İnsan Yenidoğan Bağırsak Enteroidlerini ve Disbiyotik Mikrobiyomu İçeren Nekrotizan Enterokolitin Mikroakışkan Modeli

Özet

Bu protokol, hastalık patogenezine yönelik mekanik çalışmalar için kullanılabilen bir in vitro nekrotizan enterokolit (NEC) modelini açıklar. İnsan yenidoğan bağırsağından, endotel hücrelerinden ve şiddetli NEC'li bir yenidoğanın bağırsak mikrobiyomundan türetilen bağırsak enteroidleri ile tohumlanmış bir mikroakışkan çipe sahiptir.

Özet

Nekrotizan enterokolit (NEK), tam olarak anlaşılamamış, karmaşık patogenezi nedeniyle araştırılması zor olan ciddi ve potansiyel olarak ölümcül bir bağırsak hastalığıdır. NEC'in patofizyolojisi, bağırsak sıkı bağlantılarının bozulmasını, artmış bağırsak bariyeri geçirgenliğini, epitel hücre ölümünü, mikrobiyal disbiyozisis ve düzensiz inflamasyonu içerir. NEC'yi incelemek için kullanılan geleneksel araçlar arasında hayvan modelleri, hücre dizileri ve insan veya fare bağırsak organoidleri bulunur. Bu model sistemlerini kullanan çalışmalar, alanın hastalık patofizyolojisi anlayışını geliştirmiş olsa da, insan NEC'nin karmaşıklığını özetleme yetenekleri sınırlıdır. NEC-on-a-chip adı verilen mikroakışkan teknolojisini kullanan geliştirilmiş bir in vitro NEC modeli geliştirilmiştir. Çip üzerinde NEC modeli, preterm bir yenidoğandan türetilen bağırsak enteroidleri ile tohumlanmış, insan endotel hücreleri ve şiddetli NEC'li bir bebekten alınan mikrobiyom ile birlikte kültürlenmiş bir mikroakışkan cihazdan oluşur. Bu model, NEC'nin patofizyolojisine yönelik mekanik çalışmalar için değerli bir araçtır ve yenidoğan bağırsak hastalıkları için ilaç keşif testi için yeni bir kaynaktır. Bu yazıda, NEC-on-a-chip modelinin ayrıntılı bir açıklaması sağlanacaktır.

Giriş

Nekrotizan enterokolit (NEC), 1500 g'< doğanlarda %10'a varan insidansla erken doğmuş bebekleri etkiler¹. NEC'in patofizyolojisi karmaşıktır ve bağırsak epitelinde hasar, bağırsak sıkı bağlantılarının bozulması, artmış bağırsak bariyeri geçirgenliği, immün düzensizlik ve epitel hücre ölümünü içerir ^2,3. NEC'in patogenezinde rol oynayan mekanizmalar hakkındaki anlayışımız eksik kalmıştır ve onlarca yıllık araştırmalara rağmen hala etkili bir hedefe yönelik tedavi yoktur.

NEC araştırmalarını ilerletmenin önündeki önemli bir engel, insan bebeklerinden izole edil....

Protokol

Enteroidler, NEC veya enflamatuar olmayan etiyolojileri olan diğer bağırsak koşulları için ameliyat sırasında elde edilen prematüre bebeklerden (22 ila 36 gebelik haftasında doğan) ince bağırsak örneklerinden türetilmiştir. Tüm numune toplama ve işleme, St. Louis'deki Washington Üniversitesi'ndeki (IRB Protokol numaraları 201706182 ve 201804040) ve Chapel Hill'deki Kuzey Carolina Üniversitesi'ndeki (IRB protokol numarası 21-3134) Kurumsal İnceleme Kurullarından bilgilendirilmiş onam ve onaydan sonra gerçekleştirildi.

1. Enteroidler oluşturmak için insan yenidoğan ince bağırsağından kriptlerin izolasyonu ve kaplanması

....

Tartışmalar

Bu çip üzerinde NEC sistemi, NEC'nin patofizyolojisini modellemek için kullanılabilecek güçlü ve yeni bir araçtır. Bu platform, sürekli luminal akış ve esneme ile bir ko-kültür sistemi dahil ederek önceki modellere göre in vivo bağırsak ortamına daha çok benzeyen karmaşık bir mikro ortam sağlar. Bu koşullar, olgun epitelyal alt tiplerden ve sıkı bağlantılardan oluşan oldukça polarize bir epitel ile kaplı 3D villus benzeri mimarinin gelişimini teşvik eder (Şe.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
[Leu15]-Gastrin I human	Sigma-Aldrich	G9145
A 83-01	Sigma-Aldrich	SML0788
Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12	Gibco	12634010
B-27 Supplement, serum free (50x)	Gibco	17504044
Basic Bio-kit	Emulate	N/A
BioTek Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader	Agilent	7131000
BRAND Methacrylate (PMMA) Cuvettes, Semi-Micro	BrandTech	759085D
Cell Recovery Solution	Corning	354270
CFX Opus Real-Time PCR Systems	Bio-Rad	12011319
Chip Cradle	Emulate	N/A
Chip-S1 Stretchable Chip	Emulate	N/A
CHIR99021	Sigma-Aldrich	SML1046
Clear TC-treated Multiple Well Plates,  48 well	Corning	3548
Collagen from human placenta	Sigma-Aldrich	C5533
Collagenase, Type I, powder	Gibco	17018029
Complete Human Endothelial Cell Medium with Kit	Cell Biologics	H-1168
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 15 mL	Fisher Scientific	05-539-12
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 50mL	Fisher Scientific	05-539-8
Countess Cell Counting Chamber Slides	Invitrogen	C10283
Countess II automated cell counter	Invitrogen	AMQAX1000
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)	Invitrogen	D3571
DAPT	Sigma-Aldrich	D5942
Dextran, Cascade Blue, 3000 MW, Anionic, Lysine Fixable	Invitrogen	D7132	Permeability dye
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Disposable PES Filter Units, 0.2um aPES membrane	Fisher Scientific	FB12566504
DMEM/F-12	Gibco	11320033
Donkey serum	Sigma-Aldrich	D9663
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium - high glucose	Sigma-Aldrich	D5796
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Gibco	14190-136
EDTA, 0.5 M,  pH 8.0	Corning	46-034-CI
ER-1 surface activation reagent	Emulate	ER-1	Chip Activation Reagent 1
ER-2 surface activation reagent	Emulate	ER-2	Chip Activation Reagent 2
Fibronectin Human Protein, Plasma	Gibco	33016015
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid, 100mm	Fisher Scientific	FB0875713
Gelatin-Based Coating Solution	Cell Biologics	6950
Genie Temp-Shaker 300	Scientific Industries, Inc.	SI-G300
Gentamicin	Gibco	15750060
HEPES, Liquid 1M Solution (238.3 mg/ mL)	Corning	25-060-CI
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate	Invitrogen	H3570
Human Collagen Type I	Sigma-Aldrich	CC050
Human Primary Small Intestinal Microvascular Endothelial Cells	Cell Biologics	H-6054
Inverted Microscope	Fisher Scientific	03-000-013
Isotemp General Purpose Deluxe Water Baths	Fisher Scientific	FSGPD10
L-Glutamine	Gibco	25030-081
Luria Broth (LB) agar, Miller	Supelco	L3027
L-WRN Cells	American Type Culture Collection	CRL-3276
Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, LDEV-free	Corning	356231	Cell Culture Matrix
N-2 Supplement (100x)	Gibco	17502048
N-acetyl-L-cysteine	Sigma-Aldrich	1009005
NAILSTAR UV LAMP	NailStar	NS-01-US
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Scientific	840-274200
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	72340
Orb-HM1 Hub Module	Emulate	N/A
Paraformaldehyde	ThermoFisher	047392.9L
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	10010023
Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+	Rainin	17013805
Pipette Tips TR LTS 1000µL S 768A/8	Rainin	17014966
Pod Portable Module	Emulate	N/A
Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS)(Heat Inactivated)	Avantor Seradigm	1500-500
QuantiTect Reverse Transcription Kit	QIAGEN	205313
Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF)	PeproTech	315-09
SB 431542	Tocris	1614
Square BioAssay Dish with Handles, not TC-treated	Corning	431111
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	1725271
Steriflip-GV Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit	Millipore	SE1M179M6
Sterile Cell Strainers, 70um	Fisher Scientific	22-363-548
Sterile Syringes, 10mL	Fisher Scientific	14-955-453
Straight, fine, sharp point scissors	Miltex Instruments	MH5-300
Thermo Scientific Sorvall X4R Pro-MD Centrifuge	Thermo Scientific	75016052
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Detergent
TRIzol Reagent	Invitrogen	15596026	RNA extraction reagent
Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v) in PBS, pH 7.5 ± 0.5	Corning	25-900-CI
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red	Gibco	12604013	Enzymatic Dissociation Reagent
Trypsin-EDTA solution	Sigma-Aldrich	T4174
VIOS 160i CO2 Incubator, 165 L	Thermo Scientific	13-998-252
Y-27632	Tocris	1254
Zoë-CM1 Culture Module	Emulate	N/A