mesma forma.
4. Centrifugar as amostras a 300 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
5. Suspender os pellets com 2 ml de meio de crescimento (ver Tabela de Materiais) e semear a suspensão em dois poços separados de uma placa pré-revestida de 6 poços (passo 1.2).
   NOTA: A partir desta etapa, alimentar as células a cada 2 dias com o meio de crescimento até que atinjam a confluência (aproximadamente 1 semana, dependendo do tamanho da amostra), a fim de obter um número razoável de células para triagem.

7. Expansão celular

1. Lave as células com 2 mL de PBS com CaCl 2 e MgCl₂ (PBS++, ver Tabela de Materiais) para remover as células sanguíneas residuais (o uso de PBS⁺⁺ é importante para evitar o descolamento celular).
2. Remova o PBS⁺⁺ e adicione o meio de cultura fresco.
3. Repetir as etapas 7.1 e 7.2 até que as células atinjam a confluência (aproximadamente 1 semana, dependendo do tamanho da amostra).

8. Classificação de células

1. Separar as células usando 500 μL de tripsina-EDTA (0,05%, ver Tabela de Materiais), centrifugar e ressuspender o pellet com 190 μL de PBS−⁻.
2. Adicionar 10 μL de um anticorpo anti-humano CD31-FITC conjugado fluorescente (diluição 1:20, ver Tabela de Materiais) e incubar a suspensão celular a 4 °C durante 30 minutos.
3. Lavar as células usando 10 mL de PBS−−, centrifugar a 300 x g por 5 min à temperatura ambiente e ressuspender o pellet em 300 μL de PBS−⁻.
4. Isolar e coletar células CD31 positivas (CD31+) por triagem celular ativada por fluorescência (FACS), usando um bico de 100 μm, e coletá-las em um tubo.
   1. De acordo com a estratégia de gating, primeiro defina a morfologia celular usando os parâmetros de área de espalhamento lateral, SSC-A e FSC-A. Em seguida, selecione células únicas usando um gráfico de pontos FSC-Área/FSC-Altura ou SSC-Área/SSC-Altura, defina as células positivas na amostra marcada versus a amostra controle não corada e direcione as células fluorescentes para o tubo de coleta²¹.
5. Centrifugar a suspensão celular a 300 x g por 5 min à temperatura ambiente e suspender o pellet em 2 mL de meio de cultura para semeadura nos poços pré-revestidos de placa de 6 poços.

9. Expansão pós-triagem

1. Dois dias após a triagem celular, substituir o meio condicionado por meio de crescimento fresco.
2. Repita as etapas 7.1 e 7.2 a cada 2 dias para expansão celular.

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Resultados

Isolamento HLMEC
O principal problema durante o isolamento dos HLMVECs é a presença de células contaminantes, uma vez que os capilares microscópicos não podem ser facilmente separados do tecido estromal. Portanto, alcançar a maior pureza possível nos estágios iniciais do processo de isolamento é crucial para reduzir as passagens de cultura e, assim, o envelhecimento celular. Da mesma forma, um protocolo de isolamento ótimo deve fornecer o maior rendimento possível de HLMVECs puros. Para ati...

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Discussão

Os múltiplos papéis desempenhados pelas células endoteliais vasculares na fisiopatologia humana fazem dessas células uma ferramenta indispensável para estudos patogênicos e farmacológicos in vitro . Uma vez que CEs de diferentes sítios/órgãos vasculares apresentam características e funções peculiares, a disponibilidade de CE saudáveis e doentes do órgão de interesse seria ideal para fins de pesquisa. Por exemplo, os HLMVECs são essenciais para estudos sobre inflamação pulmonar; Portanto, uma m...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% trypsin-EDTA 1X	GIBCO	25300-054	Used to detach cells from the culture plates
Anti CD31 Antibody, clone WM59	Dako	M0823	Used for CD-31 staining in immunocytochemistry. Dilution used: 1:50
Anti vWF Antibody	Thermo Fisher Scientific	MA5-14029	Used for von Willebrand factor staining in immunocytochemistry. Working dilution: 1:100
Autoclavable surgical scissors	Any		Used for chopping specimens
Cell strainers 40 µm	Corning	431750	Used during the second filtration
Cell strainers 70 µm	Corning	431751	Using during the first filtration
Collagenase, Type 2	Worthington	LS004177	Type 2 Collagenase used for enzymatic digestion. Working concentration: 2 mg/mL
Conjugated anti CD31 Antibody	BD Biosciences	555445	Used for cell sorting (1:20 dilution)
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) with  CaCl2 and MgCl2	Sigma-Aldrich	D8662	Used for cell washing before medium change
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) without CaCl2 and MgCl2	Sigma-Aldrich	D8537	Used for washing surgical specimens and cells before trypsinization
Endothelial Cell Growth Medium MV	PromoCell	C-22020	HLMVEC growth medium
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F0895	Fibronectin from human plasma used for plate coating. Working concentration: 50 µg/mL
Gelatin from porcine skin, type A	Sigma-Aldrich	G2500	Used for plate coating
Type A gelatin	Sigma-Aldrich	g-2500	Gelatin from porcine skin used for plate coating. Working concentration: 1.5%