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Resumo

Este protocolo descreve um modelo in vitro de enterocolite necrosante (ECN), que pode ser usado para estudos mecanísticos da patogênese da doença. Apresenta um chip microfluídico semeado com enteróides intestinais derivados do intestino neonatal humano, células endoteliais e o microbioma intestinal de um neonato com ECN grave.

Resumo

A enterocolite necrosante (ECN) é uma doença intestinal grave e potencialmente fatal que tem sido difícil de estudar devido à sua complexa patogênese, que permanece incompletamente compreendida. A fisiopatologia da ECN inclui ruptura das tight junctions intestinais, aumento da permeabilidade da barreira intestinal, morte de células epiteliais, disbiose microbiana e inflamação desregulada. Ferramentas tradicionais para estudar NEC incluem modelos animais, linhagens celulares, e organoides intestinais humanos ou de camundongos. Embora os estudos usando esses sistemas modelo tenham melhorado a compreensão da fisiopatologia da doença, sua capacidade de recapitular a complexidade da ECN humana é limitada. Um modelo melhorado in vitro de NEC usando tecnologia microfluídica, chamado NEC-on-a-chip, foi agora desenvolvido. O modelo NEC-on-a-chip consiste em um dispositivo microfluídico semeado com enteróides intestinais derivados de um neonato prematuro, co-cultivado com células endoteliais humanas e o microbioma de um lactente com ECN grave. Este modelo é uma ferramenta valiosa para estudos mecanísticos sobre a fisiopatologia da ECN e um novo recurso para testes de descoberta de drogas para doenças intestinais neonatais. Neste manuscrito, uma descrição detalhada do modelo NEC-on-a-chip será fornecida.

Introdução

A enterocolite necrosante (ECN) acomete prematuros, com incidência de até 10% naqueles nascidos com peso < 1500 g1. A fisiopatologia da ECN é complexa e inclui danos ao epitélio intestinal, ruptura das tight junctions intestinais, aumento da permeabilidade da barreira intestinal, desregulação imunológica e morte de células epiteliais 2,3. Nossa compreensão dos mecanismos envolvidos na patogênese da ECN permanece incompleta e, apesar de décadas de pesquisa, ainda não existem terapias-alvo eficazes.

Uma barreira significativa para o avanço da pesquisa da NEC é a disponibilidade limitada e o pequeno tamanho do tecido intestinal primário isolado de bebês humanos. O tecido intestinal ressecado de lactentes com ECN é frequentemente necrótico e gravemente danificado, o que dificulta os estudos sobre os mecanismos que precedem o início da doença. Por exemplo, o intestino delgado de lactentes com ECN é inundado por células imunes, e um número reduzido de células-tronco intestinais, diminuição da proliferação de células epiteliais e aumento da apoptose de células epiteliais também são observados 4,5,6,7. Isso leva a dificuldades na cultura de células epiteliais intestinais dessas amostras e no isolamento de RNA e proteínas, que podem ser degradadas nesse ambiente inflamatório hostil. Além disso, como o processo de doença já está avançado em lactentes com ECN cirúrgica, estudos mecanísticos sobre fatores indutores da doença são inviáveis. Essas limitações têm levado à dependência de modelos animais para estudos mecanísticos de ECN.

Modelos animais de ECN foram estabelecidos para camundongos, ratos, leitões, coelhos e babuínos 5,8,9,11. Um ponto forte dos modelos animais é que a doença intestinal semelhante à ECN é induzida por fatores associados ao aparecimento de ECN em humanos, incluindo um microbioma disbiótico, episódios repetidos de hipóxia e ausência de alimentos com leite materno 5,8,10,11. Além disso, a resposta inflamatória e as alterações patológicas observadas durante a ECN experimental paralela à doença humana 5,9,12. Embora esses modelos mimetizem muitas das características da ECN humana, há diferenças inerentes entre a fisiopatologia da ECN em animais e humanos. Por exemplo, o modelo murino de ECN é induzido em camundongos nascidos a termo e, embora seu desenvolvimento intestinal seja incompleto, a fisiopatologia da ECN é inerentemente diferente nesse contexto clínico. A expressão gênica intestinal murina ao nascimento é semelhante à de um feto humano pré-viável e não se aproxima da de um recém-nascido prematuro de 22-24 semanas de gestação até o 14º dia (P14)13. Isso confunde o modelo de NEC murino porque a lesão intestinal geralmente não pode ser induzida em camundongos após P10. Além disso, linhagens endogâmicas de camundongos não possuem a diversidade imunológica14 e microbiológica de neonatos humanos15, o que serve como outro fator de confusão. Assim, o aumento da incorporação de amostras humanas primárias na pesquisa da NEC melhora a relevância clínica de estudos nessa área.

Estudos sobre os mecanismos da ECN in vitro têm tradicionalmente utilizado linhagens celulares monotípicas derivadas de células adultas de câncer intestinal, como células de adenocarcinoma colorretal (Caco2) e adenocarcinoma de cólon humano (HT-29)16. Esses modelos são convenientes, mas limitados em relevância fisiológica devido ao seu crescimento a partir de células cancerosas adultas, arquitetura não-polarizada e mudanças fenotípicas relacionadas a passagens repetidas em cultura. Os enteroides intestinais melhoram esses modelos, pois podem ser cultivados a partir das criptas do tecido intestinal, diferenciados em todos os subtipos epiteliais intestinais e formar uma estrutura tridimensional (3D) semelhante às vilosidades17,18,19,20. Recentemente, enteróides intestinais têm sido combinados com tecnologia microfluídica para desenvolver um modelo de intestino delgado em um chip e fornecer um sistema modelo in vitro fisiologicamente maisrelevante21.

Os dispositivos microfluídicos iniciais organ-on-a-chip foram introduzidos no início dos anos 200022,23,24. O primeiro modelo de órgão-em-um-chip foi o pulmão-on-um-chip25. Isso foi seguido por vários modelos de órgão único, como intestino 21, fígado 26, rins 27, medula óssea 28, barreira hematoencefálica 29 e coração30. Esses modelos organ-on-a-chip têm sido usados para estudar doenças agudas, crônicas e raras, incluindo síndrome aguda da radiação31, doença pulmonar obstrutiva crônica32 e doençasneurodegenerativas33. A natureza polarizada das células nesses chips e a presença de dois compartimentos celulares separados por uma membrana porosa permitem a modelagem de processos fisiológicos complexos, como perfusão, gradientes químicos de concentração e quimiotaxia de células imunes34,35. Esses sistemas microfluídicos fornecem, assim, uma nova ferramenta para o estudo da fisiopatologia e dos mecanismos das doenças humanas.

O modelo de intestino delgado em chip foi descrito por Kasendra e col. em 2018, que utilizaram espécimes de biópsia do intestino delgado pediátricos (10-14 anos) diferenciados em enteróides e cultivados em um dispositivo microfluídico21. Células endoteliais vasculares, fluxo contínuo de meios e estiramento/relaxamento também foram incorporados a esse modelo. Observaram diferenciação do subtipo epitelial intestinal, formação de eixos 3D villus-like, produção de muco e padrões de expressão gênica do intestinodelgado21. Esse modelo microfluídico foi aplicado à doença neonatal com o desenvolvimento do sistema NEC-on-a-chip, que incorpora enteróides intestinais neonatais, células endoteliais e o microbioma de um neonato com NEC36. O NEC-on-a-chip recapitula muitas das características críticas da ECN humana, incluindo expressão gênica inflamatória, perda de células epiteliais especializadas e redução da função de barreira intestinal36. Assim, este modelo tem inúmeras aplicações no estudo da ECN, incluindo estudos mecanísticos e descoberta de fármacos. Neste manuscrito, um protocolo detalhado para a realização do modelo NEC-on-a-chip é fornecido.

Protocolo

Os enteroides foram derivados de amostras do intestino delgado de prematuros (nascidos entre 22 e 36 semanas de gestação) obtidas no momento da cirurgia para ECN ou outras condições intestinais com etiologias não inflamatórias. Toda a coleta e processamento dos espécimes foram realizados após consentimento informado e aprovação dos Comitês de Revisão Institucional da Washington University em St. Louis (números do protocolo IRB 201706182 e 201804040) e da University of North Carolina at Chapel Hill (protocolo IRB número 21-3134).

1. Isolamento e plaqueamento de criptas do intestino delgado neonatal humano para estabelecimento de enteróides

  1. Preparação da mídia
    1. Prepare todas as mídias necessárias conforme descrito na Tabela 1. Certifique-se de que a técnica asséptica seja usada para a preparação de todos os meios. Filtrar o meio esterilizado com um filtro de 0,2 μm e conservar a 4 °C até à utilização.
  2. Lavagem e picagem de tecido intestinal
    1. Coloque o hidrogel da matriz de cultura celular no gelo para descongelar. Obter tecido intestinal humano da sala de cirurgia. Colocar imediatamente a amostra em 5 mL de meio de lavagem de tecido gelado para inativar proteases endógenas.
    2. Lave o conteúdo intestinal com solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (D-PBS) gelada usando uma seringa de 10 mL equipada com uma ponta de pipeta P1000 aparada. Transfira o tecido intestinal para uma placa de 35 mm contendo 5 mL de D-PBS gelado.
    3. Corte o tecido intestinal longitudinalmente para expor o lúmen e corte-o em pequenos pedaços usando uma tesoura fina. Enxaguar o tecido intestinal agitando suavemente em D-PBS na placa de cultura de tecidos.
    4. Transfira fragmentos de tecido para uma placa limpa de 35 mm. Pique o tecido com uma tesoura fina. O tamanho ideal é de 0,5 cm2 por peça. O tecido intestinal deve passar por uma ponta de pipeta de 1 mL aparada.
  3. Dissociação do tecido intestinal
    1. Adicionar 1 mL de colagenase I pré-aquecida ao tecido. Misture o tecido com colagenase pipetando 10-15 vezes e transfira para um tubo cônico de 15 mL.
    2. Fixe o tubo horizontalmente em um agitador regulado a 50 rpm. Agitar durante 20 minutos à temperatura ambiente.
    3. Após a incubação, remova os tubos do agitador e ressuspenda a solução pipetando 10-15 vezes. Opcional: remova uma pequena alíquota para verificar a presença de criptas únicas usando microscopia de contraste de fase.
  4. Isolamento de criptas intestinais
    1. Filtrar criptas através de um filtro de 70 μm em um tubo cônico de 50 mL sobre gelo. Lave o filtro com 9 mL de lenço de papel gelado. Transfira o filtrado para um tubo cônico de 15 mL.
    2. Centrifugar a 300 x g durante 10 minutos a 4 °C e remover suavemente o sobrenadante. Serão aproximadamente 200 μL de meio remanescentes no tubo. Ressuspender o pellet em 5 mL do meio de lavagem do tecido gelado.
    3. Centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 °C. Ressuspender o pellet em 1 mL de lavador de tecido e transferir para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
    4. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4 °C para pellet das criptas. Aspirar o sobrenadante com cuidado e completamente tanto quanto possível usando uma pipeta. Coloque o tubo sobre o gelo.
  5. Plating criptas intestinais
    1. Ressuspender o pellet em hidrogel de matriz de cultura celular (20 μL/poço de uma placa de cultura de tecido de 48 poços) usando uma ponta de pipeta pré-resfriada para fazer uma suspensão homogênea de criptas enquanto o tubo permanece no gelo. Evite fazer bolhas ao pipetar. Mantenha o tubo no gelo até estar pronto para uso.
      NOTA: O hidrogel da matriz de cultura celular polimerizará a temperaturas superiores a 8 °C. As criptas isoladas de um pedaço de tecido intestinal de 0,5 cm-1 cm de comprimento são geralmente plaqueadas em 10 poços de uma placa de cultura de tecidos de 48 poços.
    2. Placa da suspensão de hidrogel de matriz de cripta/cultura celular em uma placa de cultura de tecidos pré-aquecida de 48 poços. Aqueça a placa para auxiliar na solidificação da matriz. Coloque a suspensão no centro do poço. Evite bolhas ao chapear.
    3. Incubar as placas por 20 min a 37 °C para polimerizar a matriz. É essencial que o hidrogel da matriz de cultura celular polimerize completamente antes da adição do meio.
    4. Após a polimerização da matriz, adicionar 300 μL de meio pré-aquecido 50% L-WRN em cada poço. Incubar a 37 °C, 5% CO2.
    5. Troque de mídia a cada 2 a 3 dias. Substitua por meios condicionados a 50% L-WRN quentes. Passagem a cada 7 a 10 dias. Enteróides de passagem quando são 50%-90% confluentes e exibem formação de gemas.
      Observação : a mídia pode precisar ser alterada com mais frequência se ele se tornar amarelo. A frequência de passagem dependerá da densidade enteróide e da taxa de crescimento das células de um determinado paciente. Os enteroides precisarão ser passados se seus centros ficarem escuros na aparência.
  6. Passando os enteróides
    1. Aspirar suavemente o meio dos poços. Lave cuidadosamente os poços com 500 μL de D-PBS quente. Cuidado para não atrapalhar a matriz.
    2. Adicionar 250 μL de solução de recuperação de células frias a cada poço. Risque o fundo de cada poço com uma ponta de pipeta fresca para interromper o hidrogel da matriz de cultura celular. Incubar a placa no gelo por 30 min.
    3. Dissociar os enteróides por pipetagem vigorosa (~25-50 vezes com pipeta P200) e adicionar 500 μL de meio de lavagem de tecido.
    4. Transfira a suspensão enteróide para um tubo de 15 mL e adicione mais 5 mL de meio de lavagem de tecido frio. Pipetar suavemente para formar uma solução homogênea.
    5. Centrifugar a 400 x g durante 5 min a 4 °C para pellet dos enteróides. Coloque o tubo sobre gelo e aspirar o sobrenadante o mais completamente possível. Haverá aproximadamente 30-60 μL restantes no tubo.
      OBS: Se houver dificuldades em quebrar os enteróides com pipetagem, tripsina-EDTA a 0,25% ou reagente de dissociação enzimática podem ser utilizados para facilitar esse processo.
    6. Ressuspender enteróides no volume residual do meio de lavagem com pipeta P200. Evite a formação de bolhas durante a pipetagem.
    7. Adicionar 20 μL de hidrogel de matriz de cultura celular por novo poço de uma placa de 48 poços à suspensão enteróide. Divida os enteróides 1:3, 1:4 ou 1:5, dependendo de sua densidade.
    8. Adicione a suspensão a uma placa pré-aquecida de 48 poços. Incubar a placa a 37 °C durante 20 min para solidificar a matriz.
    9. Após a polimerização, adicionar 300 μL de meio pré-aquecido com 50% L-WRN em cada poço. Incubar a 37 °C, 5% CO2.

2. Modelo intestino neonatal em um chip

NOTA: Para obter instruções detalhadas sobre o manuseio dos chips microfluídicos e o uso deste equipamento, consulte o protocolo de cultura de chips intestinais do duodenodo fabricante 37.

  1. Preparação da mídia
    1. Prepare todas as mídias necessárias conforme descrito na Tabela 2. Certifique-se de que a técnica asséptica seja usada. Filtrar o meio esterilizado com um filtro de 0,2 μm e conservar a 4 °C até à utilização.
  2. Dia (-3): Descongelamento e expansão de células endoteliais microvasculares intestinais humanas (HIMECs)
    1. Descongele um frasco de HIMECs e placa de acordo com as recomendações do fabricante.
    2. Cobrir um balão de25 cm 2 com solução de revestimento à base de gelatina durante 2 min. Retire o excesso de solução. Adicionar HIMECs (aproximadamente 0,5-1 x 106 células) ressuspensos em 6 mL de meio HIMEC ao frasco. Incubar a 37 °C, 5% CO2.
    3. Troque a mídia HIMEC a cada 48 h. Adicione HIMECs ao canal endotelial (inferior) do chip dentro de 48-72 h de se tornar 100% confluente.
  3. Dia (-1): Ativação e revestimento dos chips antes da adição dos enteróides
    1. Reconstitua o pó do reagente de ativação de chip 1 (CR-1) para fazer a solução de CR-1. Certifique-se de que o pó CR-1 e a solução de reagente de ativação de cavaco 2 (CR-2) estejam à temperatura ambiente para esta etapa.
      NOTA: Mantenha o pó CR-1 e a solução CR-1 preparada nos passos seguintes sempre protegidos da luz. A luz deve estar apagada no capô para esses passos.
      1. Coloque o chip e o suporte de chip no suporte do chip e, em seguida, coloque-os em uma placa de cultura de tecidos no capuz de cultura de células. Consulte o protocolo do fabricante para a técnica adequada para colocação de chips na portadora37.
      2. Adicione 1 ml de solução de CR-2 ao frasco para injetáveis de pó de CR-1 e, em seguida, transfira diretamente a solução do frasco para injetáveis de pó de CR-1 para um tubo de 15 ml envolto em folha de alumínio para o proteger da luz. Não misture a solução com a pipeta. O objetivo é evitar a formação de bolhas.
      3. Adicione mais 1 ml de solução de CR-2 ao frasco para injetáveis de CR-1 e transfira para o tubo de 15 ml. Repita para um total de 4 enxaguagens e um total de 4 mL de CR-2 enxaguado através do frasco para injetáveis CR-1. Adicione a tampa ao frasco para injetáveis e inverta para o último enxágue para remover qualquer pó residual.
      4. Adicionar mais 6 mL de CR-2 ao tubo de 15 mL contendo CR-1 para um volume final de 10 mL (0,5 mg/mL). Misture esta solução com uma pipeta sem introduzir bolhas. Certifique-se de que o CR-1 seja totalmente dissolvido antes de prosseguir para a próxima etapa.
    2. Adição de solução CR-1 ao chip
      NOTA: É fundamental evitar a introdução de bolhas nos canais ao adicionar essas soluções. A solução CR-1 deve permanecer protegida da luz durante esta etapa.
      1. Usando uma ponta de pipeta de 200 μL, adicione 20 μL de solução CR-1 à entrada do canal inferior até que a solução comece a sair da saída do canal inferior. Adicionar 50 μL de solução CR-1 através da entrada do canal superior até que a solução comece a sair da saída do canal superior. Remova qualquer excesso de solução CR-1 da superfície do chip por aspiração suave.
        NOTA: As soluções devem sempre ser adicionadas ao canal inferior antes do canal superior. Se forem observadas bolhas, lave ambos os canais com solução CR-1 e repita o ponto 2.3.2.1.
      2. Se a tampa da placa de cultura de tecidos que contém os chips estiver no lugar, remova-a para esta etapa. Coloque os chips sob a luz UV por 15 min. Remova o CR-1 dos canais superior e inferior.
      3. Repita as etapas 2.3.2.1 a 2.3.2.2 para um total de duas etapas de ativação UV. Após essa etapa, os chips não são mais sensíveis à luz.
      4. Remova o CR-1 dos canais superior e inferior. Lave ambos os canais com 100 μL de solução CR-2. Remova a solução CR-2 dos canais superior e inferior.
      5. Lavar ambos os canais com 100 μL de D-PBS estéril. Repita as lavagens 2x. Adicionar 100 μL de D-PBS a ambos os canais. Retire o excesso da superfície dos cavacos mas deixe os canais cheios.
    3. Revestir os canais com a matriz extracelular.
      1. Descongelar fibronectina, colágeno IV e hidrogel de matriz de cultura celular em gelo imediatamente antes desta etapa e manter essas soluções em gelo pelo restante desta seção.
      2. Prepare as seguintes soluções de matriz extracelular (ECM) para os canais superior e inferior do chip:
        Top Channel: 100 μL de 200 μg/mL de colágeno tipo IV e 100 μg/mL de hidrogel de matriz de cultura celular em D-PBS por chip.
        Canal inferior: 100 μL de 200 μg/mL de colágeno tipo IV e 30 μg/mL de fibronectina em D-PBS por chip.
      3. Remova completamente o D-PBS dos canais superior e inferior. Adicione 50 μL de ECM à entrada do canal inferior até que uma gota apareça na saída. Repita para o canal superior. Certifique-se de usar as soluções de ECM apropriadas para cada canal e adicione a solução ao canal inferior primeiro.
      4. Adicione D-PBS ao reservatório do berço do cavaco e substitua a tampa da placa de cultura de tecidos. Coloque os cavacos em uma incubadora umidificada a 37 °C, 5% CO2 durante a noite.
  4. Dia (0): Semeando chips com HIMECs e enteróides
    1. Equilíbrio a vácuo de meios
      1. Adicione o volume necessário de mídia HIMEC e mídia de expansão de chips, para completar o experimento, a um tubo cônico estéril de 50 mL. Equilibrar o meio a 37 °C em banho-maria durante, pelo menos, 1 h.
      2. Conecte o dispositivo de filtração a vácuo a tubos de 50 mL contendo meio aquecido. Os tubos devem ser orientados com o meio pré-aquecido no fundo do tubo cônico de 50 mL. Vácuo a -70 kPa ou superior por 10 s.
      3. Vire os tubos para que a mídia se mova através do filtro. Continue a aspirar por 5 min. Após a conclusão da filtração a vácuo, remova o dispositivo de filtração a vácuo e coloque os tubos de 50 mL contendo o meio na incubadora de 37 °C.
    2. Lavar as batatas fritas
      1. Lavar o canal endotelial lavando com 100 μL de meio HIMEC pré-aquecido.
        Lavar o canal epitelial lavando com 100 μL de meio de expansão de cavaco pré-aquecido. Remova qualquer mídia que se espalhe na superfície dos chips.
      2. Repita a etapa de lavagem. A mídia deve permanecer nos canais, bem como nas portas de entrada e saída após essas descargas. Substitua a tampa da placa de cultura que contém os cavacos e retorne à incubadora até ficar pronta para uso.
    3. Colheita de HIMECs
      1. Aspirar meio do frasco2 de 25 cm contendo HIMECs. Lave suavemente a monocamada com D-PBS. Adicionar 2 mL de tripsina-EDTA a 0,05% pré-aquecido ao balão e enxaguar suavemente sobre a monocamada.
      2. Incubar o balão a 37 °C durante 2-5 min. Neutralizar tripsina com 10 mL de meio HIMEC. Ressuspender as células em meio e transferir para um tubo de 15 mL.
      3. Gire nas células 150 x g durante 5 minutos a 4 °C. Ressuspender células em 200 μL de meio HIMEC.
      4. Retire 10 μL de células e coloque o tubo sobre gelo. Conte células usando um hemocitômetro ou contador de células automatizado. A concentração desejada de HIMECs é de 6 x 10 6 a 8 x 106 células/mL.
    4. Semeando HIMECs no chip
      1. Retire o cavaco da incubadora e leve-o para o capô. Aspirar qualquer mídia que possa ter vazado na superfície do chip.
      2. Limpe o canal epitelial (superior) do chip com 100 μL de meio de expansão de chip pré-aquecido. Lavar o canal endotelial (inferior) do chip com 100 μL de meio HIMEC pré-aquecido.
      3. Ressuspenda suavemente os HIMECs para obter uma distribuição homogênea. Remova completamente a mídia do canal endotelial (inferior). Adicione 10 μL de HIMECs (~36.000 células/chip) ao canal endotelial (inferior).
        NOTA: Se for difícil preencher o canal HIMEC sem formação de bolhas ao usar 10 μL de HIMECs, aumente o volume de células adicionadas. Deve ser o mesmo número de células por chip.
      4. Adicione meios de crescimento organoides adicionais ao canal epitelial (superior) se ele não estiver cheio. Verifique a densidade de semeadura dos HIMECs. Se eles não estiverem uniformemente distribuídos e não cobrirem de 80% a 90% da superfície do cavaco, lave o canal e repita a semeadura.
      5. Inverta o chip para o suporte de chips no prato de cultura celular. Adicione D-PBS ao reservatório no suporte do chip. Substitua a tampa da placa de cultura celular e coloque-a na incubadora.
      6. Deixe o chip invertido a 37 °C por 2-3 h para permitir que os HIMECs se conectem à membrana do chip. Após a conclusão da incubação, devolva o suporte de chip/chip para uma posição vertical.
      7. Lave suavemente o canal endotelial (inferior) com 100 μL de meio HIMEC aquecido. Deixe a mídia no canal. Lavar suavemente o canal epitelial (superior) com 100 μL de meio de crescimento organoide. Deixe a mídia no canal.
      8. Retorne os chips para a incubadora de 37 °C enquanto conclui as próximas etapas.
    5. Colheita de enteróides e semeadura em cavaco
      NOTA: Os chips são semeados com enteróides que foram divididos 10-14 dias antes, são 50%-75% confluentes, e na passagem 7 e 20. Consulte a Figura 2 para o aparecimento de enteróides no Dia 0. O tempo necessário para que os enteroides estejam prontos para a semeadura dependerá da taxa de crescimento das células de um determinado paciente.
      1. Aspirar suavemente o meio dos poços. Lave cuidadosamente os poços contendo hidrogel de matriz de cultura celular com 500 μL de D-PBS aquecido. Tenha cuidado para não perturbar o hidrogel da matriz de cultura celular.
      2. Adicionar 250 μL de solução de recuperação de células frias a cada poço. Risque o fundo de cada poço com uma ponta de pipeta fresca para interromper o hidrogel da matriz de cultura celular. Adicione o conteúdo dos poços a um tubo frio de 15 mL sobre gelo.
      3. Incubar o tubo no gelo por 45 min e inverter o tubo a cada 3-5 min. Durante esta etapa, prepare meios de dissociação enteróides. Colocar este meio em banho-maria a 37 °C quando faltarem 10 minutos na etapa de incubação.
      4. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4 °C para pellet dos enteróides. Remova o sobrenadante.
      5. Adicionar 2 mL de meio de dissociação enteróide por placa colhida ao pellet e colocar em banho-maria a 37 °C por 60 s a 120 s. Agite suavemente o tubo durante a incubação. Incubar por tempo suficiente para alcançar enteróides fragmentados, mas sem dissociação em uma única suspensão celular.
      6. Após a incubação, adicionar 10 mL de lavador de tecido frio a cada tubo de 15 mL. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4 °C para pellet dos enteróides. Aspirar o sobrenadante completamente.
      7. Ressuspender o pellet em 200 μL de meio de expansão de cavacos. Dissociar enteróides por pipetagem vigorosa (~25-50 vezes com pipeta P200).
      8. Combinar células em um tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mL. Pipetar suavemente para formar uma solução homogênea. O objetivo é semear o chip com enteroides fragmentados em pequenos aglomerados de 10 a 30 células.
      9. Remover 10 μL de suspensão celular para contagem. Coloque a suspensão celular restante no gelo. Ajuste o volume do chip de expansão do meio para atingir uma concentração de 6 x 106 células/mL.
        NOTA: Pode ser necessário centrifugar os enteróides e ressuspendê-los em um volume menor de meios para atingir a densidade necessária.
      10. Traga os chips microfluídicos para dentro do capô e aspirar o meio do canal epitelial (superior) do chip. Carregue o canal superior do chip com 30 μL de células ressuspensas (~180.000 células/chip). Garantir cobertura completa e uniforme do canal epitelial do chip para a formação de uma monocamada. Se isso não for alcançado, enxágue os enteroides através do chip e resemente.
        NOTA: Se houver dificuldades para obter uma suspensão uniforme durante o carregamento de vários chips, os enteróides podem ser separados em alíquotas de 40 μL em tubos individuais de microcentrífuga de 1,5 mL. Isso minimizará a variabilidade no número de enteroides e no tamanho dos fragmentos à medida que o carregamento avança.
      11. Devolva os chips ao berço de chips na placa de cultura celular (se tiverem sido removidos). Adicione D-PBS ao reservatório no suporte do chip. Substitua a tampa para o prato de cultura celular e coloque lascas a 37 °C, 5% CO2 durante a noite.
  5. Dia (1): Preparando vagens e introduzindo fluxo em chips
    1. Traga os chips para a capa de cultura de tecidos. Lave suavemente o canal epitelial duas vezes com 100 μL de meio de expansão de cavacos. Lave suavemente o canal endotelial duas vezes com 100 μL de meio HIMEC. Remova o excesso de mídia da superfície do chip.
    2. Prime pods e regulados de acordo com o protocolo do fabricante37. Adicionar 2 mL de meio apropriado aos reservatórios de entrada. Adicionar 300 μL do meio apropriado aos reservatórios de saída. O fluxo será de 30 μL/h. O trecho ainda não será iniciado.
  6. Dia (2): Monitoramento do desenvolvimento de monocamadas e mudança de mídia
    1. Pause o módulo de cultura e traga as vagens para o capô.
    2. Inspecione chips e cápsulas em busca de bolhas. Examinar a monocamada epitelial usando um microscópio de contraste de fase. Capture imagens em locais consistentes em todo o chip para monitorar o progresso. Imagem dos chips enquanto eles permanecem nas cápsulas.
    3. Remova o meio dos reservatórios de entrada do canal superior e substitua-o por 2 mL de meio de diferenciação de chips. Adicionar 1 mL de meio HIMEC ao reservatório de entrada do canal inferior. Deixe meios suficientes nos reservatórios de entrada para garantir que o fundo do reservatório permaneça coberto com uma fina camada de meios.
    4. Retorne as vagens ao módulo de cultura e reinicie o fluxo a 30 μL/h.
  7. Dia (3): Monitorando o desenvolvimento da monocamada, iniciando o alongamento e adicionando mídia
    1. Repita as etapas 2.6.1.1. e 2.6.1.2. Adicionar 1 mL de meio de diferenciação de cavacos ao reservatório de entrada do canal superior e adicionar 1 mL de meio HIMEC ao reservatório de entrada do canal inferior.
      NOTA: Remova a mídia dos reservatórios de saída de ambos os canais quando eles começarem a atingir 50-75% da capacidade.
    2. Retorne os pods para o módulo de cultura. Reinicia o fluxo a 30 μL/h e inicia o alongamento com 2% de deformação e frequência de 0,2 Hz.
  8. Dia (4): Monitorando o desenvolvimento da monocamada, aumentando o alongamento e adicionando mídia
    1. Repita as etapas 2.6.1.1. e 2.6.1.2. Adicionar 1 mL de meio de diferenciação de cavacos ao reservatório de entrada do canal superior e adicionar 1 mL de meio HIMEC ao reservatório de entrada do canal inferior.
      NOTA: Remova a mídia dos reservatórios de saída de ambos os canais quando eles começarem a atingir 50-75% da capacidade.
    2. Retorne os pods para o módulo de cultura. Reinicia o fluxo a 30 μL/h e aumenta o alongamento para 10% de deformação e uma frequência de 0,2 Hz.
  9. Dia (5) a Dia (7): Monitorando o desenvolvimento de monocamadas e adicionando mídia
    1. Repita as etapas 2.6.1.1. e 2.6.1.2. Adicionar 1 mL de meio de diferenciação de cavacos ao reservatório de entrada do canal superior e adicionar 1 mL de meio HIMEC ao reservatório de entrada do canal inferior.
    2. Retorne os pods para o módulo de cultura e reinicie o fluxo e o alongamento. Uma vez que os eixos semelhantes a vilosidades são visualizados, prossiga para o modelo NEC-on-a-chip.

3. Modelo NEC-on-a-chip

  1. Cultura de bactérias intestinais
    NOTA: Esta etapa requer um estoque congelado pré-titulado de bactérias entéricas de um paciente com ECN que é preparado antes de iniciar este protocolo. Para esses experimentos, uma lama de bactérias entéricas polimicrobianas previamente descrita de um paciente com ECN cirúrgica grave foi usada38.
    1. Faça um estoque de glicerol de 50% de bactérias entéricas e armazene em um freezer de -80 °C até uso posterior.
    2. Descongelar uma alíquota das bactérias intestinais e inocular 10 μL em 3 mL de meio Luria-Bertani (LB). Incubar a 37 °C com agitação a 150 rpm durante a noite.
    3. No mesmo dia, lave suavemente os canais com 100 μL de meio de diferenciação de chips pré-aquecido livre de antibióticos (canal superior) ou 100 μL de meio HIMEC livre de antibiótico pré-aquecido (canal inferior). Aspirar totalmente o meio e repetir a descarga para um total de 3 lavagens.
    4. Após aspirar a terceira lavagem, substitua o meio nos canais e deixe no lugar.
    5. Enxaguar os reservatórios de entrada do canal superior e inferior com D-PBS estéril e, em seguida, encher com 3 mL do meio livre de antibiótico apropriado. Cápsulas primos e regulam como no ponto 2.5.2.
    6. Retorne o chip ao módulo de cultura e reinicie o alongamento e o fluxo.
    7. Na manhã seguinte, tomar 1 mL da cultura bacteriana durante a noite e inocular-a em 25 mL de LB fresco.
    8. Retorne esta nova cultura ao agitador de 37 °C até que o OD600 atinja 0,6 ± 0,02 medido usando uma cubeta de 1 cm. Diluir a cultura bacteriana para 7 x 108 unidades formadoras de colônias/mL em meio de expansão de cavacos livre de antibióticos.
    9. Guarde uma alíquota dessa cultura para confirmar a concentração do inóculo39. Pode ser necessário ajustar a concentração das bactérias dependendo da resposta do epitélio.
    10. Remova o meio do canal epitelial (superior). Adicione 30 μL da cultura bacteriana diluída em meio de expansão de chip livre de antibióticos ao canal superior do chip. Tenha muito cuidado para evitar a contaminação cruzada do canal HIMEC (endotelial) com bactérias. Remova qualquer mídia extra da superfície do chip.
    11. Permitir que os chips permaneçam em condições estáticas por 30 min para facilitar a aderência bacteriana ao lado apical do epitélio neonatal. Após a incubação, lave o canal superior com 100 μL de meio de expansão livre de antibióticos para remover as bactérias não anexadas. Retorne os chips ao módulo de cultura e reinicie o alongamento e o fluxo.
    12. A cada 24 h, remova as vagens do módulo de cultura e lave lentamente 100 μL de meio de expansão de chip livre de antibiótico através do canal epitelial. Isso ajudará a prevenir o supercrescimento bacteriano.

4. Ensaio de permeabilidade intestinal

Observação : isso pode ser executado em qualquer etapa durante o protocolo. Se iniciado quando os chips são semeados, o ensaio de permeabilidade intestinal pode ser usado para avaliar seriadamente a confluência de monocamadas. Se iniciado após a adição de bactérias intestinais, este ensaio pode ser usado para determinar a influência de bactérias intestinais na integridade da monocamada epitelial intestinal.

  1. Remova o meio do reservatório de entrada para o canal epitelial (superior). Adicionar meios apropriados contendo corante de permeabilidade (50 μg/mL) ao reservatório de entrada. Use meios de diferenciação de chips sem antibióticos para o modelo NEC-on-a-chip.
  2. Coletar os efluentes dos canais epiteliais e endoteliais a cada 24 h. Quantificar a concentração do corante de permeabilidade utilizando um leitor de microplacas conforme Lanik et al.36.

5. Imuno-histoquímica

  1. Lave suavemente o canal inferior e o canal superior do chip com 200 μL de D-PBS. Aspirar completamente D-PBS dos canais.
  2. Fixar as células lavando ambos os canais com paraformaldeído a 4%, deixando solução nos canais. Aspirar o excesso da superfície do cavaco Incubar à temperatura ambiente durante 30 min.
  3. Lave ambos os canais com 200 μL de D-PBS. Deixe o D-PBS no canal inferior e remova completamente do canal superior.
  4. Permeabilizar a camada epitelial lavando o canal superior com 100 μL de solução detergente a 0,1%, deixando a solução nos canais. Aspirar o excesso da superfície do cavaco e incubar à temperatura ambiente por 45 min.
  5. Lave ambos os canais com 200 μL de D-PBS. Deixe o D-PBS no canal inferior e remova completamente do canal superior.
  6. Adicione 10% de soro de burro (ou um agente de bloqueio apropriado) ao canal superior por 1 h à temperatura ambiente. Lave ambos os canais com 200 μL de D-PBS. Deixe o D-PBS no canal inferior e remova completamente do canal superior.
  7. Diluir anticorpos primários em soro de burro a 5% e adicionar ao canal superior do chip (anticorpos e concentrações previamente testados estão disponíveis em Lanik et al.36). Incubar a 4 °C durante a noite.
  8. Lave ambos os canais 3x com 200 μL de D-PBS. Deixe o D-PBS no canal inferior e remova completamente do canal superior.
  9. Anticorpos secundários diluídos com marcação fluorescente diluídos 1:200 em soro de burro a 5% em D-PBS e Hoechst 33342 ou DAPI (colorações nucleares). Adicione anticorpos secundários ao canal superior do chip. Incubar à temperatura ambiente durante 1 h, protegido da luz.
  10. Lave ambos os canais 3x com 200 μL de D-PBS. Deixe os canais preenchidos com D-PBS após a lavagem final. Colocar o chip em uma placa de imagem com D-PBS para aquisição de imagens usando microscopia confocal.
    NOTA: Os chips fixos, manchados ou não, podem ser armazenados a 4 °C por até 1 semana em PBS. Certifique-se de que os canais não sequem durante esse período.

6. Isolamento de RNA, preparação de cDNA e PCR quantitativo em tempo real

  1. Lave suavemente o canal inferior e o canal superior do chip com 200 μL de D-PBS. Aspirar completamente D-PBS dos canais.
  2. Extrair o RNA total das células usando um reagente de extração de RNA de acordo com as instruções do fabricante. Para isolar o RNA apenas do epitélio, infundir apenas através do canal superior.
  3. Quantificar a concentração de RNA usando um espectrofotômetro de nanovolume. Transcreva reversamente 1 μg de RNA total. Realizar PCR quantitativo em tempo real. Os primers utilizados anteriormente neste modelo estão disponíveis em Lanik e col. 36.

Resultados

Os enteróides foram semeados no dispositivo microfluídico (Figura 1) e cultivados conforme descrito acima. O crescimento dos enteróides em hidrogel de matriz de cultura celular antes da semeadura e, em seguida, a expansão subsequente da monocamada de células epiteliais intestinais após a semeadura do dispositivo foi monitorado por microscopia de campo claro (Figura 2). Uma monocamada de células epiteliais intestinais confluentes formou-se e posteriormente...

Discussão

Este sistema NEC-on-a-chip é uma nova e poderosa ferramenta que pode ser usada para modelar a fisiopatologia da ECN. Esta plataforma fornece um microambiente complexo que mais se assemelha ao meio intestinal in vivo do que os modelos anteriores, incorporando um sistema de co-cultura com fluxo luminal contínuo e estiramento. Essas condições promovem o desenvolvimento de uma arquitetura 3D vilosímile revestida por um epitélio altamente polarizado, constituído por subtipos epiteliais maduros e tight junction...

Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesse relacionados a este manuscrito.

Agradecimentos

Este manuscrito foi apoiado por R01DK118568 (MG), R01DK124614 (MG) e R01HD105301 (MG) dos Institutos Nacionais de Saúde, o Chan Zuckerberg Initiative Grant 2022-316749 (MG), um Thrasher Research Fund Early Career Award (LCF), um UNC Children's Development Early Career Investigator Grant (LCF) através do generoso apoio de doadores para a Universidade da Carolina do Norte em Chapel Hill, e o Departamento de Pediatria da Universidade da Carolina do Norte em Chapel Hill.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
[Leu15]-Gastrin I humanSigma-AldrichG9145
A 83-01Sigma-AldrichSML0788
Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12Gibco12634010
B-27 Supplement, serum free (50x)Gibco17504044
Basic Bio-kitEmulateN/A
BioTek Synergy 2 Multi-Mode Microplate ReaderAgilent 7131000
BRAND Methacrylate (PMMA) Cuvettes, Semi-MicroBrandTech759085D
Cell Recovery SolutionCorning354270
CFX Opus Real-Time PCR SystemsBio-Rad12011319
Chip CradleEmulateN/A
Chip-S1 Stretchable ChipEmulateN/A
CHIR99021Sigma-AldrichSML1046
Clear TC-treated Multiple Well Plates,  48 well Corning3548
Collagen from human placentaSigma-AldrichC5533
Collagenase, Type I, powderGibco17018029
Complete Human Endothelial Cell Medium with Kit Cell BiologicsH-1168
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 15 mLFisher Scientific05-539-12
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 50mLFisher Scientific05-539-8
Countess Cell Counting Chamber SlidesInvitrogen C10283
Countess II automated cell counterInvitrogen AMQAX1000
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)InvitrogenD3571
DAPTSigma-AldrichD5942
Dextran, Cascade Blue, 3000 MW, Anionic, Lysine FixableInvitrogen D7132Permeability dye 
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD8418
Disposable PES Filter Units, 0.2um aPES membraneFisher ScientificFB12566504
DMEM/F-12Gibco11320033
Donkey serumSigma-AldrichD9663
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium - high glucoseSigma-AldrichD5796
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (DPBS)Gibco14190-136
EDTA, 0.5 M,  pH 8.0Corning46-034-CI
ER-1 surface activation reagentEmulateER-1Chip Activation Reagent 1
ER-2 surface activation reagent EmulateER-2Chip Activation Reagent 2
Fibronectin Human Protein, PlasmaGibco33016015
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid, 100mmFisher ScientificFB0875713
Gelatin-Based Coating Solution Cell Biologics6950
Genie Temp-Shaker 300Scientific Industries, Inc.SI-G300
Gentamicin Gibco15750060
HEPES, Liquid 1M Solution (238.3 mg/ mL)Corning25-060-CI
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate InvitrogenH3570
Human Collagen Type ISigma-AldrichCC050
Human Primary Small Intestinal Microvascular Endothelial CellsCell BiologicsH-6054
Inverted MicroscopeFisher Scientific03-000-013
Isotemp General Purpose Deluxe Water BathsFisher ScientificFSGPD10
L-Glutamine Gibco25030-081
Luria Broth (LB) agar, MillerSupelcoL3027
L-WRN Cells American Type Culture CollectionCRL-3276
Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, LDEV-free Corning356231Cell Culture Matrix
N-2 Supplement (100x)Gibco17502048
N-acetyl-L-cysteineSigma-Aldrich1009005
NAILSTAR UV LAMPNailStarNS-01-US
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis SpectrophotometerThermo Scientific840-274200
NicotinamideSigma-Aldrich72340
Orb-HM1 Hub ModuleEmulateN/A
ParaformaldehydeThermoFisher047392.9L
Penicillin-Streptomycin Gibco15140122
Phosphate buffered saline (PBS)Gibco10010023
Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+Rainin17013805
Pipette Tips TR LTS 1000µL S 768A/8Rainin17014966
Pod Portable ModuleEmulateN/A
Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS)(Heat Inactivated) Avantor Seradigm1500-500
QuantiTect Reverse Transcription Kit QIAGEN205313
Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF)PeproTech315-09
SB 431542Tocris1614
Square BioAssay Dish with Handles, not TC-treated Corning431111
SsoAdvanced Universal SYBR Green SupermixBio-Rad1725271
Steriflip-GV Sterile Centrifuge Tube Top Filter UnitMilliporeSE1M179M6
Sterile Cell Strainers, 70umFisher Scientific22-363-548
Sterile Syringes, 10mLFisher Scientific14-955-453
Straight, fine, sharp point scissorsMiltex InstrumentsMH5-300
Thermo Scientific Sorvall X4R Pro-MD CentrifugeThermo Scientific75016052
Triton X-100 Sigma-AldrichT8787Detergent
TRIzol Reagent Invitrogen15596026RNA extraction reagent
Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v) in PBS, pH 7.5 ± 0.5Corning25-900-CI
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red Gibco12604013Enzymatic Dissociation Reagent
Trypsin-EDTA solutionSigma-AldrichT4174
VIOS 160i CO2 Incubator, 165 LThermo Scientific13-998-252
Y-27632Tocris1254
Zoë-CM1 Culture ModuleEmulateN/A

Referências

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